Artículo de método

Aislamiento de los mioblastos humanos, evaluación de la diferenciación miogénica y medición de la entrada de calcio almacenada

DOI:

10.3791/55918

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26 de julio de 2017

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1Department of Orthopedic Surgery, Geneva University Hospitals & Faculty of Medicine, 2Department of Basic Neurosciences, Geneva Medical Center, 3Department of Cell Physiology and Metabolism, Geneva Medical Center

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí, describimos una metodología para obtener una población pura de mioblastos humanos a partir de tejido muscular adulto. Estas células se utilizan para estudiar la diferenciación in vitro del músculo esquelético y, en particular, para estudiar las proteínas implicadas en la señalización del Ca 2+ .

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las células satélites (SC) son células madre musculares localizadas entre la membrana plasmática de las fibras musculares y la lámina basal circundante. Son esenciales para la regeneración muscular. Tras la lesión, que se produce con frecuencia en los músculos esqueléticos, SCs se activan. Proliferan como mioblastos y se diferencian para reparar lesiones musculares. Entre los muchos eventos que tienen lugar durante la diferenciación muscular, citosólico Ca 2 + señales son de gran importancia. Estas señales de Ca 2+ surgen de la liberación de Ca2 + desde internas Ca 2 + tiendas, así como de entrada de Ca2 + desde el espacio extracelular, particularmente la entrada de Ca2 + store-operado (SOCE). Este artículo describe una metodología utilizada para obtener una población pura de mioblastos humanos a partir de muestras musculares recogidas después de la cirugía ortopédica. El tejido se digiere mecánica y enzimáticamente y las células se amplifican y luego se clasifican por citometría de flujo de acuerdo con la presencia deFic marcadores de membrana. Una vez obtenidos, los mioblastos humanos se expanden y se comprometen a diferenciarse eliminando factores de crecimiento del medio de cultivo. Los niveles de expresión de los factores de transcripción específicos y la inmunofluorescencia in vitro se utilizan para evaluar el proceso de diferenciación miogénica en condiciones de control y después de silenciar las proteínas implicadas en la señalización de Ca 2 + . Finalmente, detallamos el uso de Fura-2 como una sonda ratiométrica de Ca 2+ que proporciona mediciones confiables y reproducibles de SOCE.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los músculos esqueléticos humanos están compuestos de grupos de fibras musculares contráctiles, multinucleadas, resultantes de la fusión de células precursoras miogénicas. Los músculos esqueléticos tienen la capacidad de regenerarse después de la lesión gracias a la presencia de SC, las células madre del músculo esquelético situadas entre la membrana plasmática de las miofibras (sarcolemma) y la lámina basal. En el músculo no lesionado, los SC están presentes en su mayoría en estado de reposo. En respuesta al estrés mecánico oa la lesión, los SC se activan (mioblastos), proliferan y experimentan diferenciación para formar nuevas miofibras o auto-renovación para reponer el grupo SC 1 , 2 . A lo largo de los años, se desarrollaron varias técnicas para aislar los CS y su progenie, los mioblastos, de las biopsias del músculo esquelético. Con la mayor comprensión de los marcadores de superficie celular expresados ​​en estas células y la metodología de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) 3, 4 , 5 , ahora es posible aislar poblaciones puras de mioblastos humanos a partir de muestras musculares.

La señalización del calcio regula el desarrollo del músculo esquelético, la homeostasis y la regeneración. En particular, la entrada de Ca2 + que se activa después del agotamiento de la tienda intracelular, llamada SOCE, es de gran importancia 6 para estos procesos. Tras la estimulación celular, disminuye el nivel de Ca 2 + en el retículo endo / sarcoplasmático (ER / SR), lo que a su vez activa los canales de Ca 2+ de la membrana plasmática que permiten la entrada de Ca 2+ para rellenar el ER / SR 7 . Las dos principales proteínas implicadas en SOCE son el ER / SR Ca 2 + -sensing stromal interacción molécula 1 (STIM1) de proteínas y la membrana plasmática Ca 2 + canal Orai1. El músculo esquelético expresa abundantemente estas dos proteínas, así como otras proteínas de las mismas familias (STIM2 aNd Orai2-Orai3) 8 , 9 y varios canales permeables al Ca2 + de la familia canónica de potencial transitorio del receptor (TRPC) 10 , 11 , 12 , 13 . Ca 2 + entrada a través de la vía SOCE es de gran importancia para la formación muscular / regeneración [ 14] . Mutaciones de STIM1 o Orai1 proteínas tienen efectos nocivos sobre la función muscular, lo que conduce principalmente a la hipotonía muscular [ 15] . Los modelos animales con deterioro de SOCE también muestran menor masa muscular y fuerza, junto con una mayor fatigabilidad 6 , 16 , 17 . Como se mencionó, otras proteínas STIM y Orai, así como muchos canales TRPC, se expresan en el músculo esquelético, y sus funciones respectivas no se han determinado hasta el momento. GolpeandoSu nivel de expresión, es posible investigar sus implicaciones en SOCE y sus funciones durante la diferenciación del músculo esquelético humano.

La medición de SOCE puede realizarse utilizando dos enfoques diferentes: registros de corriente electrofisiológica y mediciones de Ca 2+ . La electrofisiología es ciertamente un método más directo, ya que mide la corriente de interés y su firma electrofisiológica asociada. Sin embargo, esta técnica es muy difícil de aplicar a las células musculares, principalmente debido al gran tamaño de las células musculares y el pequeño tamaño de la corriente SOCE endógena. La obtención de imágenes de Ca 2+ citosólica es técnicamente muy accesible, pero la medida es más indirecta, ya que el nivel de Ca 2+ medido en el citosol refleja tanto la entrada de Ca 2+ como el re-bombeo fuera de la célula o en los almacenes internos.

Una metodología que incluye el aislamiento de mioblastos a partir de pequeñas piezas de skel humanoEtal después de digestión enzimática, amplificación y FACS se explica en este trabajo. Se describe el proceso de diferenciación muscular y el protocolo de inmunofluorescencia para seguir la expresión de marcadores de diferenciación con el tiempo 18 . Finalmente, se explican las medidas de SOCE y el papel de diferentes canales iónicos en la señalización de Ca 2+ y en la diferenciación del músculo esquelético.

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Protocolo

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Las muestras de músculo humano (tejidos obtenidos de músculos semitendinosos) se recogieron durante la cirugía ortopédica en pacientes sanos como residuos quirúrgicos. Todos los métodos relacionados con el estudio en seres humanos se realizaron de acuerdo con las directrices y reglamentos de las Autoridades Sanitarias Reguladoras suizas y aprobados por la Comisión Cantonal de Ética de la Investigación de las Autoridades Cantonales de Ginebra, Suiza (protocolo CER n ° 12-259) . Se obtuvieron consentimientos informados y escritos de todos los sujetos adultos involucrados en el estudio.

1. Aislamiento de los mioblastos del músculo esquelético humano

  1. Durante todos los procedimientos, mantenga condiciones estériles trabajando bajo una capa de cultivo de tejidos de nivel II y usando medio estéril y tampones estériles.
    Nota: Este procedimiento se puede aplicar a muchos músculos esqueléticos humanos.

2. Protocolo de disociación

  1. Transferir muestras de músculo (2 - 3 g) en un estéril de 6 cmplato.
  2. Lavar las muestras musculares con 5 - 10 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Repetir el lavado.
  3. Retire los tejidos conectivos y adiposos usando tijeras curvas y una abrazadera.
  4. Pesar la muestra muscular (ver paso 2.13) y transferirla a una nueva placa estéril de 6 cm.
  5. Añadir 5 ml de tripsina-EDTA al 0,05%.
  6. Usando tijeras, cortar y picar el tejido muscular en pedazos pequeños (menos de 2 mm).
  7. Usando una pipeta serológica de 10 ml, transfiera el músculo picado a una botella de disociación de 200 ml que contiene una barra magnética. Repita este paso hasta que 90 mL de tripsina-EDTA al 0,05% se hayan transferido con todos los músculos picados a la caja de disociación. Cerrar la botella de disociación e incubar a 37 ° C durante 60 minutos bajo agitación suave.
  8. Retire la botella de disociación del baño de calentamiento y detenga la reacción enzimática añadiendo 10 ml de suero fetal de ternera (FCS, 10% de volumen final) a la botella de disociación. Homogeneizar la mezcla con una pipeta.
  9. DeberesSon dos tubos de 50 ml con un filtro de células de 70 μm en cada uno. Pase la mitad de la suspensión de células a través del filtro de células en cada tubo pipeteando hacia arriba y hacia abajo sobre el filtro hasta que pase la suspensión.
  10. Centrifugar los tubos a 200 xg y 20 ° C durante 5 min; Aspirar y desechar el sobrenadante.
  11. Resuspender las células con 10 ml de medio de crecimiento (GM, Tabla 1 ) y pasar las células a través de un tamiz de células de 40 μm colocado en un tubo de 50 ml. Centrifugar el tubo a 200 xg y 20 ° C durante 5 min; Aspirar y desechar el sobrenadante.
  12. Resuspender las células con 10 ml de GM y centrifugar el tubo a 200 xg y 20 ° C durante 5 min; Aspirar y desechar el sobrenadante.
  13. Resuspender las células con 1 mL de GM y contar las células utilizando una cámara de Neubauer.
    Nota: Por lo general, se debe cosechar un rendimiento de 3 x 10 5 células por g de músculo. El rendimiento se calcula dividiendo el número de células por el peso del músculo biopSy (paso 2.4).
  14. Ponga 2 x 10 5 células en una placa de 6 cm estéril que contiene 4 ml de GM y se incuba a 37 ° C y 7% de CO2. Prepare tantas placas como sea necesario.
  15. Cambie el GM después de 3 días.
    Nota: Las células recién disociadas necesitan tiempo para adherirse a la placa de cultivo. Además, el primer tiempo de duplicación de células miogénicas es de alrededor de 50 - 60 h. Después de la primera división, el tiempo de duplicación es alrededor de 20 h.
  16. Después de 5 - 7 días, cuando las células alcanzan una confluencia del 70-80% (alrededor de 1,5 x 10 6 células / por placa de 6 cm), comienzan la tinción de anticuerpos y la clasificación celular (paso 3).

3. Tinción de anticuerpos y clasificación de células

  1. Después de enjuagar una vez con PBS, incubar las células adherentes (en la placa de 6 cm) con 1 ml de tripsina-EDTA al 0,05% a 37 ° C y 7% de CO 2 durante 3 min (o incubar a 5% de CO 2 ). Detener la reacción mediante la adición de 2 ml de GM y recoger las células en 15 ml de tubo. Después de la centrifugación (200 xg durante 5 min), resUspend las células en 1 ml de GM.
  2. Cuente las células usando una cámara Neubauer.
  3. Realice los siguientes procedimientos en hielo.
    Nota: El procedimiento para establecer la compensación de fluorescencia correcta en el citómetro es esencial y debe ser similar en cualquier citómetro. Los tubos 1 y 2 se usan como controles negativos. Los tubos 3 - 7 se usan para establecer la compensación en el citómetro durante el primer experimento ( Tabla 2 ). La concentración final utilizada para cada anticuerpo y su isotipo correspondiente debe ser la misma (alrededor de 1 μg / 10 6 células).
  4. Despacho 1 x 10 5 células por tubo (tubo de 5 ml) para los tubos 1 - 7 ( Tabla 2 ). Coloque la suspensión celular restante en el tubo 8 para la clasificación celular.
  5. Lavar las células con 1 ml de tampón FACS frío (PBS-5% FCS). Cerrar y centrifugar los tubos a 200 xg y 4 ° C durante 5 min; Aspirar y desechar el sobrenadante.
  6. Añadir 200 μl de tampón FACS por tubo. Añadir anticuerpos alDe acuerdo con la Tabla 2 . Incubar en hielo durante 30 min.
  7. Lavar las células: añadir 1 mL del tampón FACS a cada tubo. Cerrar y centrifugar los tubos a 200 xg y 4 ° C durante 5 min. Aspirar y desechar el sobrenadante. Repita este paso una vez más.
  8. Resuspender las células en 500 μ l de FACS buffer. Cerrar los tubos y mantenerlos en hielo hasta la clasificación celular. Prepare 4 tubos de 1,5 ml, cada uno de los cuales contiene 500 μl de GM, que es necesario para recoger las células durante la clasificación celular. Mantenerlos en hielo.
  9. Clasificar los mioblastos humanos por citometría de flujo ( Figura 1 ). Después de excluir células hematopoyéticas positivas para CD45, separar células CD45-negativas basadas en la expresión de CD56. A continuación, se muestra la población CD56-positiva para CD34, CD144 y CD146 (los mioblastos humanos se definen como células CD56 + / CD146 + / CD45- / CD34- / CD144-). Realizar una pequeña fracción de la población de células clasificadas para verificar la pureza.
  10. Piscina de los tubos que contienen myobla humanosPts en un tubo de 15 mL y lavar una vez añadiendo 5 mL de GM. Centrifugar el tubo a 200 xg y 20 ° C durante 5 min; Aspirar y desechar el sobrenadante.
  11. Resuspender las células en 1 ml de GM y placa de las células en una placa no revestida de 6 cm que contiene 4 ml de GM (2 x 10 5 células por placa). Incubar a 37 ° C y 7% de CO 2 .

4. Mantenimiento celular

  1. Cambiar la mitad del medio de cultivo cada 2 días. Quitar 2 ml de GM de edad de la placa de cultivo y agregar 2 ml de GM.
    Nota: Los mioblastos producen factores de crecimiento que son beneficiosos para las condiciones de cultivo.
  2. Trypsinize las células cuando alcanzan 70 - 80% confluencia para evitar la pre-diferenciación. Después de enjuagar una vez con PBS, incubar las células adherentes (en la placa de 6 cm) con 1 mL de tripsina-EDTA al 0,05% a 37 ° C y 7% de CO 2 durante 3 min. Detener la reacción mediante la adición de 2 ml de GM y recoger las células en un tubo de 15 ml. Después de la centrifugación (200 xg durante 5 min), resusLas células en 1 ml de GM.
  3. Contar las células y preparar placas de 6 cm con 2 x 10 5 células por placa en 4 ml de GM.
  4. Mantener los mioblastos humanos hasta 6 pases o congelarlos en GM que contenga DMSO al 10%, 1 x 106 células por ml. Congele las células en una caja de congelación progresiva (1 ° C / min); Para almacenamiento a largo plazo, coloque las células en nitrógeno líquido.

5. Transfección de Myoblastos Humanos con siRNA

Nota: Los mioblastos se transfectan usando reactivo de transfección comercial dos días antes de la inducción de la diferenciación. El efecto de ARNsi específico contra un gen siempre se compara con el efecto de un ARNsi de control. Los ARNsi son ARN bicatenarios que deben mantenerse en hielo y manipulados con guantes.

  1. Obtener una monocapa confluente de 70 - 80% de mioblastos humanos en una placa de 6 cm (alrededor de 1,5 x 106 células).
    Nota: 5 x 10 5 células por transfección se necesitan para obtener una estafaMonocapa fluida de mioblastos transfectados después de 2 días en GM.
  2. Prepare los cubreobjetos de vidrio (descritos para la imagen de calcio en el paso 7).
  3. GM caliente, tripsina-EDTA al 0,05% y PBS a 37ºC.
  4. Realice todos los pasos siguientes en una campana de cultivo de tejidos de nivel II para mantener la esterilidad.
  5. En un tubo de 1,5 ml, envíe 500 μl de medio de suero reducido, 3 μl de reactivo de transfección y 1 μl de ARNsi a 20 μM. Mezclar suavemente y mantener a temperatura ambiente (RT) durante 15 - 20 min.
  6. Durante este tiempo de incubación, preparar los mioblastos para la transfección. Después de enjuagar una vez con PBS, incubar las células adherentes (en la placa de 6 cm) con 1 mL de tripsina-EDTA al 0,05% a 37 ° C y 7% de CO 2 durante 3 min. Detener la reacción mediante la adición de 2 ml de GM y recoger las células en un tubo de 15 ml. Después de la centrifugación (200 xg durante 5 min), resuspender las células en 1 ml de GM.
  7. Cuente las células usando una cámara Neubauer.
  8. Resuspender 5 x 10 5 célulasEn 200 μl de GM para cada transfección ( es decir, para 2 transfecciones, resuspender en 400 μl).
  9. Añadir 200 μl de la suspensión celular a cada 500 μl de la mezcla de siRNA-transfectante. Pipetar dos veces y dos veces e incubar durante 5 min a RT.
  10. Añadir el 700 μ l (células + siRNA-transfectante) a un plato de 3,5 cm de cultivo que contiene un cubreobjetos de vidrio. Añadir GM para obtener un volumen final de 2 ml.
  11. Después de 24 h a 37 ° C y 7% de CO 2 , sustituir completamente el medio con 2 ml de GM fresco. Después de otras 24 h, está habitualmente presente una monocapa confluente de células transfectadas; Si es así, inducir la diferenciación de los mioblastos sustituyendo el GM por 2 mL de medio de diferenciación (DM, Tabla 1 ).
  12. Realizar experimentos de imágenes de calcio 24 - 48 h después de la inducción de la diferenciación o sobre la proliferación de mioblastos.
    Nota: La inmunofluorescencia suele realizarse 48 h después de la inducción de la diferenciación.

6. ImmUnofluorescence Tinción de marcadores de diferenciación

Nota: La tinción con inmunofluorescencia se realiza después de 48 h en DM, pero también puede realizarse en otros tiempos de diferenciación. Myogenin y MEF2 son proteínas nucleares que sólo se expresan en células diferenciadas (antes de la fusión en miotubos), y su tinción permite la evaluación del proceso de diferenciación. La cadena pesada de miosina (MyHC) sólo se expresa en miotubos y se utiliza para estimar el tamaño del miotubo y el índice de fusión (número de núcleos en miotubos / número total de núcleos).

  1. Después de 48 h en DM, lavar la monocapa confluente de células diferenciadas dos veces con 1 ml de PBS a RT. Haga esto cuidadosamente para evitar desprendimiento de los myotubes.
  2. Fijar las células con 1 mL de paraformaldehído al 4% (PFA) durante 15 minutos a RT. Lavar las células con PBS dos veces, durante 5 min cada una.
  3. Permeabilizar las células con 1 mL de PBS que contiene 0,25% de Triton X-100 durante 45 min y lavar 3 veces con 1 mL de PBS.
  4. BloquearPecific por incubación de las células en PBS suplementado con 0,2% de Tween-10 y 2% de suero de cabra (solución de bloque) durante 30 min a RT.
  5. Preparar anticuerpos primarios diluidos en solución de bloque (600 μL por placa de 3,5 cm).
    Nota: Se utilizan los siguientes anticuerpos primarios: anti-myogenin de ratón (1: 600), anti-MEF2 de conejo (1: 300) y anticuerpo anti-MyHC de ratón (MF20, 1: 1.000). Es posible mezclar en la misma solución de bloqueo, la cadena pesada de anti-miosina de ratón o la anti-miogenina de ratón, con anti-MEF2 de conejo.
  6. Eliminar la solución de bloque y añadir 600 μL de soluciones de anticuerpos primarios por placa de 3,5 cm e incubar durante la noche a 4 ° C en una cámara humidificada.
  7. Lavar las células 3 veces con 1 mL de PBS. Incubar durante 1 hora a RT en una cámara oscura con 600 μl de los anticuerpos secundarios preparados en la solución de bloque, como sigue: Alexa 488 de cabra anti-ratón (1: 1.000), Alexa 546 de cabra anti-conejo (1: 1.000) Y DAPI (1:50, solución madre a 15 μM).
    CAUTION: DAPI es un compuesto tóxico que debe manejarse con guantes.
  8. Aspirar y lavar las células 3 veces con 1 mL de PBS.
  9. Coloque cubreobjetos de vidrio utilizando un medio de montaje de alcohol polivinílico con una solución antifading. Manténgalas a 4 ° C y protegidas de la luz hasta visualizar las células.

7. Imágenes de calcio

  1. Cultivo previo, preparar cubreobjetos de vidrio de 25 mm de diámetro. Coloque los cubreobjetos en etanol al 70% durante 48 h para eliminar la grasa y la suciedad de la superficie, lo que reduce la adherencia celular a la cubreobjetos.
  2. Después de enjuagar los cubrealimentos varias veces con agua, volver a ponerlos en agua y esterilizarlos (esterilizados en autoclave).
  3. Coloque un cubreobjetos por placa de cultivo de 3,5 cm y déjelos secar. Guarde las placas de Petri para experimentos adicionales o utilícelas inmediatamente.
  4. Añadir los mioblastos transfectados (5 - 6 x 10 5 células) al cubreobjetos de vidrio.
    Nota: Los experimentos se realizan 24 - 48 h después de la inducción de differentiatiOn, o en mioblastos proliferantes.
  5. Para realizar la formación de imágenes de Ca 2+ , lavar las células 2 veces con PBS o directamente con el medio utilizado para los experimentos (medio que contiene calcio, Tabla 3 ). Cargar las células con 2 μ M Fura-2 / AM más 1 μ M de ácido plurónico durante unos 30 minutos en la oscuridad a RT.
    Nota: El ácido plurónico ayuda a solubilizar Fura-2. Fura-2 / AM y ácido plurónico se disuelven en el medio que contiene calcio.
  6. Lavar las células dos veces en el mismo medio pero sin Fura-2 / AM y ácido plurónico y dejarlas en la oscuridad durante 10-15 minutos adicionales para permitir la desesterificación de Fura-2 / AM.
  7. Si la eficiencia de carga de Fura-2 es demasiado baja, agregue más Fura-2 ( por ejemplo, 4 μM) y / o incube las células durante más tiempo ( por ejemplo, 40 minutos).
  8. Retire el cubreobjetos de la placa de cultivo e instálelo en la cámara experimental. Añadir ~ 1 ml de medio que contiene calcio (dependiendo del volumen del experiCámara mental). Instálelo en la etapa del microscopio e inicie la grabación.
    Nota: La sonda fluorescente sensible al Ca2 + Fura-2 se excita alternativamente a 340 nm y 380 nm, y la luz de emisión se recoge a 510 nm. Como las fluctuaciones de la concentración de Ca2 + son relativamente lentas, adquieran una relación cada 2 s.
  9. Para activar SOCE, se utiliza el siguiente protocolo clásico de reabsorción de tapsigargina / Ca 2+ : dejar las células durante 2-3 min en medio que contiene calcio. Reemplace el medio con medio libre de calcio durante 1-2 min.
    1. Añadir 1 μ M thapsigargin para agotar los almacenes internos de calcio.
      Nota: La tapsigargina es un bloqueador irreversible de la actividad de la bomba de Ca2 + ATPasa del retículo sarco-endoplásmico (SERCA). Después de 8-10 minutos, reemplace rápidamente el medio con el medio que contiene calcio. Ca 2 + entrará en las células a través de los canales SOCE. Espere alrededor de 5 minutos antes de terminar los experimentos.
      PRECAUCIÓN: Thapsigargin es un compuesto tóxico que debe ser manipulado con guantes.

8. Ca 2+ Análisis de Medición

Nota: Realice el análisis con el software de adquisición.

  1. Abra el experimento. Dibuje la región 1 en un área donde no hay células (región de fondo) y dibuje las otras regiones en el citoplasma de las células a analizar (las regiones se pueden dibujar en cualquier imagen: el 340-nm, el 380-nm, O la relación imagen). Vaya a "Ejecutar experimentos"> "Imágenes de referencia". Bajo los canales 340 y 380, seleccione "región 1" y luego haga clic en "Restar fondo".
  2. Ejecute todo el experimento (F4: adelante) para asegurarse de que nada interfiera con la región de fondo, como una mancha de polvo fluorescente que viaja a través de la región de fondo y que las celdas no se mueven durante el tiempo de los experimentos.
    Nota: Las regiones de interés seleccionadasNo debe incluir áreas oscuras; De lo contrario, el valor de la relación será ruidoso, ya que parte del fondo se incluirá en la medición.
  3. Haga clic en "Registrar datos" y vuelva a reproducir todo el experimento.
    Nota: Esto abrirá una hoja de cálculo en la que se registrará el tiempo y la relación. También es posible guardar las longitudes de onda individuales de 340 nm y 380 nm.
  4. Para obtener información sobre el SOCE, extraiga los dos parámetros importantes del experimento: la amplitud de la re-adición de Ca 2+ y la pendiente de la fase de entrada del Ca 2+ ( Figura 3 ).
  5. Obtener la amplitud restando el valor de la relación justo antes de la re-adición de Ca 2+ de la amplitud máxima de la elevación de Ca 2+ . Obtener la pendiente máxima ajustando una regresión lineal de los primeros segundos después de la re-adición de Ca 2+ .
    Nota: El área bajo la curva de la respuesta thapsigargin es también un parámetro informativo para extracT, ya que refleja la cantidad de calcio libre almacenado en el SR.

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Resultados

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Después de la disociación enzimática de una muestra de músculo humano, las células se amplificaron en GM. Los mioblastos humanos, definidos como células CD56 + / CD146 + / CD45- / CD34- / CD144-, se obtuvieron después de FACS. Los mioblastos representaron más del 60% de la población analizada ( Figura 1 ). Los mioblastos humanos primarios fueron repoblados, crecidos hasta confluencia, y cultivados en DM durante 48 h. Después de la inmunotinción para la expresión del factor de transcripción ...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El aislamiento y cultivo de mioblastos humanos a partir del músculo esquelético adulto ofrece un modelo in vitro para estudiar la diferenciación muscular y la regeneración muscular. En este artículo, proporcionamos un protocolo que permite la purificación de altos rendimientos de mioblastos humanos de una manera simple y costo-limitada. Además, esta técnica proporciona resultados fiables y reproducibles en términos de porcentaje de mioblastos aislados y su eficacia de diferencia...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen intereses financieros en competencia.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo contó con el apoyo de la Fundación Nacional Suiza para la Ciencia (subsidio número 310030-166313), la Fondation Suisse pour la recherche sur les maladies musculaires, la Fondation Marcel Levaillant y la Fondation pour la recherche ostéo-articulaire.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Jamón' s F10ThermoFisher Scientific31550-023
FCSThermoFisher Scientific10270-106Lote 41G5532K
BSASigmaO5482
fetuinSigmaF3385
EGF Corning 354001
DexametanonaSigmaD1756
InsulinaSigmaI9278
CreatinaSigma27900
PiruvatoSigmaP4562
UridinaSigmaU3003
GentamicinaThermoFisher Scientific15710-049
Tripsina-EDTA 0,05%ThermoFisher Scientific25300-062
70 μ m filtro de celdasFalcon352350
40 μ m filtro de celdasFalcon352340
Falcon 50  mL tuboFalcon352070
Falcon 15  tubo mLFalcon352096
Falcon 5  Tubo mL (FACS)Falcon352058
Medio de cultivo: OPTI-MEMThermoFisher Scientific31985-047
Filtro de transfectancia: RNAiMaxThermoFisher Scientific1756064
PBSThermoFisher Scientific14190-094
Medio de montajeFluka10981
Ratón anti-MyHC *DSHBMF20 concentrar
Ratón anti-miogeninaBD Pharmigen556358
Conejo anti-MEF2Santa Cruz BiotechC-21
Cabra anti-ratón Alexa488ThermoFisher ScientificA11029
Cabra anti-conejo Alexa 546ThermoFisher ScientificA11035
Ratón anti humano CD56-Alexa488BD Pharmingen557699
Ratón anti humano CD146-PECy7BD Pharmingen562135
Ratón anti humano CD45-PE-CF594BD Pharmingen562279
Ratón anti humano CD34-APCBD Pharmingen345804
Ratón anti humano CD144-PEBD Pharmingen560410
Alexa Fluor 488 ratón IgG1kBD Pharmingen557702
Ratón PECy7 IgG1kBD Pharmingen557872
ratón PE-CF594 IgG1kBD Pharmingen562292
ratón APC IgG1kBD Pharmingen550854
ratón PE IgG1kBD Pharmingen556650
DAPISigmaD9542ATENCIÓN:  compuesto tóxico
ParaformaldehídoFluka762400
Fura-2 AMThermoFisher ScientificF1201
Pluronic F-127ThermoFisher ScientificP3000MP
ThapsigarginSigmaT9033PRECAUCIÓN: compuesto tóxico 
Software de adquisición de imágenes de relación: Metafluor 6.3Molecular Device
* : MF 20 fue depositado en el DSHB por Fischman, D.A. 

Referencias

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