Localización de Genes Receptor Odorante en Antenas Locustinas por RNA In Situ Hibridación

Summary

Este artículo describe un protocolo de hibridación in situ detallado y altamente eficaz, especialmente para los genes de receptores Odorantes expresados ​​de bajo nivel (OR), así como otros genes, en antenas de insectos usando sondas marcadas con biotina o marcadas con digoxigenina (DIG).

Abstract

Los insectos han desarrollado sofisticados sistemas de recepción olfativa para detectar señales químicas exógenas. Estas señales químicas son transducidas por neuronas receptoras olfativas (ORN) alojadas en estructuras similares a los cabellos, llamadas chemosensilla, de las antenas. En las membranas de los ORN, se cree que los receptores de olor (OR) están implicados en la codificación de los olores. Por lo tanto, ser capaz de identificar genes localizados a los ORNs es necesario para reconocer los genes OR, y proporciona una base fundamental para la posterior funcional in situ estudios. Los niveles de expresión de ARN específicos de ORs en las antenas de insectos son muy bajos, y preservar el tejido de insectos para la histología es un reto. Por lo tanto, es difícil localizar un OR a un tipo específico de sensilla utilizando ARN hibridación in situ. En este artículo, se introduce un detallado y altamente eficaz ARN in situ protocolo de hibridación en particular para los genes O poco expresados ​​de insectos. Además, un OR específico Gene waS identificados mediante la realización de dos experimentos de hibridación fluorescente in situ utilizando un gen del receptor coexpresor, Orco , como marcador.

Introduction

Las antenas de insectos, que son los órganos chemosensoriales más importantes, están cubiertas con muchas estructuras similares a los cabellos - llamadas sensilla - que son inervadas por las Neuronas Receptoras Olfativas (ORNs). En la membrana de los ORNs de insectos, los receptores de olor (OR), un tipo de proteína que contiene siete dominios transmembrana, se expresan con un coreceptor (ORco) para formar un heterómero que funciona como un canal iónico odorante ^{1 , 2 , 3} . Diferentes RUP responden a diferentes combinaciones de compuestos químicos ⁴ <....

Protocol

NOTA: Para limitar la degradación del ARN, preparar soluciones usando agua destilada en autoclave húmedo (a 121 ° C durante 60 min) y también materiales de autoclave en húmedo.

1. Preparación de sondas antisentido y sensorial de ARN ISH

1. Amplificación y purificación de genes diana
   1. En primer lugar, se produce un fragmento de doble cadena de 387 pb de L. migratoria OR1 ( LmigOR1 , GenBank: JQ766965) del plásmido que contiene el ADNc de longitud completa de LmigOR1 con una ADN polimerasa Taq que añade adeninas a ambos extremos de los fragmentos.
      1. Utilizar un volu....

Results

Con la detección cromogénica, un pequeño subconjunto de las células de la antena en cada sección de la antena de adultos se denota por DIG-etiquetados LmigOR1 y LmigOR2 antisentido sondas ( Figura 3 ]. RNA ISH en secciones consecutivas para localizar LmigOR1 y LmigOR2 mostró que las células antenales que expresan los dos genes se localizaron en ORN clusters que expresan LmigORco , lo que indica que el sup.......

Discussion

Es difícil realizar ARN ISH para localizar los genes OR en las antenas de insectos porque los niveles de expresión de los genes OR, excepto ORco , son muy bajos y preservar cortes histológicos de antenas de insectos es muy difícil. Además, la detección de TSA es también muy difícil. Para abordar estos problemas, deben tomarse las siguientes medidas. Las antenas se seleccionan de las langostas adultas de nueva mutación que tienen cutículas antenales finas y suaves, que mantienen su morfología en la diapositiva. .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materiales
2&veces; TSINGKETM Mezcla Maestra	TSINGKE, China	TSE004
Libre de RNasa H2O	TIANGEN, China	RT121-02
REGULAR AGAROSE G-10	BIOWEST, ESPAÑA	91622
Tampón de unión	TIANgel Midi Kit de purificación, TIANGEN, China	DP209-02
Tampón de equilibrio	TIANgel Kit de purificación Midi, TIANGEN, China	DP209-02
Solución de lavado	TIANgel Midi Kit de purificación, TIANGEN, China	DP209-02
T Vector	Promega, EE. UU	A362A
T4 ADN ligasa	Promega, EE. UU	M180A
Escherichia coli< / em> DH5 y alfa;	TIANGEN, China	CB101
Ampicilina	Sigma, EE. UU.	A-6140
Isopropilo β-D-1-tiogalactopiranósido	Inalco, EE. UU	1758-1400
5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido	SBS Genetech, China	GX1-500
Nco I	BioLabs, Nueva Inglaterra	R0193S
Spe I	BioLabs, Nueva Inglaterra	R0133M Kit de etiquetado de ARN
	DIG Roche, Suiza	11175025910
Kit de etiquetado de ARN de biotina	Roche, Suiza	11685597910
Kit de etiquetado de ARN DIG	DNasa,	11175025910
LiCl	Sinopharm, China	10012718
Etanol	Sinopharm, China	10009257
Ácido acético	BEIJING CHEMICAL REGENTS COMPANY, China	10000292
Compuesto Tissue-Tek O.C.T.	Sakura Finetek Europe, Zoeterwoude, Países Bajos	4583
Portaobjetos	TINA JIN HAO YANG BIOLOGCAL MANUFACTURE CO., LTE, China	FISH0010
HCl	Sinopharm, China	80070591
Millex	Millipore, EE. UU.	SLGP033RS
Tween 20	AMRESCO, EE. UU.	0777-500ML
Nitroblue cloruro de tetrazolio / 5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato sal de toluidina	Roche, Suiza	11175041910
Glycerol	Sinopharm, China	10010618
Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comments
>Solutions
1× Tris-acetato-EDTA	Sigma, EE. UU.	V900483-1KG	0.04 mol / L Tris-Base
1&veces; Tris-acetato-EDTA	BEIJING CHEMICAL REGENTS COMPANY, China	10000292	0.12% ácido acético
1× Tris-acetato-EDTA	Sigma, EE. UU.	03677	Sal disódica de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)
Medio líquido Luria-Bertani (LB)	Sinopharm, China	10019392	10 g/L NaCl
Luria-Bertani (LB) medio líquido	MERCK, Alemania		VM335231 10 g/L Peptona de caseína (Triptona)
Luria-Bertani (LB) medio líquido	MERCK, Alemania	VM361526	5 g/L Extracto de levadura
Placa de sustrato sólido LB	Sinopharm, China	10019392	10 g/L NaCl
Placa de sustrato sólido LB	MERCK, Alemania		VM335231 10 g/L Peptona de caseína (Tryptone)
Placa de sustrato sólido LB	MERCK, Alemania	VM361526	5 g/L Extracto de levadura Placa
sustrato sólido LB	WISENT ING, Canadá	800-010-CG	Agar de 15 g/L de grado bacteriológico
10 veces; solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7.1)	Sinopharm, China	10019392	8.5% NaCl
10 veces; Solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7.1)	Sigma, EE. UU	V900041-500G	14 mM KH2PO4
10&veces; Solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7.1)	Sigma, EE. UU	V900268-500G	80 mM Na2HPO4
10× Solución salina tamponada Tris (TBS, pH 7.5)	Sigma, EE. UU	V900483-1KG	1 M Tris-Base
10× Solución salina tamponada con tris (TBS, pH 7,5)	Sinopharm, China	10019392	1,5 m
tampón de detección de NaCl (DAP)           detección cromogénica pH 9.5            Detección TSA pH 8.0	Sigma, EE. UU.	V900483-1KG	100 mM Tampón de detección Tris-Base
(DAP)           detección cromogénica pH 9.5            Detección TSA pH 8.0	Sinopharm, China	10019392	100 mM
de NaCl Tampón de detección (DAP)           detección cromogénica pH 9.5            Detección TSA pH 8.0	Sigma, EE. UU.	V900020-500G	50 mM MgCl2· 6H2O
20 veces; citrato de sodio salino (pH 7.0)	Sinopharm, China	10019392	3 M NaCl
20 veces; solución salina-citrato de sodio (pH 7.0)	Sigma, EE. UU	V900095-500G	0.3 M Solución
de paraformaldehído de Na-Citrato al 4% (PFA, pH 9.5)	Sigma, EE. UU	V900894-100G	4% tampón de
carbonato de sodio	Sigma, EE. UU	V900182-500G	0.1 M NaHCO3
Tampón de carbonato de sodio (pH 10.2)	Sigma, EE. UU	V900182-500G	80 mM NaHCO3
carbonato de sodio (pH 10.2)	Sigma, EE. UU	S7795-500G	120 mM Na2< / sub>CO3< / sub>
Solución de formamida (pH 10.2)	MPBIO, EE. UU	FORMD002	50% de formamida desionizada
Solución de formamida (pH 10.2)			5× tampón de bloqueo de citrato de sodio y solución salina
en TBS	Roche, Suiza	11175041910	1%
Tampón de bloqueo de transferencia en TBS	AMRESCO, EE. UU	0694-500ML	0.03% Triton X-100
Tampón de bloqueo en TBS			1× Solución salina tamponada Tris
Solución alcalina de fosfatasa Solución	Roche, Suiza	11175041910	1,5 U/mL anticuerpo conjugado anti-digoxigenina fosfatasa alcalina
		fosfatasa alcalina	Tampón bloqueante en TBS
Solución de fosfatasa alcalina / peroxidasa de rábano picante	Roche, Suiza	11175041910	1,5 U/mL de fosfatasa alcalina antidigoxigenina conjugada anticuerpo
Solución de fosfatasa alcalina/peroxidasa de rábano picante	Kit TSA, Perkin Elmer, EE. UU.	NEL701A001KT 1	% anti-biotina estreptavidina peroxidasa de rábano picante- anticuerpo conjugado
		fosfatasa alcalina/peroxidasa de rábano picante	Tampón de bloqueo en
tampón de hibridación	MBIO, EE. UU	. FORMD002	50% de hibridación de formamida desionizada
Búfer			2&veces; citrato de
sodio salino Tampón de hibridación	Sigma, EE. UU.	D8906-50G	10% sulfato de dextrano
Tampón de hibridación	invitrogen, EE. UU	AM7119	20 y micro; g/mL de levadura t-ARN Tampón
hibridación	Sigma, EE. UU.	D3159-10G	0,2 mg/mL ADN de esperma de arenque
2-hidroxi-3-ácido naftoico-2'-fenilanilida fosfato/4-cloro-2-metilbencendiazionio hemi-zinc cloruro de policiano sustrato de sal Roche	, Suiza	11758888001	1% de ácido 2-hidroxi-3-naftoico-2'-fenilanilida fosfato (10 mg/mL)
Sustrato de sal de cloruro de hemizinc de hemi-zinc de ácido 2-hidroxi-3-naftoico-2'-fenilanilácido de 4-cloro-2-metilbencenodiazonio	, Suiza	11758888001	1% de sal de cloruro de hemi-zinc de 4-cloro-2-metilbencenodiazonio (25 mg/mL)
Ácido 2-hidroxi-3-naftoico-2'-fenilanilida fosfato/4-cloro-2-metilbencenodiazonio hemi-zinc sustrato de sal			Tampón
de detección Señal de tiramida sustrato de amplificación	TSA kit, Perkin Elmer, EE. UU.	NEL701A001KT	% de fluoresceína-tiramidas
Sustrato de amplificación de señal de tiramida	Kit TSA, Perkin Elmer, EE. UU		NEL701A001KT Diluyente de amplificación
Name	Company	Número de catálogo	Comments
Instrument
Freezing microtomo	Leica, Nussloch, Alemania	criostato
	Thermo SCIENTIFIC, EE. UU	NANODROP 2000
Microscopio óptico	Olympus, Tokio, Japón	Microscopio Olympus IX71 Microscopio
confocal	Olympus, Tokio, Japón	Olympus BX45 Microscopio