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Artículo de método

Localización de Genes Receptor Odorante en Antenas Locustinas por RNA

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DOI:

10.3791/55924

⸱

13 de julio de 2017

 ,  , 
1Department of Entomology, China Agricultural University, 2Bio-tech Research Center, Shandong Academy of Agricultural Sciences

En este artículo

Resumen

Este artículo describe un protocolo de hibridación in situ detallado y altamente eficaz, especialmente para los genes de receptores Odorantes expresados ​​de bajo nivel (OR), así como otros genes, en antenas de insectos usando sondas marcadas con biotina o marcadas con digoxigenina (DIG).

Resumen

Los insectos han desarrollado sofisticados sistemas de recepción olfativa para detectar señales químicas exógenas. Estas señales químicas son transducidas por neuronas receptoras olfativas (ORN) alojadas en estructuras similares a los cabellos, llamadas chemosensilla, de las antenas. En las membranas de los ORN, se cree que los receptores de olor (OR) están implicados en la codificación de los olores. Por lo tanto, ser capaz de identificar genes localizados a los ORNs es necesario para reconocer los genes OR, y proporciona una base fundamental para la posterior funcional in situ estudios. Los niveles de expresión de ARN específicos de ORs en las antenas de insectos son muy bajos, y preservar el tejido de insectos para la histología es un reto. Por lo tanto, es difícil localizar un OR a un tipo específico de sensilla utilizando ARN hibridación in situ. En este artículo, se introduce un detallado y altamente eficaz ARN in situ protocolo de hibridación en particular para los genes O poco expresados ​​de insectos. Además, un OR específico Gene waS identificados mediante la realización de dos experimentos de hibridación fluorescente in situ utilizando un gen del receptor coexpresor, Orco , como marcador.

Introducción

Las antenas de insectos, que son los órganos chemosensoriales más importantes, están cubiertas con muchas estructuras similares a los cabellos - llamadas sensilla - que son inervadas por las Neuronas Receptoras Olfativas (ORNs). En la membrana de los ORNs de insectos, los receptores de olor (OR), un tipo de proteína que contiene siete dominios transmembrana, se expresan con un coreceptor (ORco) para formar un heterómero que funciona como un canal iónico odorante 1 , 2 , 3 . Diferentes RUP responden a diferentes combinaciones de compuestos químicos 4 , 5 , 6 .

Las langostas ( Locusta migratoria ) se basan principalmente en señales olfativas para desencadenar comportamientos importantes 7 . Las ER de langostas son factores clave para la comprensión de los mecanismos olfatorios moleculares. Localización de un gen específico de la langosta OR en la neurona de un genMorfológicamente específico sensillum tipo por RNA In Situ Hybridization (RNA ISH) es el primer paso en la exploración de la función de las RUP.

El ARN ISH utiliza una sonda de ARN complementario marcada para medir y localizar una secuencia de ARN específica en una sección de tejido, células o montajes enteros in situ , proporcionando información sobre los procesos fisiológicos y la patogénesis de la enfermedad. Las sondas de ARN marcadas con digoxigenina (marcadas con DIG) y marcadas con biotina se han usado ampliamente en la hibridación de ARN. El marcado de ARN con digoxigenina-11-UTP o biotina-16-UTP puede prepararse mediante transcripción in vitro con ARN polimerasas SP6 y T7. Las sondas de ARN marcadas con DIG y biotina tienen las siguientes ventajas: no radiactivas; seguro; estable; altamente sensible; Altamente específicos; Y fácil de producir utilizando PCR y transcripción in vitro . Las sondas de ARN marcadas con DIG y biotina pueden ser detectadas cromogénicamente y fluorescentemente. Las sondas de ARN marcadas con DIG pueden detectarse con Alkali anti-digoxigeninaNe Se pueden visualizar anticuerpos conjugados con fosfatasa (AP) que pueden visualizarse con los sustratos quimioluminiscentes altamente sensibles cloruro de tetrazolio / sal de toluidina de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato (NBT / BCIP) usando un microscopio óptico o con 2 -hidroxi-3-naftoico (HNPP) acoplado con sal de cloruro de hemi-zinc de 4-cloro-2-metilbencenodiazonio (Fast Red) usando un microscopio confocal. Las sondas de ARN marcadas con biotina se pueden detectar con anticuerpos conjugados con anti-biotina streptavidina de rata de caballo peroxidasa (HRP) que se pueden visualizar con fluoresceína-tiramidas usando un microscopio confocal. De este modo, la hibridación in situ fluorescente de doble color puede realizarse para detectar dos genes diana en una rebanada usando sondas de ARN marcadas con DIG y biotina.

El ARN ISH con sondas marcadas con DIG y / o biotina se ha utilizado con éxito para localizar genes relacionados con el olfato, tales como OR , receptor ionotrópico, proteína de unión al odoranteY la proteína de membrana de la neurona sensorial, en antenas de insectos de, pero sin limitarse a, Drosophila melanogaster , Anopheles gambiae , L. migratoria y la langosta del desierto Schistocera gregaria 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 . Sin embargo, existen dos desafíos sustanciales al realizar RNA ISH para OR de insectos: (1) OR genes (excepto ORco ) se expresan en niveles bajos y sólo en unas pocas células, dificultando la detección de señales y (2) preservando tejido de insecto para Histología, de modo que la morfología se conserva y el ruido de fondo es bajo, puede ser un reto. En este artículo un protocolo detallado y eficaz que describe el ARN ISH para la localización de genes OR en insectosAntenas, incluyendo tanto la detección cromogénica como la de Tyramide Signal Amplification (TSA).

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Protocolo

NOTA: Para limitar la degradación del ARN, preparar soluciones usando agua destilada en autoclave húmedo (a 121 ° C durante 60 min) y también materiales de autoclave en húmedo.

1. Preparación de sondas antisentido y sensorial de ARN ISH

  1. Amplificación y purificación de genes diana
    1. En primer lugar, se produce un fragmento de doble cadena de 387 pb de L. migratoria OR1 ( LmigOR1 , GenBank: JQ766965) del plásmido que contiene el ADNc de longitud completa de LmigOR1 con una ADN polimerasa Taq que añade adeninas a ambos extremos de los fragmentos.
      1. Utilizar un volumen de reacción final de 100 mu l que contenga 50 mu l de mezcla de reacción 2x, 4 mu l de cebadores sentido y antisentido ( Tabla 1 ), 1 mu l de molde de plásmido y 41 mu l de H 2 O libre de RNasa. Protocolo: 94ºC durante 5 min, seguido de 30 ciclos de 94ºC durante 30 s, 55ºC durante 30 s y 72ºC durante 1 min, Seguido de 72 ° C durante 10 min.
      2. Repita estos pasos para producir el fragmento de doble hebra de 1,303 pb de LmigOR2 (GenBank: JQ766966) y fragmento de doble hebra de 1,251 pb de LmigORco (GenBank: JN989549). Los cebadores utilizados en estos experimentos se presentan en la Tabla 1 .
      3. Ejecutar productos de PCR en geles de agarosa al 1,2% en 1x tampón Tris-acetato-EDTA y visualizar usando tinción con bromuro de etidio.
    2. Extraer estos productos de PCR utilizando un kit de extracción de gel.
      1. Después de la electroforesis, extirpar las bandas de ADN del gel y colocar las rodajas de gel en un tubo de 1,5 ml. A continuación, añadir 100 μl de tampón de unión (tampón PN) por 0,1 g de rebanada de gel. Vórtice e incube a 50 ° C hasta que la rebanada de gel se disuelva completamente.
      2. Insertar una columna de adsorción de CA2 en el tubo de recogida y añadir 500 μl de tampón de equilibrio (tampón BL). Esto mejora la capacidad de absorción y la estabilidad de la membrana de sílice. CentriFuge a 12.400 xg durante 1 min.
      3. Transferir la mezcla de gel disuelto al conjunto de columna de adsorción e incubar a temperatura ambiente durante 2 min. A continuación, centrifugar los tubos a 12.400 xg durante 1 min. Deseche el flujo y vuelva a insertar la columna de adsorción en el tubo de recogida.
      4. Añadir 600 μL de solución de lavado (etanol añadido, Buffer PW) dos veces. Centrifugar a 12.400 xg durante 1 min. Deseche el flujo y vuelva a insertar la columna de adsorción en el tubo de recogida.
      5. Vaciar el tubo de recogida y recentrifugar el conjunto de la columna a 12.400 xg durante 2 min para permitir la evaporación de cualquier etanol residual.
      6. Transfiera cuidadosamente la columna de adsorción a un tubo de centrífuga limpio de 1,5 ml. Secar al aire el gránulo durante 5-10 minutos y redisolver el ADN en un volumen adecuado ( por ejemplo, 30 μl) de agua libre de nucleasa.
      7. Incubar a TA durante 2 min. Centrifugar a 12.400 xg durante 2 min. Desechar la columna de adsorción y almacenar el ADN a 4 ° C o -20 ° C.
  2. Construir los plásmidos recombinantes
    1. Individualmente ligar el fragmento de 387 pb de LmigOR1, 1303 bp fragmento de LmigOR2 y 1251 bp fragmento de LmigORco en un vector de T que contiene promotores para la T7 (aguas arriba) y ARN polimerasas SP6 (aguas abajo) adyacente al DNA insertado utilizando ADN ligasa de T4. Preparar la siguiente reacción de 10 μl: 5 μl de tampón de ligación 2x, 1 μl de vector T, 3 μL (~100 ng) del ADN del gen insertado y 1 μl de ADN ligasa T4 e incubar O / N a 4 ° C.
    2. Añadir 5 μl de cada plásmido recombinante que contiene el fragmento de 387 pb de LmigOR1 , fragmento de 1.303 pb de LmigOR2 y 1.251 pb de LmigORco por separado en 50 μl de células competentes de Escherichia coli DH5α en tubos estériles de 1,5 mL.
      1. Mezclar suavemente y poner los tubos en hielo durante 30 min y luego incubarlos durante 90 s a 42DO. Vuelva a colocarlos en hielo durante 3 min.
      2. Añadir 450 μl de medio líquido Luria-Bertani (LB) sin ampicilina a cada tubo e incubarlos en un agitador a 150 rpm durante 1 h a 37 ° C para restaurar el E. coli DH5α.
      3. Tomar una alícuota de 100 μl de cada transformante y usarlos para inocular placas de sustrato sólido LB que contengan ampicilina 50 μg / ml, β-D-1-tiogalactopiranósido isopropílico (IPTG) de 24 μg / mL y 40 μg / mL de 5-bromo-4 - cloro - 3 - indolil - beta - D - galactopiranósido (X - gal).
      4. Incubar estas placas en una incubadora constante a 37 ° C durante 18 h. Se tamizan los plásmidos recombinantes diana usando el método de cribado azul-blanco. Secuencia de los plásmidos recombinantes diana utilizando la secuenciación de Sanger e identificar las tres OR direcciones de los insertos de los genes.
  3. Seleccionar endonucleasas de restricción para linealizar plásmidos recombinantes
    1. Utilizar endonucleasas de restricción tNo sólo digieren en el sitio de clonación múltiple del vector, sino que tampoco cortan el ADN del inserto. En este experimento, todos los 3 genes se insertan en el vector T en la dirección correspondiente a la del vector.
    2. Utilizar endonucleasa de restricción Nco I para linealizar los plásmidos recombinantes que contienen el fragmento de 387 pb de LmigOR1 , fragmento de 1.303 pb de LmigOR2 y fragmento de 1.251 pb de LmigORco para producir las sondas antisentido. Utilice la endonucleasa de restricción Sp e I para producir las sondas de detección.
      NOTA: Si la dirección de la inserción corresponde a la del vector, entonces se selecciona un sitio de restricción único desde el extremo de T7 para linealizar el plásmido recombinante y se utiliza ARN polimerasa SP6 para preparar la sonda antisentido. Se selecciona un sitio de restricción único desde el extremo de SP6 para linealizar el plásmido recombinante, y se usa la ARN polimerasa de T7 para preparar la sonda de detección. De lo contrario, si la dirección del inserto no corresponde a tLa dirección del vector, entonces se selecciona un único sitio de restricción desde el extremo de SP6 para linealizar el plásmido recombinante y se usa RNA polimerasa de T7 para preparar la sonda antisentido. El único sitio de restricción desde el extremo de T7 se selecciona para linealizar el plásmido recombinante, y la ARN polimerasa SP6 se ​​usa para preparar la sonda de detección.
  4. Purificación de los plásmidos recombinantes linealizados
    1. Digerir 20 μg de cada uno de los tres plásmidos recombinantes que contienen el fragmento de 387 pb de LmigOR1 , fragmento de 1.303 pb de LmigOR2 y fragmento de 1.251 pb de LmigORco usando la endonucleasa de restricción Nco I en una reacción de 100 μL que contiene 10 μl de tampón 10x, 40 μl de 0,5 mu g / mu l de plásmido, 3 mu l de Nco I y 47 mu l de H _ { 2} O libre de RNasa, seguido de una incubación de 3 h a 37ºC.
    2. De forma similar, digerir 20 μg de cada uno de estos tres plásmidos recombinantes uCantar la endonucleasa de restricción Spe I.
    3. Purificar estos plásmidos digeridos usando un kit de extracción en gel como se describe en 1.1.2. Determine las concentraciones de estos plásmidos recombinantes linealizados extraídos mediante espectrofotometría y ajuste a 0,5 μg / μl.
  5. Preparar sondas antisentido y sensorial
    1. Utilice el sistema de transcripción de ARN T7 / SP6 para generar sondas antisentido y sensorial. La ARN polimerasa SP6 se ​​utiliza para transcribir ARN bicatenario para sondas antisentido marcadas con DIG y biotina para estos tres genes OR usando plásmidos recombinantes linealizados como plantillas in vitro . La ARN polimerasa T7 se utiliza para producir sondas de detección. Realizar la reacción en un volumen final de 20 μL, que contiene 2 μl de mezcla NTP 10x, 2 μl de tampón de transcripción 10X, 1 μl de inhibidor de RNasa, 2 μl de ARN polimerasa T7 o SP6, 4 μl de 0,5 μg / μL de plásmido linealizado y 9 mu l de H _ { 2} O libre de RNasa, seguidoPor una incubación de 3 h a 37ºC.
    2. Incubar las sondas antisentido y sensorial marcadas con DIG y biotina durante 30 min con 1 mu l de DNasa a 37ºC. Añadir 2,5 μL de LiCl 5 M y 75 μL de etanol absoluto, luego incubar las reacciones durante 30 minutos a -70 ° C.
    3. Centrifugar a 15.000 xg durante 30 minutos a 4 ° C. Cuidadosamente decantar el sobrenadante. Añadir 150 μl de etanol al 70% para lavar el precipitante. Preparar el etanol al 70% (1 L) añadiendo etanol al 95% (736,8 ml) a agua destilada estéril (263,2 ml).
    4. Centrifugar a 15.000 xg durante 30 min a 4 ° C de nuevo y secar al aire el pellet durante 5-10 min a RT. Añadir 25 μL de H 2 O libre de RNasa para disolver las sondas antisentido y sensorial de ARN.
    5. Si la longitud del gen insertado es mayor que 1 kb, posteriormente se fragmentan las sondas antisentido y de sentido inverso a una longitud media de ~ 300 pb por incubación en soluciones tampón bicarbonato-carbonato. Realizar la reacción en un volumen final de 50 μl, containing 25 l de la sonda de ARN y 25 l de la solución tampón de bicarbonato-carbonato (mM NaHCO3 80 mM, Na 120 2 CO 3, pH 10,2) a 60 ° C. El tiempo de hidrólisis requerido viene dado por una fórmula 17 previamente publicada.
    6. Añadir 5 μl de ácido acético al 10% para detener la reacción. En este experimento, se fragmentan las sondas LmigOR2 y LmigORco antisentido y sentido durante 24 y 23 min, respectivamente.
      T = (L _ { o } - L _ { f} ) / k _ {X} o _ {XL} f
      L o = longitudes de los fragmentos iniciales en kb
      L f = longitud de los fragmentos finales en kb
      K = la constante de velocidad para la hidrólisis, aproximadamente 0,11 kb -1 min -1
      T = tiempo de hidrólisis en min
    7. Por último, añadir 250 μL de tampón de hibridación y almacenar a -80 ° C.

2. Preparación de las secciones del criostato

  1. Precool el freeziNg hasta -24 ° C.
  2. Seleccione las nuevas langostas adultos que mueven y están activas y tienen antenas intactas. Cortar las antenas en pedazos de 2-3 milímetros usando maquinillas de afeitar estériles.
  3. Ponga el compuesto OCT en un soporte de micrótomo congelador y coloque una o dos muestras en el compuesto horizontalmente. Luego, transfiera el soporte al micrótomo de congelación a -24 ° C para equilibrar hasta que el compuesto se congela. Saque el soporte y cubra las muestras con un poco de compuesto. Transfiera el soporte al micrótomo de congelación a -24 ° C de nuevo durante al menos 10 minutos ( Figura 1 ).
    NOTA: Evite las burbujas en el compuesto.
  4. Fijar el soporte con las muestras en el microtómulo de congelación, luego seccionar las muestras congeladas en cortes de 12 μm de grosor a -24 ° C.
  5. Descongelar las rebanadas una por una en los portaobjetos (25 x 75 mm, sin nucleasas) y secar al aire durante 10 min.

3. Secciones de fijación

  1. Después de preparar el criostato(100 x 40 x 80 mm) y fijar los tejidos por incubación de los portaobjetos en solución de paraformaldehído (PFA) al 4% durante 30 min a 4 ° C.
  2. Lavar las diapositivas en solución salina tamponada con fosfato 1X (PBS) durante 1 min.
  3. Para eliminar las proteínas alcalinas, transferir los portaobjetos a HCl 0,2 M durante 10 min.
  4. Para eliminar la proteína superficial del ácido nucleico, transferir los portaobjetos a 1XPBS con 1% de Triton X-100 durante 2 min.
  5. Lavar los portaobjetos dos veces durante 30 s en 1x PBS.
  6. Finalmente, enjuague los portaobjetos en solución de formamida durante 10 min a 4 ° C.

4. Hibridación

  1. Preparar las sondas antisentido y de sentido
    1. Utilizar un tampón de hibridación para diluir las sondas antisentido o sensorial de ARN en los tubos libres de nuclease de 1,5 ml. En este experimento, para todas las sondas antisentido y sensorial ( LmigOR1, LmigOR2 y LmigOrco ), añadir 1 μl de sonda a 99 μL de hibridación por diapositiva. Generalmente, el uso de diluciones 1: 100 de sondas antisentido produce señales positivas significativas y fondos bajos usando este protocolo.
    2. Para la detección cromogénica, diluir las sondas marcadas con DIG individualmente.
    3. Para la detección de TSA, diluir DIG-etiquetados LmigOR1 con biotina marcado LmigOrco sondas o DIG-etiquetados LmigOR2 con biotina marcado LmigOR1 sondas en conjunto en el buffer de hibridación.
    4. Calentar las diluciones durante 10 min a 65 ° C y ponerlas en hielo durante al menos 5 min.
  2. Hibridación
    1. Escurrir las diapositivas y añadir 100 μ l de antisentido diluido y sentido sondas (Paso 4.1) a las secciones de tejido. Luego, coloque cubreobjetos (24 mm x 50 mm, sin nucleasa) en las secciones de tejido.
    2. Coloque los portaobjetos cubiertos horizontalmente en una caja húmeda (~ 300 x 180 x 50 mm 3 , Figura 2 ) e incube unaT 55ºC durante 22 h. Agregue solución de formamida o 1X PBS al fondo de la caja para mantener el ambiente húmedo, pero no sumerja las diapositivas en el líquido.
  3. Lavado y bloqueo.
    1. Después de la hibridación, retire los cubreobjetos cuidadosamente. Lavar las diapositivas dos veces durante 30 minutos en 0.1x Citrato de Sodio Salino (SSC) a 60 ° C.
      NOTA: El lavado significa colocar los portaobjetos en un soporte de portaobjetos que luego se coloca en un recipiente de plástico y agitar suavemente sobre un balancín (~ 50 rpm; Figura 2 ).
    2. Enjuague los portaobjetos en 1x solución salina tamponada con Tris (TBS) durante 30 s.
    3. Añadir 1 ml de reactivo de bloqueo al 1% en TBS suplementado con Triton X-100 al 0,03% en cada diapositiva, e incubar durante 30 min. Luego, deseche la solución de bloqueo.
  4. Inmunohistoquímica.
    1. Para la detección cromogénica, utilice un reactivo de bloqueo en TBS para diluir 750 unidades (U) / mL de antibota-anti-digoxigenina conjugada con antiboDy a 1,5 U / mL AP solución. Agregue 100 μl de solución de AP por cada diapositiva cubierta (24 mm x 50 mm).
    2. Para la detección de TSA, utilice un reactivo de bloqueo en TBS para diluir 750 U / ml de anticuerpo conjugado con anti-digoxigenina AP y anticuerpo conjugado con antipatina de estreptavidina anti-biotina a la solución de AP / HRP. Añadir 100 μl de solución de AP / HRP por una lámina cubierta (24 mm x 50 mm).
    3. Incubar los portaobjetos en una caja húmeda ( Figura 2 ) durante 60 minutos a 37 ° C. Utilice la solución de formamida o 1X PBS para mantener la caja húmeda pero no empapada.

5. Tinción

  1. Quite los cubreobjetos cuidadosamente. Lavar las diapositivas tres veces durante 5 min en 1x TBS suplementado con Tween-20 al 0,05%. Enjuagar los portaobjetos en tampón DAP (detección cromogénica: pH 9,5, detección de TSA: pH 8,0) durante 5 min.
  2. Tinción (detección cromogénica)
    1. Añadir 100 μl de NBT (375 μg / ml) / BCIP (188 μg / ml) solución de sustrato (diluida en DAP;PH 9,5) a cada diapositiva. Cuidadosamente colocar cubreobjetos (24 x 50 mm) en las diapositivas.
    2. Incubar los portaobjetos en una caja húmeda con solución de sustrato durante 10 min - O / N a 37 ° C.
      NOTA: Compruebe el desarrollo mirando las diapositivas de vez en cuando bajo el microscopio.
    3. Cuando el desarrollo esté listo, detenga la reacción transfiriendo los portaobjetos al agua.
  3. Tinción (detección de TSA)
    1. Utilice una jeringa para mover el sustrato HNPP (100 μg / ml) / rojo rápido (250 μg / ml) del filtro de jeringa (0,22 μm, Figura 2 ).
    2. Agregue 100 μl de sustrato HNPP / Fast Red por cada diapositiva cubierta con un cubreobjetos (24 x 50 mm). Incubar las diapositivas durante 30 min con HNPP / Fast Red sustrato a RT.
    3. Retire los cubreobjetos cuidadosamente y lave los portaobjetos tres veces durante 5 min en 1X TBS suplementado con Tween-20 al 0,05%.
    4. Utilizar 100 μl de sustrato TSA / cubierto (24 x 50 mm 2 ) deslizamiento. Incubar los portaobjetos con sustrato TSA durante 10 minutos a TA.
    5. Retire los cubreobjetos cuidadosamente y lave las diapositivas tres veces durante 5 min en 1x TBS suplementado con Tween-20 al 0,05%.
  4. Incrustar las diapositivas en PBS / glicerol (1: 3).
    NOTA: Después de terminar estos procedimientos, las diapositivas deben ser observadas tan pronto como sea posible porque la señal fluorescente se apagará rápidamente.

6. Observación

  1. Detección cromogénica
    1. Observe las secciones de tejido usando un microscopio óptico. Elija las lentes objetivo 10X, 20X y 40X para observar los resultados de la detección cromogénica.
    2. Utilice el software DP-BSW para analizar los resultados y capturar las imágenes.
  2. Detección de TSA
    1. Observe las secciones de tejido usando un microscopio confocal. Los genes marcados con DIG deben observarse bajo luz de 543 nm, presentando un color rojo, y los genes marcados con biotina deben serObservado bajo luz 488 nm, presentando un color verde. Cuando emergen, presentan color amarillo.
    2. Elija las lentes objetivo 20X y 40X para observar los resultados de la detección de TSA, respectivamente.
    3. Utilice el software FV1000 para analizar los resultados y capturar las imágenes.

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Resultados

Con la detección cromogénica, un pequeño subconjunto de las células de la antena en cada sección de la antena de adultos se denota por DIG-etiquetados LmigOR1 y LmigOR2 antisentido sondas ( Figura 3 ]. RNA ISH en secciones consecutivas para localizar LmigOR1 y LmigOR2 mostró que las células antenales que expresan los dos genes se localizaron en ORN clusters que expresan LmigORco , lo que indica que el sup...

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Discusión

Es difícil realizar ARN ISH para localizar los genes OR en las antenas de insectos porque los niveles de expresión de los genes OR, excepto ORco , son muy bajos y preservar cortes histológicos de antenas de insectos es muy difícil. Además, la detección de TSA es también muy difícil. Para abordar estos problemas, deben tomarse las siguientes medidas. Las antenas se seleccionan de las langostas adultas de nueva mutación que tienen cutículas antenales finas y suaves, que mantienen su morfología en la diapositiva. ...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar o cualquier otro conflicto de intereses.

Agradecimientos

Este trabajo es apoyado por una subvención de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No.31472037). La mención de nombres comerciales o productos comerciales en este artículo es únicamente con el propósito de proporcionar información específica y no implica recomendación.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Materiales
2&veces; TSINGKETM Mezcla MaestraTSINGKE, ChinaTSE004
Libre de RNasa H2OTIANGEN, ChinaRT121-02
REGULAR AGAROSE G-10BIOWEST, ESPAÑA91622
Tampón de uniónTIANgel Midi Kit de purificación, TIANGEN, ChinaDP209-02
Tampón de equilibrioTIANgel Kit de purificación Midi, TIANGEN, ChinaDP209-02
Solución de lavadoTIANgel Midi Kit de purificación, TIANGEN, ChinaDP209-02
T VectorPromega, EE. UUA362A
T4 ADN ligasaPromega, EE. UUM180A
Escherichia coli< / em> DH5 y alfa;TIANGEN, ChinaCB101
AmpicilinaSigma, EE. UU.A-6140
Isopropilo β-D-1-tiogalactopiranósidoInalco, EE. UU1758-1400
5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósidoSBS Genetech, ChinaGX1-500
Nco IBioLabs, Nueva InglaterraR0193S
Spe IBioLabs, Nueva InglaterraR0133M Kit de etiquetado de ARN
DIG Roche, Suiza11175025910
Kit de etiquetado de ARN de biotinaRoche, Suiza11685597910
Kit de etiquetado de ARN DIGDNasa,11175025910
LiClSinopharm, China10012718
EtanolSinopharm, China10009257
Ácido acéticoBEIJING CHEMICAL REGENTS COMPANY, China10000292
Compuesto Tissue-Tek O.C.T.Sakura Finetek Europe, Zoeterwoude, Países Bajos4583
PortaobjetosTINA JIN HAO YANG BIOLOGCAL MANUFACTURE CO., LTE, ChinaFISH0010
HClSinopharm, China80070591
MillexMillipore, EE. UU.SLGP033RS
Tween 20AMRESCO, EE. UU.0777-500ML
Nitroblue cloruro de tetrazolio / 5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato sal de toluidinaRoche, Suiza11175041910
GlycerolSinopharm, China10010618
NombreEmpresaNúmero de catálogoComments
>Solutions
1× Tris-acetato-EDTASigma, EE. UU.V900483-1KG0.04 mol / L Tris-Base
1&veces; Tris-acetato-EDTABEIJING CHEMICAL REGENTS COMPANY, China100002920.12% ácido acético
1× Tris-acetato-EDTASigma, EE. UU.03677Sal disódica de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)
Medio líquido Luria-Bertani (LB)Sinopharm, China1001939210 g/L NaCl
Luria-Bertani (LB) medio líquidoMERCK, AlemaniaVM335231 10 g/L Peptona de caseína (Triptona)
Luria-Bertani (LB) medio líquidoMERCK, AlemaniaVM3615265 g/L Extracto de levadura
Placa de sustrato sólido LBSinopharm, China1001939210 g/L NaCl
Placa de sustrato sólido LBMERCK, AlemaniaVM335231 10 g/L Peptona de caseína (Tryptone)
Placa de sustrato sólido LBMERCK, AlemaniaVM3615265 g/L Extracto de levadura Placa
sustrato sólido LBWISENT ING, Canadá800-010-CGAgar de 15 g/L de grado bacteriológico
10 veces; solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7.1)Sinopharm, China100193928.5% NaCl
10 veces; Solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7.1)Sigma, EE. UUV900041-500G14 mM KH2PO4
10&veces; Solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7.1)Sigma, EE. UUV900268-500G80 mM Na2HPO4
10× Solución salina tamponada Tris (TBS, pH 7.5)Sigma, EE. UUV900483-1KG1 M Tris-Base
10× Solución salina tamponada con tris (TBS, pH 7,5)Sinopharm, China100193921,5 m
tampón de detección de NaCl (DAP)           detección cromogénica pH 9.5            Detección TSA pH 8.0Sigma, EE. UU.V900483-1KG100 mM Tampón de detección Tris-Base
(DAP)           detección cromogénica pH 9.5            Detección TSA pH 8.0Sinopharm, China10019392100 mM
de NaCl Tampón de detección (DAP)           detección cromogénica pH 9.5            Detección TSA pH 8.0Sigma, EE. UU.V900020-500G50 mM MgCl2· 6H2O
20 veces; citrato de sodio salino (pH 7.0)Sinopharm, China100193923 M NaCl
20 veces; solución salina-citrato de sodio (pH 7.0)Sigma, EE. UUV900095-500G0.3 M Solución
de paraformaldehído de Na-Citrato al 4% (PFA, pH 9.5)Sigma, EE. UUV900894-100G4% tampón de
carbonato de sodioSigma, EE. UUV900182-500G0.1 M NaHCO3
Tampón de carbonato de sodio (pH 10.2)Sigma, EE. UUV900182-500G80 mM NaHCO3
carbonato de sodio (pH 10.2)Sigma, EE. UUS7795-500G120 mM Na2< / sub>CO3< / sub>
Solución de formamida (pH 10.2)MPBIO, EE. UUFORMD00250% de formamida desionizada
Solución de formamida (pH 10.2)5× tampón de bloqueo de citrato de sodio y solución salina
en TBSRoche, Suiza111750419101%
Tampón de bloqueo de transferencia en TBSAMRESCO, EE. UU0694-500ML0.03% Triton X-100
Tampón de bloqueo en TBS1× Solución salina tamponada Tris
Solución alcalina de fosfatasa SoluciónRoche, Suiza111750419101,5 U/mL anticuerpo conjugado anti-digoxigenina fosfatasa alcalina
fosfatasa alcalinaTampón bloqueante en TBS
Solución de fosfatasa alcalina / peroxidasa de rábano picanteRoche, Suiza111750419101,5 U/mL de fosfatasa alcalina antidigoxigenina conjugada anticuerpo
Solución de fosfatasa alcalina/peroxidasa de rábano picanteKit TSA, Perkin Elmer, EE. UU.NEL701A001KT 1% anti-biotina estreptavidina peroxidasa de rábano picante- anticuerpo conjugado
fosfatasa alcalina/peroxidasa de rábano picanteTampón de bloqueo en
tampón de hibridaciónMBIO, EE. UU. FORMD00250% de hibridación de formamida desionizada
Búfer2&veces; citrato de
sodio salino Tampón de hibridaciónSigma, EE. UU.D8906-50G10% sulfato de dextrano
Tampón de hibridacióninvitrogen, EE. UUAM711920 y micro; g/mL de levadura t-ARN Tampón
hibridaciónSigma, EE. UU.D3159-10G0,2 mg/mL ADN de esperma de arenque
2-hidroxi-3-ácido naftoico-2'-fenilanilida fosfato/4-cloro-2-metilbencendiazionio hemi-zinc cloruro de policiano sustrato de sal Roche, Suiza117588880011% de ácido 2-hidroxi-3-naftoico-2'-fenilanilida fosfato (10 mg/mL)
Sustrato de sal de cloruro de hemizinc de hemi-zinc de ácido 2-hidroxi-3-naftoico-2'-fenilanilácido de 4-cloro-2-metilbencenodiazonio, Suiza117588880011% de sal de cloruro de hemi-zinc de 4-cloro-2-metilbencenodiazonio (25 mg/mL)
Ácido 2-hidroxi-3-naftoico-2'-fenilanilida fosfato/4-cloro-2-metilbencenodiazonio hemi-zinc sustrato de salTampón
de detección Señal de tiramida sustrato de amplificaciónTSA kit, Perkin Elmer, EE. UU.NEL701A001KT% de fluoresceína-tiramidas
Sustrato de amplificación de señal de tiramidaKit TSA, Perkin Elmer, EE. UUNEL701A001KT Diluyente de amplificación
NameCompanyNúmero de catálogoComments
Instrument
Freezing microtomoLeica, Nussloch, Alemaniacriostato
Thermo SCIENTIFIC, EE. UUNANODROP 2000
Microscopio ópticoOlympus, Tokio, JapónMicroscopio Olympus IX71 Microscopio
confocalOlympus, Tokio, JapónOlympus BX45 Microscopio
. . . de Roche, Suiza de . . . de . . . . . . . ortopédica solución deSolución de TBS . de Roche de cloruro de hemi-zinc 2. Espectrofotómetro de Jung CM300. confocal

Referencias

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