Artículo de método

Ensayo para la fosforilación y Microtubule obligatorios junto con la localización de la proteína Tau en células de cáncer colorrectal

DOI:

10.3791/55932

⸱

10 de octubre de 2017

 ,  , 
1Systems Biotechnology Research Center, KIST Gangneung Institute of Natural Products, 2Division of Bio-Medical Science & Technology, KIST School, Korea University of Science and Technology

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este manuscrito describe protocolos estándar para la medición de la hiperfosforilación de tau, medición de enlace de tau a los microtúbulos y la localización de tau intracelular después de tratamientos con fármacos. Estos protocolos pueden utilizarse repetidamente para la detección de drogas u otros compuestos que enlace la hiperfosforilación o microtúbulos tau.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La proteína asociada a microtúbulos tau es una proteína neuronal que se localiza sobre todo en los axones. Generalmente tau es esencial para el funcionamiento neuronal normal porque está implicada en la estabilización y el montaje del microtubule. Además de las neuronas, tau se expresa en mama, próstata, gástrica, colorrectal y los cánceres de páncreas donde se muestra la estructura casi similar y ejerce funciones similares como el tau neuronal. La cantidad de tau y su fosforilación puede cambiar su función como estabilizador de microtúbulos y conducir al desarrollo de filamentos helicoidales apareados en trastornos neurodegenerativos diferentes, como la enfermedad de Alzheimer. Es importante determinar el estado de fosforilación de tau y sus características de unión a microtúbulos. Además, examinar la localización intracelular de tau es importante en diferentes enfermedades. Este manuscrito detalles protocolos estándar para la medición de la fosforilación de tau y de la Unión de tau a los microtúbulos en las células de cáncer colorrectal con o sin tratamiento de LiCl y curcumina. Estos tratamientos pueden utilizarse para detener el desarrollo y proliferación de células de cáncer. Localización intracelular del tau se examina mediante el uso de inmunohistoquímica y microscopía confocal durante el uso de bajas cantidades de anticuerpos. Estos ensayos pueden usarse repetidamente para la detección de compuestos que afectan la hiperfosforilación de tau o atascamiento de microtúbulos. Terapéutica de la novela utiliza para diferentes Tauopatías o relacionados con agentes anticancerígenos potencialmente pueden ser caracterizados mediante estos protocolos.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tau fue identificado originalmente como una proteína asociada a microtúbulos estables al calor que fue co purificada con tubulina1. Tau se expresa exclusivamente en eucariotas superiores2,de3,4. La función principal del tau es controlar microtúbulos Asamblea1,5,6. También contribuye a la polimerización de microtúbulos7, transporte axonal8, cambios en el diámetro axonal9, formación de polaridad de neuroma y neurodegeneración10. Tau también actúa como un andamio de proteínas para el control de algunas vías de señalización. Estudios de cerebro de rata sugieren que tau es específica de la neurona y que principalmente se localiza en axones11. Porque es esencial para el desarrollo neuronal y polimerización de microtúbulos tau, tau fue presumido para desempeñar un papel importante en el desarrollo axonal en el sistema nervioso central; Esta hipótesis fue posteriormente verificado por experimentos in vitro e in vivo . Además de las neuronas, tau se expresa en diversas células no neuronales, incluyendo hígado, riñón y músculo células12,13. Tau se expresa también en mama, próstata, colorrectal, gástrica y cáncer pancreático células líneas y tejidos14,15,16,17,18, 19. tau también se encuentra en myositis del cuerpo de inclusión como trenzado tubulofilaments en cuerpos de inclusión20.

Tau puede llevar varias modificaciones poste-de translación. De todas las modificaciones post-traduccionales, fosforilación es la más común. Fosforilación de tau mayor disminuye su afinidad por los microtúbulos, finalmente desestabilizar el citoesqueleto. Se han descrito sitios de fosforilación de ochenta y cinco en aislados de los tejidos del cerebro humano la enfermedad de Alzheimer la proteína tau. De estos sitios, 53% son serina, treonina 41% y sólo 6% tirosina residuos21,22,23. Fosforilación de Tau afecta a su localización, función, enlace, solubilidad y su susceptibilidad a otras modificaciones poste-de translación. También la fosforilación de tau a más de lo normal (o completamente saturado con grupos fosfato) se conoce como la hiperfosforilación que imita las características estructurales y funcionales de la enfermedad de Alzheimer24. Mantiene el buen funcionamiento de los microtúbulos axonales y asegura el funcionamiento neuronal normal bajo condiciones fisiológicas. Sin embargo, tau hiperfosforilada es incapaz de mantener un enlace de microtúbulos bien organizado, causando la pérdida neuronal por desmontaje de microtúbulos. Niveles normales de la fosforilación de tau se requieren para tau correcto funcionamiento, pero tau no funciona normalmente si se altera su nivel de fosforilación característico y si está hiperfosforilada25. En la enfermedad de Alzheimer y algunos otros trastornos neurodegenerativos relacionados con la edad, se convierte en hiperfosforilada y forma los filamentos helicoidales apareados y los enredos de neurofibrillary26,27. Por lo tanto, métodos para la determinación de la fosforilación de tau y Unión de los microtúbulos son importantes.

Cáncer colorrectal, un cáncer asociado a envejecimiento, es que la tercera más frecuentemente diagnosticado cáncer y el tercer prominente que causan la muerte para hombres y mujeres28. El cáncer colorrectal es uno de los principales cánceres causantes de muerte en el mundo occidental29. Porque el cáncer colorrectal y la enfermedad de Alzheimer están asociados con el envejecimiento y ambos suceden principalmente en los países desarrollados donde disfrutar de los hábitos alimentarios similares, las dos enfermedades de alguna manera pueden correlacionarse. Además, las células cancerosas tau-positivas y negativas de tau responden de diferente manera a los agentes quimioterapéuticos, por ejemplo, paclitaxel16.

La curcumina es uno de los principales derivados de la longa de la cúrcuma, la especia India cúrcuma30. Durante siglos, las poblaciones del sur de Asia han consumido cúrcuma en su dieta diariamente. La curcumina se usa para tratar diferentes enfermedades, incluyendo cáncer colorrectal, la enfermedad de Alzheimer, diabetes, fibrosis quística, enfermedad inflamatoria intestinal, artritis, hiperlipidemia, aterosclerosis y cardiopatía isquémica31, 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38. litio también puede matar a las células de cáncer colorrectal o prevenir su proliferación39. Litio puede usarse para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer40 ya que disminuye la agregación de tau y previene su hiperfosforilación como se observa en un ratón transgénico modelo41,42,43, 44.

Este manuscrito tiene como objetivo: 1) medir la tau total y niveles de expresión de fosfo-tau en células tratadas; 2) describe un ensayo de fosfatasa para medir la fosforilación de tau total; 3) examinar microtubule-obligatorios de tau; y 4) localizar tau mediante microscopía confocal en líneas celulares de cáncer colorrectal tratados con curcumina o LiCl. Los resultados revelan que célula el tratamiento con curcumina, que es un agente quimioterapéutico supuestamente bueno para el cáncer de colon, y tratamiento con LiCl puede reducir la expresión de ambos tau total y fosforila tau en líneas celulares de cáncer colorrectal. Estos tratamientos también pueden causar desplazamiento nuclear de tau. Sin embargo, inesperadamente, la curcumina no mejorar la Unión de tau a los microtúbulos.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. preparación de los reactivos

  1. añadir 10 μl de solución de fluoruro de phenylmethylsulfonyl (1 mM), 10 μl (1 x de acción x 100) de solución Cóctel de inhibidor de la proteasa y 10 μl (1 x de acción x 100) de fosfatasa solución coctel inhibidor a 1 mL de tampón de ensayo (RIPA) x radioimmunoprecipitation 1 preparar el buffer de lisis RIPA completo.
  2. Prepare 10 x buffer de buffer (PEM) de tubulina general.
    1. Add 800 mM (6,0474 g) piperazina-N-N ' - bis - 2-(n-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-ácido ácido, 10 mM (95,1 mg) glicol de etileno-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N ', N '-tetraacético de ácido, 10 mM (51 mg) MgCl 2 y NaOH 1.25 de M (3 mL de 10 M) en un tubo de 50 mL , mezclar con 15 mL de agua destilada y disolver mediante el uso de un vórtice. Verificar el pH (debe ser 6,9). Si pH > 6.9, deseche el búfer y rehacer un lote fresco.
      Nota: El NaOH debe ser por debajo de 1,25 M para asegurar que el pH no adelantar 6.9. No se aconseja utilizar ácido clorhídrico para ajustar el pH > 6.9.
    2. Agregar NaOH gota a gota hasta que pH 6.9. Añadir agua destilada hasta 25 mL de tampón de PEM X 10. Por último, filtrar utilizando una jeringa y un filtro de jeringa de 0,2 μm. Este buffer se dividen en alícuotas en tubos de 1,5 mL y almacenar a 4 ° C.
  3. Prepare 5 x tampón con agente reductor y tinte.
    1. Mix 300 μL (60 mM) de 1 M Tris-HCl (pH 6,8), (25%) de 2,5 mL de glicerol 50%, 1 mL (2%) de 10% sodio dodecil sulfato (SDS) y 1,2 mL de agua destilada para 5 mL de 5 x buffer de muestra de SDS. Almacenar en − 20 ° C.
      Nota: Ya que el glicerol es viscoso, mide 1,25 mL glicerol es difícil. 1 mL de glicerol al 100% pesa 1,26 g. Así, pesar 1,575 g de glicerol al 100% (que equivale a 1,25 mL de 100% o 2,5 mL de glicerol al 50%) en 15 mL tubo primero; mezclar bien con los demás componentes de.

2. Cultura, el tratamiento con curcumina o LiCl tratamiento y examen de expresión de la proteína de la célula

  1. Add ~ 1 x 10 6 HCT 116 células en 100 mm platos de cultivo de tejidos que contienen el mínimo esencial los medios de comunicación (MEM) suplementado con 10% bovino fetal suero (FBS) y 1% de penicilina-estreptomicina. Después de un día de cultivo, las células llega a confluencia de 60-70%.
    Nota: El número de placas necesitada depende del número de tratamientos que se describen a continuación.
  2. Cuando las células alcanzan confluencia ~ 65% (aproximado usando microscopia), saque el medio MEM complementado y añadir MEM libre de suero de 5 μm, 10 μm, 30 μm curcumina o 25 mM, 50 mM y 100 mM LiCl. Incubar a 37 ° C durante 24 h en una atmósfera humidificada con 5% CO 2.
  3. 24 h después del tratamiento, lavar las células con solución salina 1 mL helado con tampón fosfato (PBS) y raspar las células usando un raspador celular. Transferencia de las células raspadas en 1,5 mL tubos de centrífuga y centrifugar durante 4 min a 1.800 x g a 4 ° C para obtener pellets celulares.
  4. Lyse las células suspendiendo las pelotillas en 100 μl de buffer RIPA completa a 4 ° C por 20 min mientras que regularmente golpean ligeramente los tubos. Someter a ultrasonidos las muestras brevemente.
  5. Centrifugar los homogenados celulares en una centrífuga de sobremesa a 22.570 x g por 20 min a 4 ° C. transferir el sobrenadante a otros tubos etiquetados con una pipeta de.
  6. Medir la concentración de proteína en los sobrenadantes mediante el ensayo de Bradford 45 usando kits comerciales de análisis de proteínas.
    7. Tampón de carga de gel SDS X
  7. preparar muestras de concentración de la proteína igual (10 μg proteína/13 μl de muestra) de lysates de la célula con 4. Preparado 4 x buffer de carga de gel SDS fresco que contiene 400 mM Ditiotreitol (DTT).
    Nota: En esta etapa, las muestras pueden conservarse a − 20 ° C si es necesario.
  8. Incubar las muestras en un bloque térmico a 100 ° C por 5 min mezclan las muestras usando un vórtex y esperan que se enfríe para ~ 10-15 min
  9. Montar un sistema de electroforesis.
    1. Carga 10 μg de proteína (13 μl de muestra) por pocillo en un gel de SDS-poliacrilamida de 10% para electroforesis (SDS-PAGE). La escala del peso molecular en el gel a un carril de la carga.
      Nota: Como electroforesis, la escalera de la proteína se resuelve en bandas de proteínas de pesos moleculares evidentes. Utilizar estas bandas para calcular los pesos moleculares de las bandas de proteínas desconocidas.
    2. Después de cargar las muestras, conectar los electrodos positivos y negativos del sistema de electroforesis a una fuente de energía para mantener una tensión constante. Inicialmente, comenzar a 70 V por 20 min mover las muestras de proteína del gel de apilamiento en el gel de resolución. Luego, aumentar la tensión de 125 V para aproximadamente 70-120 min hasta que las muestras y la escala de proteína lleguen al final del gel.
    3. Después de la terminación de la electroforesis, transferir el gel a una membrana de polivinilideno difluoruro (PVDF) utilizando un sistema de moje electroblotting. Transferencia de ~ 100 min a 100 V. bloque de la membrana en solución amortiguadora de bloqueo 4% albúmina de suero bovino (BSA) durante 90 minutos a temperatura ambiente de alrededor de 25 ° C.
  10. Marque el blot por corte en el lado con la escala del peso molecular. Use una lámina de plástico transparente y un cuchillo afilado para cortar el blot. Preparar las soluciones de primaria-anticuerpo (anti-tau en el 1:5, 000, anti-fosfo-tau 1:4, 000) e incubar el blot en esta solución a 4 ° C durante la noche.
  11. Después de la incubación durante la noche, lavar la mancha de 7 min cuatro veces en solución tampón fosfato salino-Tween-20 (SAFT).
  12. Preparar las soluciones pertinentes de anticuerpo secundario (anti-conejo de cabra o anti-mouse IgG 1:5, 000) e incubar el blot en esta solución durante 90 minutos a temperatura ambiente de 25 ° C. lavado en SAFT cuatro veces, 7 min.
  13. Desarrollar la mancha blanca /negra usando un kit de quimioluminescencia según el fabricante ' recomendaciones de s. Cubrir la mancha blanca /negra usando una envoltura de plástico transparente. Adquisición de imágenes por una sistema de quimioluminiscencia con software relevante de imagen de la quimioluminescencia.

3. Ensayo de la fosfatasa

  1. tratar los lysates de la célula (del paso 2.5) con fosfatasa alcalina en el búfer de fosfatasa alcalina.
    1. Tanto controlan y tratamiento de muestras, preparar 20 μl las muestras que contienen 20 μg proteína total. Añadir el volumen de lysates de la célula que contiene 20 μg proteína total, seguido de 2 μl de tampón de fosfatasa alcalina y fosfatasa alcalina 10 μl. Añadir agua destilada a 20 μl.
  2. Incubar las muestras a 37 ° C por 1 h. detener la reacción agregando ácido etilendiaminotetracético (EDTA) en una concentración final de 50 m m, o mediante la adición de ortovanadato de sodio (Na 3 VO 4) a una concentración final de 10 mM. También puede detener la reacción por calentamiento a 75 ° C por 5 min
  3. Antes de la incubación de las muestras con fosfatasa acabados, preparar muestras de la misma concentración sin añadir fosfatasa para la comparación con las muestras tratadas con fosfatasa.
  4. Añadir los 4 recién preparada el tampón de carga de gel SDS X que contiene 400 mM DTT.
  5. Incubar las muestras en un bloque térmico a 100 ° C por 5 min mezclar las muestras utilizando un vortex. Enfriar a temperatura ambiente para ~ 10-15 minutos
  6. Montar un sistema de electroforesis para correr un gel de poliacrilamida al 10% por SDS-PAGE.
    1. Carga 10 μg proteína (13 μl de muestra) por pozo en una fibra polyacry 10%lamide gel. La escala del peso molecular de la carga.
    2. Después de cargar la muestra, conectar los electrodos positivos y negativos del sistema de electroforesis a una fuente de energía para mantener una tensión constante. Inicialmente, comenzar a 70 V por 20 min mover las muestras de proteína del gel de apilamiento en el gel de resolución. A continuación, aumentar la tensión de 125 V y correr el gel aproximadamente 70-120 min hasta que las muestras y la escala de proteína lleguen al final del gel.
    3. Después de la terminación de la electroforesis, transferir el gel a una membrana PVDF usando un sistema de moje electroblotting. Transferencia de ~ 100 min a 100 V.
    4. Marque la mancha haciendo un pequeño corte en el lado de la escala del peso molecular. Use una lámina de plástico transparente y un cuchillo afilado para cortar lo blot.
  7. Bloquear la membrana en 4% BSA solución amortiguadora de bloqueo durante 90 minutos a temperatura ambiente.
  8. Incubar el blot en solución de anticuerpo primario (anti-tau en el 1:5, 000) a 4 ° C durante la noche. Lave la mancha blanca /negra en SAFT cuatro veces, durante 7 min.
  9. Preparar la correspondiente solución de anticuerpo secundario (cabra anti-ratón IgG 1:5, 000) e incubar el blot durante 90 minutos a temperatura ambiente. Lavar en SAFT cuatro veces, durante 7 min.
  10. Desarrollar la mancha blanca /negra usando un kit de quimioluminescencia según el fabricante ' recomendaciones de s. Cubrir la mancha dentro de una envoltura de plástico transparente. Adquisición de imágenes por una sistema de quimioluminiscencia con software relevante de imagen de la quimioluminescencia.

4. Ensayo de unión a microtúbulos

  1. para el análisis de enlace de microtúbulos, repita los pasos 2.1-2.6.
  2. Prepare 1 X buffer (2 mL) PEM de búfer PEM X 10 almacenados a 4 ° C mediante la adición de 20 μm (40 μL) paclitaxel y 1 mM (20 μl) GTP. Tomar los microtúbulos (MT) de − congelador de 80 ° C y la acción de trabajo de e. coli tau de − 20 ° C congelador.
  3. Preparación de las muestras según la tabla 1.
  4. Incubar a 37 ° C para ultracentrífuga de 30 min a 25 ° C durante 60 min a 100.000 x g.
  5. Transferencia 120 μl de sobrenadante que contiene desatado tau, limpieza y etiquetado tubos.
  6. Añadir 120 μl (mismo volumen como sobrenadante) de 5 X buffer para el sedimento que contiene tau encuadernado de la muestra y mezcla bien. La solución para limpiar tubos etiquetados y mezcle bien.
  7. Medir la concentración de proteína (ver paso 2.6).
    Nota: Mientras se preparan las muestras, usar el volumen de solución (paso 4.6) para la preparación de las muestras el pellet y sobrenadante.
  8. Preparar muestras de concentración de la proteína equivalente y añadir 4 recién preparada x buffer de carga de gel SDS con TDT (400 mM).
    Nota: Las muestras pueden almacenarse a − 20 ° C en este momento.
  9. Repita los pasos del 3.5-3.10.
de la < td colspan = " 2" >
nombremuestra microtúbulos necesitada principal proteína necesaria PEM-GTP-PTX
1 HCT 116-Control (6,21 μg/μl) 2 μl 9.66 μl (60 μg) 108.34 μl
2 HCT 116-curcumina 10 μM (4,81 μg/μl) μl 2 μl 16.63 (80 μg) μl 101.37
3 HCT 116-curcumina 20 μM (3.28 μg/μl) μl 2 μl 30.49 (100 μg) 87.51 μl
4 HCT 116-LiCl 25 mM (5.43 μg/μl) μl 2 μl 18.42 (100 μg) μl 99.58
5 e. coli tau 2 μl 1 μl Tau-352 μl 117
6 MT sólo 2 μl X μl 118
120 μl

tabla 1: preparación para el ensayo de unión a microtúbulos de muestras.

5. localización y expresión del Tau después de tratamiento de células con curcumina

  1. limpiar un cubreobjetos usando etanol al 70% y secar con un pañuelo de laboratorio. Coloque un cubreobjetos solo en cada pocillo de una placa de etiquetado bien 6-cultivo de tejidos. Coloque la placa en una seguridad biológica gabinete y encender una luz para por lo menos 3 h. UV
  2. Subcultivo las células y los de semilla en los pocillos correspondientes de la placa de 6 pozos en 2.5 x 10 5 células/pozo en medio de cultivo recomendado.
  3. ~ 24 h, después de examinar las células utilizando un microscopio invertido mediante 10 X y objetivos de X 40 para comprobar cambios morfológicos celulares. Grabar fotos si es necesario.
  4. Enjuague las células dos veces con PBS. Fijar las células en 3,7% formaldehído en una incubadora de 37 ° C en la oscuridad.
    Nota: La fijación por el formaldehído en la temperatura funciona bien, también. Use equipo de protección personal cuando maneje formaldehído.
  5. Lave las células en PBS. Fijar las células en metanol helada en − 20 ° C por 15 min permeabilizar las células por incubación en BSA 3% y 0,1% Tritón X-100 en PBS en hielo durante 10 minutos lavar las células con PBS.
  6. Incubar las células en solución amortiguadora de bloqueo (BSA 3% y 0,1% Tween-20 en solución de PBS) durante 1 h a temperatura ambiente.
    Nota: Incubación de 2 h a 4 ° C funciona bien, también.
  7. Preparar la solución primaria-anticuerpo (anti-tau en el 1: 200) en BSA 3% y 0,1% Tween-20 en PBS (p. ej., 2 anticuerpo tau-13 μl 0,4 mL de tampón).
  8. Cortar pequeños pedazos de un PVDF membrana para que las piezas encajan correctamente en cada pocillo de la placa de la pozo 6; remójelos en agua por 5 min lugar el corte PVDF en cada pozo.
  9. Añadir 60 μL de solución de anticuerpo primario para el corte de piezas PVDF en cada pozo. Colocar el cubre-objetos que las células pueden tocar la solución de anticuerpo primario. Incubar durante una noche a 4 ° C en una cámara oscura, húmeda. Lavado en PBS cuatro veces.
  10. Preparar la solución de anticuerpo secundario (conjugado con fluoresceína 594 anti-ratón IgG en 1: 400) BSA 3% y 0,1% Tween-20 en PBS.
  11. Cortar pequeños trozos de una membrana PVDF para que las piezas de encajar correctamente en cada pocillo de la placa de 6 pozos y remojan en agua por 5 min lugar el corte PVDF en cada pozo.
  12. Añadir 80 μl de la solución de anticuerpo secundario para cada una de las piezas PVDF en la placa de 6 pozos. Colocar el cubreobjetos de tal que las células pueden tocar la solución de anticuerpo secundario. Incubar en una cámara oscura, húmeda a temperatura ambiente durante 2 h. lavado con PBS cuatro veces.
  13. Montaje de muestras en el medio de montaje con 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) y fijar el cubreobjetos en portaobjetos de cristal.
    1. Agregar una gota de medio de montaje con DAPI en portaobjetos de vidrio. Quite el cubreobjetos de cada bien y colocarlos en el portaobjetos de vidrio que contiene el medio de montaje con DAPI. Asegurar que la superficie de cada cubreobjetos que contiene células toca la montañamedio de Ting en la correspondiente diapositiva de cristal.
    2. Aplicar esmalte de uñas todo cada cubreobjetos para sellar y fijar hermético sobre el portaobjetos. Si es necesario, hacer este paso dos veces.
  14. Incubar durante 1,5 h a temperatura ambiente en una cámara oscura.
  15. Examinar las diapositivas utilizando un microscopio confocal utilizando aceite de inmersión sobre el cubreobjetos en un cuarto oscuro.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Expresión de tau total y fosfo-tau fue examinado después de tratar las células con diferentes concentraciones de curcumina o LiCl (figura 1). Tratamiento de células con las tres concentraciones diferentes de la curcumina disminuye los niveles de expresión de tau; expresión de fosfo-tau aumentó sobre el tratamiento con baja concentración de curcumina pero disminuyó al tratar las células con concentraciones más altas de la curcumina. Anti-fosfo-tau (Ser396) fue...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este manuscrito establece diferentes condiciones procedimentales para la detección de tau total y fosforila tau en células de cáncer colorrectal tratados con curcumina y LiCl. Para evaluar el estado global de la fosforilación de tau en las muestras de proteína, un ensayo de fosfatasa fue descrito. Este ensayo se puede potencialmente utilizar para examinar el estado de fosforilación de alguna proteína.

Este ensayo se basa en el principio de que fosforila la proteína se mueve más lento que su es...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores declaran que no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Esta investigación fue realizada como parte del proyecto titulado 'Desarrollo y la industrialización de materia prima cosméticos de microalgas marinas de alto valor', financiado por el Ministerio de océanos y pesquerías, Corea y fue apoyado por una subvención de intramuros (2Z04930) KIST Gangneung Instituto de productos naturales.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
HCT 116 celdasATCCCCL-247
MEM (EBSS)HycloneSH30024.01
Suero fetal bovino (FBS)ThermoFisher (Gibco)16000044Tienda en -20 ° C
penicilina-estreptomicinaHycloneSV30010
Solución de tripsina-EDTAWelGeneLS 015-01
Plato de 100 mmCorning430161
placa de 6 pocillosCorningCoster 3516
Anti-Tau 13 anticuerpo ABCAMAB19030
Ditiotreitol (DTT)Roche10 708 984 001Temperatura de almacenamiento 2– 8 ° C
Centrífugas de microlitrosHettich ZentrifugenMIKRO 200 R
PaclitaxelSigma-AldrichT1912Temperatura de almacenamiento 2– 8 ° C
CurcuminaSigma-Aldrich (Fluka)78246Temperatura de almacenamiento 2– 8 ° C
Microtúbulos (MT)CitoesqueletoMT001Almacenar a 4 & deg; C (desecado)
Medio de montaje con DAPIVector LaboratoriesH-1200Almacene a 4 & grados; C en la oscuridad
Hidróxido de sodioSigma72068
Cloruro de magnesioSigma-AldrichM2670
GTPSigma-AldrichG8877Almacenar en -20 & grados; C
DPBSWelGeneLB 001-02
Desmembrador sónicoFisher ScientificModel 500
UltracentrífugaBeckman CoulterOptima L-100 XP
PIPESSigmaP1851
Albúmina sérica bovina (BSA)SigmaA7906
Generador de imágenes molecularesBio-RadChemiDoc XRS+Tienda a 4 & grados; C
Reactivo colorante para ensayo de proteínasBio-Rad500-0006
α-tubulina (11H10) Señalización de células mAbde conejo 2125
GAPDH (14C10) Señalización de células mAb de conejo2118
Anticuerpo anti-Tau (fosfo S396)abcam ab109390
EGTASigmaE3889Almacenar a temperatura ambiente
FastAP Fosfatasa alcalina termosensibleThermo ScientificEF0651Almacenar a -20 & grados; C
PMSFSigmaP7626Almacenar a temperatura ambiente
Inhibidor de fosfatasa Cóctel Señalizacióncelular5870Almacenar a 4 & grados;
C Inhibidor de la proteasa cóctelde señalización celular5871Almacenar a 4 & deg; C
RIPA BufferSigmaR 0278Temperatura de almacenamiento 2– 8 ° C
Tau-352 humanoSigmaT 9950Tienda a -20 ° C
Triton X-100 Sigma-AldrichX - 100Tienda alrededor de 25 ° C
Membrana de PVDFBio-Rad162-0177
Anticuerpo secundario IgG anti-ratón de cabraThermoFisherA-11005Almacenar en 4 ° C en la oscuridad
Microscopía confocalLeica Microsystem LeicaTCS SP5
Dodecil Sulfato de Sodio (SDS)Affymetrix75819
Ensayo de proteínas Bio-Rad500-0006Almacenar a 4 & grados; C

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Weingarten, M. D., Lockwood, A. H., Hwo, S. Y., Kirschner, M. W. A protein factor essential for microtubule assembly. Proc Natl Acad Sci U S A. 72, 1858-1862 (1975).
  2. Cambiazo, V., Gonzalez, M., Maccioni, R. B. DMAP-85: a tau-like protein from Drosophila melanogaster larvae. J Neurochem. 64, 1288-1297 (1995).
  3. Goedert, M., et al. PTL-1, a microtubule-associated protein with tau-like repeats from the nematode Caenorhabditis elegans. J Cell Sci. 109 (Pt 11), 2661-2672 (1996).
  4. Goedert, M., Spillantini, M. G., Jakes, R., Rutherford, D., Crowther, R. A. Multiple isoforms of human microtubule-associated protein tau: sequences and localization in neurofibrillary tangles of Alzheimer's disease. Neuron. 3, 519-526 (1989).
  5. Cleveland, D. W., Hwo, S. Y., Kirschner, M. W. Purification of tau, a microtubule-associated protein that induces assembly of microtubules from purified tubulin. J Mol Biol. 116, 207-225 (1977).
  6. Fellous, A., Francon, J., Lennon, A. M., Nunez, J. Microtubule assembly in vitro. Purification of assembly-promoting factors. Eur J Biochem. 78, 167-174 (1977).
  7. Witman, G. B., Cleveland, D. W., Weingarten, M. D., Kirschner, M. W. Tubulin requires tau for growth onto microtubule initiating sites. Proc Natl Acad Sci U S A. 73, 4070-4074 (1976).
  8. Dixit, R., Ross, J. L., Goldman, Y. E., Holzbaur, E. L. Differential regulation of dynein and kinesin motor proteins by tau. Science. 319, 1086-1089 (2008).
  9. Harada, A., et al. Altered microtubule organization in small-calibre axons of mice lacking tau protein. Nature. 369, 488-491 (1994).
  10. Caceres, A., Kosik, K. S. Inhibition of neurite polarity by tau antisense oligonucleotides in primary cerebellar neurons. Nature. 343, 461-463 (1990).
  11. Binder, L. I., Frankfurter, A., Rebhun, L. I. The distribution of tau in the mammalian central nervous system. J Cell Biol. 101, 1371-1378 (1985).
  12. Gu, Y. J., Oyama, F., Ihara, Y. tau is widely expressed in rat tissues. J Neurochem. 67, 1235-1244 (1996).
  13. Kenner, L., et al. Expression of three- and four-repeat tau isoforms in mouse liver. Hepatology. 20, 1086-1089 (1994).
  14. Souter, S., Lee, G. Microtubule-associated protein tau in human prostate cancer cells: isoforms, phosphorylation, and interactions. J Cell Biochem. 108, 555-564 (2009).
  15. Sangrajrang, S., et al. Estramustine resistance correlates with tau over-expression in human prostatic carcinoma cells. Int J Cancer. 77, 626-631 (1998).
  16. Rouzier, R., et al. Microtubule-associated protein tau: a marker of paclitaxel sensitivity in breast cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 8315-8320 (2005).
  17. Mimori, K., et al. Reduced tau expression in gastric cancer can identify candidates for successful paclitaxel treatment. Brit J Cancer. 94, 1894-1897 (2006).
  18. Jimeno, A., et al. Development of two novel benzoylphenylurea sulfur analogues and evidence that the microtubule-associated protein tau is predictive of their activity in pancreatic cancer. Mol Cancer Ther. 6, 1509-1516 (2007).
  19. Huda, M. N., Kim, D. H., Erdene-Ochir, E., Kim, Y. S., Pan, C. H. Expression, phosphorylation, localization, and microtubule binding of tau in colorectal cell lines. Appl Biol Chem. 59, 807-812 (2016).
  20. Askanas, V., Engel, W. K., Bilak, M., Alvarez, R. B., Selkoe, D. J. Twisted tubulofilaments of inclusion body myositis muscle resemble paired helical filaments of Alzheimer brain and contain hyperphosphorylated tau. The American journal of pathology. 144, 177-187 (1994).
  21. Buee, L., Bussiere, T., Buee-Scherrer, V., Delacourte, A., Hof, P. R. Tau protein isoforms, phosphorylation and role in neurodegenerative disorders. Brain Res Brain Res Rev. 33, 95-130 (2000).
  22. Hanger, D. P., Anderton, B. H., Noble, W. Tau phosphorylation: the therapeutic challenge for neurodegenerative disease. Trends Mol Med. 15, 112-119 (2009).
  23. Sergeant, N., et al. Biochemistry of Tau in Alzheimer's disease and related neurological disorders. Expert Rev Proteomics. 5, 207-224 (2008).
  24. Fath, T., Eidenmuller, J., Brandt, R. Tau-mediated cytotoxicity in a pseudohyperphosphorylation model of Alzheimer's disease. J Neurosci. 22, 9733-9741 (2002).
  25. Kolarova, M., Garcia-Sierra, F., Bartos, A., Ricny, J., Ripova, D. Structure and pathology of tau protein in Alzheimer disease. Int J Alzheimers Dis. 2012, 731526(2012).
  26. Kosik, K. S., Joachim, C. L., Selkoe, D. J. Microtubule-associated protein tau (tau) is a major antigenic component of paired helical filaments in Alzheimer disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 83, 4044-4048 (1986).
  27. Wood, J. G., Mirra, S. S., Pollock, N. J., Binder, L. I. Neurofibrillary tangles of Alzheimer disease share antigenic determinants with the axonal microtubule-associated protein tau (tau). Proc Natl Acad Sci U S A. 83, 4040-4043 (1986).
  28. American Cancer Society. Colorectal Cancer Facts, Figures 2011-2013. , Available from: http://www.cancer.org/acs/groups/content/@epidemiologysurveilance/documents/document/acspc-028312.pdf (2016).
  29. Jemal, A., et al. Cancer statistics, 2003. CA Cancer J Clin. 53, 5-26 (2003).
  30. Patel, V. B., Misra, S., Patel, B. B., Majumdar, A. P. Colorectal cancer: chemopreventive role of curcumin and resveratrol. Nutr Cancer. 62, 958-967 (2010).
  31. Lim, G. P., et al. The curry spice curcumin reduces oxidative damage and amyloid pathology in an Alzheimer transgenic mouse. J Neurosci. 21, 8370-8377 (2001).
  32. Venkatesan, N. Curcumin attenuation of acute adriamycin myocardial toxicity in rats. Br J Pharmacol. 124, 425-427 (1998).
  33. Srinivasan, M. Effect of curcumin on blood sugar as seen in a diabetic subject. Indian J Med Sci. 26, 269-270 (1972).
  34. Deodhar, S. D., Sethi, R., Srimal, R. C. Preliminary study on antirheumatic activity of curcumin (diferuloyl methane). Indian J Med Res. 71, 632-634 (1980).
  35. Rao, C. V., Rivenson, A., Simi, B., Reddy, B. S. Chemoprevention of colon carcinogenesis by dietary curcumin, a naturally occurring plant phenolic compound. Cancer Res. 55, 259-266 (1995).
  36. Araujo, C. C., Leon, L. L. Biological activities of Curcuma longa L. Mem Inst Oswaldo Cruz. 96, 723-728 (2001).
  37. Lim, T. G., et al. Curcumin suppresses proliferation of colon cancer cells by targeting CDK2. Cancer Prev Res (Phila). 7, 466-474 (2014).
  38. Ringman, J. M., Frautschy, S. A., Cole, G. M., Masterman, D. L., Cummings, J. L. A potential role of the curry spice curcumin in Alzheimer's disease. Curr Alzheimer Res. 2, 131-136 (2005).
  39. Li, H., et al. Lithium chloride suppresses colorectal cancer cell survival and proliferation through ROS/GSK-3beta/NF-kappaB signaling pathway. Oxid Med Cell Longev. , 241864(2014).
  40. Forlenza, O. V., De-Paula, V. J., Diniz, B. S. Neuroprotective effects of lithium: implications for the treatment of Alzheimer's disease and related neurodegenerative disorders. ACS Chem Neurosci. 5, 443-450 (2014).
  41. Noble, W., et al. Inhibition of glycogen synthase kinase-3 by lithium correlates with reduced tauopathy and degeneration in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 6990-6995 (2005).
  42. Perez, M., Hernandez, F., Lim, F., Diaz-Nido, J., Avila, J. Chronic lithium treatment decreases mutant tau protein aggregation in a transgenic mouse model. J Alzheimers Dis. 5, 301-308 (2003).
  43. Engel, T., Goni-Oliver, P., Lucas, J. J., Avila, J., Hernandez, F. Chronic lithium administration to FTDP-17 tau and GSK-3beta overexpressing mice prevents tau hyperphosphorylation and neurofibrillary tangle formation, but pre-formed neurofibrillary tangles do not revert. J Neurochem. 99, 1445-1455 (2006).
  44. Caccamo, A., Oddo, S., Tran, L. X., LaFerla, F. M. Lithium reduces tau phosphorylation but not A beta or working memory deficits in a transgenic model with both plaques and tangles. Am J Pathol. 170, 1669-1675 (2007).
  45. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
  46. Gupta, K. K., Bharne, S. S., Rathinasamy, K., Naik, N. R., Panda, D. Dietary antioxidant curcumin inhibits microtubule assembly through tubulin binding. FEBS J. 273, 5320-5332 (2006).
  47. Lee, J. W., Park, S., Kim, S. Y., Um, S. H., Moon, E. Y. Curcumin hampers the antitumor effect of vinblastine via the inhibition of microtubule dynamics and mitochondrial membrane potential in HeLa cervical cancer cells. Phytomedicine. 23, 705-713 (2016).
  48. Liu, F., et al. Site-specific effects of tau phosphorylation on its microtubule assembly activity and self-aggregation. Eur J Neurosci. 26, 3429-3436 (2007).
  49. Sultan, A., et al. Nuclear tau, a key player in neuronal DNA protection. J Biol Chem. 286, 4566-4575 (2011).
  50. Bukar Maina, M., Al-Hilaly, Y. K., Serpell, L. C. Nuclear Tau and Its Potential Role in Alzheimer's Disease. Biomolecules. 6, 9(2016).
  51. Dumontet, C., Jordan, M. A. Microtubule-binding agents: a dynamic field of cancer therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 9, 790-803 (2010).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este artículo de JoVE

Solicitar permiso

Etiquetas

Fosforilaci n de tauLocalizaci n de tauMicroscop a confocalWestern blotEnsayo de fosfatasaInmunohistoqu micaTratamiento con curcuminaCloruro de litio

Artículos relacionados