Ensayo para la fosforilación y Microtubule obligatorios junto con la localización de la proteína Tau en células de cáncer colorrectal

Resumen

Este manuscrito describe protocolos estándar para la medición de la hiperfosforilación de tau, medición de enlace de tau a los microtúbulos y la localización de tau intracelular después de tratamientos con fármacos. Estos protocolos pueden utilizarse repetidamente para la detección de drogas u otros compuestos que enlace la hiperfosforilación o microtúbulos tau.

Resumen

La proteína asociada a microtúbulos tau es una proteína neuronal que se localiza sobre todo en los axones. Generalmente tau es esencial para el funcionamiento neuronal normal porque está implicada en la estabilización y el montaje del microtubule. Además de las neuronas, tau se expresa en mama, próstata, gástrica, colorrectal y los cánceres de páncreas donde se muestra la estructura casi similar y ejerce funciones similares como el tau neuronal. La cantidad de tau y su fosforilación puede cambiar su función como estabilizador de microtúbulos y conducir al desarrollo de filamentos helicoidales apareados en trastornos neurodegenerativos diferentes, como la enfermedad de Alzheimer. Es importante determinar el estado de fosforilación de tau y sus características de unión a microtúbulos. Además, examinar la localización intracelular de tau es importante en diferentes enfermedades. Este manuscrito detalles protocolos estándar para la medición de la fosforilación de tau y de la Unión de tau a los microtúbulos en las células de cáncer colorrectal con o sin tratamiento de LiCl y curcumina. Estos tratamientos pueden utilizarse para detener el desarrollo y proliferación de células de cáncer. Localización intracelular del tau se examina mediante el uso de inmunohistoquímica y microscopía confocal durante el uso de bajas cantidades de anticuerpos. Estos ensayos pueden usarse repetidamente para la detección de compuestos que afectan la hiperfosforilación de tau o atascamiento de microtúbulos. Terapéutica de la novela utiliza para diferentes Tauopatías o relacionados con agentes anticancerígenos potencialmente pueden ser caracterizados mediante estos protocolos.

Introducción

Tau fue identificado originalmente como una proteína asociada a microtúbulos estables al calor que fue co purificada con tubulina¹. Tau se expresa exclusivamente en eucariotas superiores^2,de^3,4. La función principal del tau es controlar microtúbulos Asamblea^1,5,6. También contribuye a la polimerización de microtúbulos⁷, transporte axonal⁸, cambios en el diámetro axonal⁹, formación de polar....

Protocolo

1. preparación de los reactivos

1. añadir 10 μl de solución de fluoruro de phenylmethylsulfonyl (1 mM), 10 μl (1 x de acción x 100) de solución Cóctel de inhibidor de la proteasa y 10 μl (1 x de acción x 100) de fosfatasa solución coctel inhibidor a 1 mL de tampón de ensayo (RIPA) x radioimmunoprecipitation 1 preparar el buffer de lisis RIPA completo.
2. Prepare 10 x buffer de buffer (PEM) de tubulina general.
   1. Add 800 mM (6,0474 g) piperazina-N-N ' - bis - 2-(n-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-ácido ácido, 10 mM (95,1 mg) glicol de etileno-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N ', N '-tetraacético de ácido, 10 mM (51 mg) MgCl ....

Resultados

Expresión de tau total y fosfo-tau fue examinado después de tratar las células con diferentes concentraciones de curcumina o LiCl (figura 1). Tratamiento de células con las tres concentraciones diferentes de la curcumina disminuye los niveles de expresión de tau; expresión de fosfo-tau aumentó sobre el tratamiento con baja concentración de curcumina pero disminuyó al tratar las células con concentraciones más altas de la curcumina. Anti-fosfo-tau (Ser396) fue.......

Discusión

Este manuscrito establece diferentes condiciones procedimentales para la detección de tau total y fosforila tau en células de cáncer colorrectal tratados con curcumina y LiCl. Para evaluar el estado global de la fosforilación de tau en las muestras de proteína, un ensayo de fosfatasa fue descrito. Este ensayo se puede potencialmente utilizar para examinar el estado de fosforilación de alguna proteína.

Este ensayo se basa en el principio de que fosforila la proteína se mueve más lento que su es.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
HCT 116 celdas	ATCC	CCL-247
MEM (EBSS)	Hyclone	SH30024.01
Suero fetal bovino (FBS)	ThermoFisher (Gibco)	16000044	Tienda en -20 ° C
penicilina-estreptomicina	Hyclone	SV30010
Solución de tripsina-EDTA	WelGene	LS 015-01
Plato de 100 mm	Corning	430161
placa de 6 pocillos	Corning	Coster 3516
Anti-Tau 13 anticuerpo ABCAM	AB19030
Ditiotreitol (DTT)	Roche	10 708 984 001	Temperatura de almacenamiento 2– 8 ° C
Centrífugas de microlitros	Hettich Zentrifugen	MIKRO 200 R
Paclitaxel	Sigma-Aldrich	T1912	Temperatura de almacenamiento 2– 8 ° C
Curcumina	Sigma-Aldrich (Fluka)	78246	Temperatura de almacenamiento 2– 8 ° C
Microtúbulos (MT)	Citoesqueleto	MT001	Almacenar a 4 & deg; C (desecado)
Medio de montaje con DAPI	Vector Laboratories	H-1200	Almacene a 4 & grados; C en la oscuridad
Hidróxido de sodio	Sigma	72068
Cloruro de magnesio	Sigma-Aldrich	M2670
GTP	Sigma-Aldrich	G8877	Almacenar en -20 & grados; C
DPBS	WelGene	LB 001-02
Desmembrador sónico	Fisher Scientific	Model 500
Ultracentrífuga	Beckman Coulter	Optima L-100 XP
PIPES	Sigma	P1851
Albúmina sérica bovina (BSA)	Sigma	A7906
Generador de imágenes moleculares	Bio-Rad	ChemiDoc XRS+	Tienda a 4 & grados; C
Reactivo colorante para ensayo de proteínas	Bio-Rad	500-0006
α-tubulina (11H10) Señalización de células mAb		de conejo 2125
GAPDH (14C10) Señalización de células mAb de conejo		2118
Anticuerpo anti-Tau (fosfo S396)	abcam ab109390
EGTA	Sigma	E3889	Almacenar a temperatura ambiente
FastAP Fosfatasa alcalina termosensible	Thermo Scientific	EF0651	Almacenar a -20 & grados; C
PMSF	Sigma	P7626	Almacenar a temperatura ambiente
Inhibidor de fosfatasa Cóctel Señalización	celular	5870	Almacenar a 4 & grados;
C Inhibidor de la proteasa cóctel	de señalización celular	5871	Almacenar a 4 & deg; C
RIPA Buffer	Sigma	R 0278	Temperatura de almacenamiento 2– 8 ° C
Tau-352 humano	Sigma	T 9950	Tienda a -20 ° C
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X - 100	Tienda alrededor de 25 ° C
Membrana de PVDF	Bio-Rad	162-0177
Anticuerpo secundario IgG anti-ratón de cabra	ThermoFisher	A-11005	Almacenar en 4 ° C en la oscuridad
Microscopía confocal	Leica Microsystem Leica	TCS SP5
Dodecil Sulfato de Sodio (SDS)	Affymetrix	75819
Ensayo de proteínas Bio-Rad		500-0006	Almacenar a 4 & grados; C