Mejorar la aplicación de la amina de biotinilado dextrano de alto peso Molecular para la proyección de talamocorticales remontar en la rata

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo refinado para revelar con eficacia biotinilado amina de dextrano (BDA) etiquetado con un fluorescente tinción a través de una vía neural recíproca. Es conveniente para el análisis de la estructura fina de la BDA de etiquetado y distinguirlo de otros elementos neurales en un láser confocal de barrido microscopio.

Resumen

Amina de alto peso molecular biotinilado dextrano (BDA) se ha utilizado como trazador neuroanatomical altamente sensible para muchas décadas. Puesto que la calidad de su etiqueta fue afectada por diversos factores, aquí ofrecemos un refinado protocolo para la aplicación de alto peso molecular BDA para el estudio de etiquetado neuronal óptima en el sistema nervioso central. Después de la inyección estereotáxica de BDA en el núcleo ventral posteromedial (VPM) del tálamo en la rata a través de una pipeta de vidrio delicado, BDA fue manchado con estreptavidina fluorescente-Alexa (AF) 594 y contratinción con tinción de Nissl fluorescente AF500/525. En el fondo del verde de la tinción de Nissl, el etiquetado de BDA rojo, incluyendo cuerpos de células neuronales y terminales axonales, se demostró más claramente en la corteza somatosensorial. Además, doble coloración fluorescente para el BDA y el calcio-que ata la proteína parvalbúmina (PV) se llevó a cabo para observar la correlación de BDA etiquetado y interneurons PV-positivo en el destino cortical, brindando la oportunidad de estudiar al local neural circuitos y sus características químicas. Por lo tanto, este método refinado no sólo es adecuado para la visualización de alta calidad neuronal etiquetado con peso molecular alto BDA a través de vías neuronales recíprocos entre el tálamo y la corteza cerebral, pero también permitirá la demostración simultánea de otros marcadores neuronales con histoquímica fluorescente o inmunoquímica.

Introducción

Alto peso molecular BDA (peso molecular 10.000), un palpador muy sensible, se ha utilizado para rastrear las vías nerviosas en sistema nervioso central para más de 20 años¹. Aunque el uso de la AOE es un tracto neuronal comun técnica de rastreo, la calidad de la BDA de etiquetado puede ser afectada por varios factores^1,2,3en animales. Nuestro reciente estudio indica que la estructura óptima de BDA etiquetado no sólo asociada con un tiempo de supervivencia después de la inyección adecuada, sino también correlacionan con la tinción del método⁴. Hasta ahora, convencional complejo avidina-biotina-peroxidasa (ABC), estreptavidina-fluoresceína isotiocianato y estreptavidina-AF594 métodos de tinción fueron utilizados para revelar el etiquetado BDA en anteriores estudios^{2,3, 4,5}. En comparación, tinción fluorescente para BDA puede realizar fácilmente.

Con el fin de ampliar la aplicación de alto peso molecular BDA, un refinado protocolo fue introducido en el presente estudio. Después de la inyección de BDA en el VPM del tálamo en el cerebro de la rata, BDA etiquetado fue revelado por el método regular de tinción estándar de ABC así como manchando de doble fluorescente, que se llevó a cabo para observar la correlación de BDA etiquetado y básico elementos neurales o interneuronas en el destino cortical con estreptavidina AF594 e histoquímica fluorescente de Nissl o biopsia de PV, respectivamente. A través de las vías neuronales recíprocas entre el VPM y la corteza somatosensorial primaria (S1)^6,7,8, centramos nuestra observación en BDA etiquetado talamocorticales proyectadas axones y corticothalamic Soma celular proyectada en el S1. Por este proceso, espera que no sólo un protocolo detallado para la obtención de la alta calidad de etiquetado nervios con alto peso molecular BDA, sino también un protocolo de refinado en la combinación de fluorescentes BDA etiquetado y otros marcadores neuronales fluorescentes con histoquímica o inmunoquímica. Este enfoque es preferible para el estudio de los circuitos neuronales locales y sus características químicas bajo un láser confocal de barrido microscopía.

Protocolo

Este estudio fue aprobado por el Comité de ética en la Academia China de China médica Ciencias (número de referencia 20160014). Todos los procedimientos se llevaron a cabo según los institutos nacionales de salud guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio (National Academy Press, Washington, D.C., 1996). Cuatro ratas macho adultas (250-280 g de peso) fueron utilizadas en este estudio. Todos los animales fueron alojados en un ciclo de luz/oscuridad de 12 h con temperatura y humedad controladas y permitió libre acceso a alimentos y agua. Los instrumentos y materiales utilizados en el presente estudio se mostraron en la figura 1.  Antes de la cirugía, todos los instrumentos, tales como marco estereotáxicas y pipeta de cristal, se limpiaron con etanol al 70%.

1. cirugías

1. Determinar el área de coordenadas de interés en VPM utilizando un atlas estereotáxicas⁹ (figura 2A).
2. Preparar una μL 1 micro-jeringa equipada con una micropipeta de vidrio (con un diámetro de punta de aproximadamente 10-20 μm) (figura 1) y lo prueba con parafina líquida.
3. Anestesiar las ratas con hidrato de cloral de 7% (0,7 mL/100 g) por inyección intraperitoneal.
4. Una vez confirmada la anestesia profunda con cola pellizcar y reflejo de retirada del pedal, afeitarse la parte superior de la cabeza del animal con una afeitadora eléctrica y frote el sitio quirúrgico 3 veces con yodo povidona 10% seguido de etanol al 70% respectivamente.
5. Colocar la rata en el dispositivo estereotáxicas colocando barras de oído embotado en los oídos y coloque incisivos superiores de la rata en el soporte de la boca (Figura 1E) y luego aplicar pomada oftálmica en los ojos.
6. Limpiar la piel de la cabeza del sitio quirúrgico con etanol al 70%. Usar guantes quirúrgicos estériles y toallas para la cirugía en condiciones estériles.
7. Haga una incisión sagital en la piel con un bisturí a lo largo de la sutura sagital (Figura 1F).
8. Raspe el músculo y el periostio del cráneo mediante aplicadores con punta de algodón estériles a lo largo de la cirugía para control de hemorragia (Figura 1F).
9. Utilizando coordenadas predefinidas de un atlas (figura 2A), determinar la ubicación (punto de vértice de-3,30 mm, derecho de 2,6 mm a la línea media) de la craneotomía (figura 1).
10. Realizar una craneotomía con un taladro fresa con un poco de punta redonda (#106) (figura 1 H) y seguir perforando a una profundidad de 1 mm en pocos minutos hasta llegar a las meninges (figura 1I).
11. Suprimir la duramadre mediante microfórceps para exponer la corteza cerebral sobre el sitio de la inyección (figura 1I).
12. Cambio de parafina líquida en la micro jeringa con solución al 10% BDA (10.000 peso molecular, en agua destilada) (Figura 1J).
13. Montar la jeringa dentro del aparato de microinyección y conectar con una micro bomba (figura 1 K).
    Nota: El volumen inyectado depende de la velocidad de la bomba de micro. Aquí se ajustó a 30 nL/min (figura 1 L).
14. Bajo un estereomicroscopio, inserte una micropipeta de vidrio manualmente con el aparato de microinyección en el VPM a través de la superficie cortical del cerebro en la profundidad de 5,8 mm (figura 1 M).
15. Inyectar a presión una 100 nL 10% BDA en el VPM durante un período de 3 minutos (35 nL/min) con una micro bomba (figura 1 L, M).
16. Después de la inyección, la pipeta colocar en un adicional 5 minutos y luego retirar lentamente.
17. La sutura la herida con hilo estéril (figura 1N). Siga sus directrices del Comité de cuidado de los animales locales para analgesia pre y post quirúrgica.
18. Colocar la rata en un área de recuperación de calor hasta que recupera la conciencia y se recuperó completamente.
19. Regrese la rata recuperada a su jaula.

2. perfusiones y secciones

1. Después de un tiempo de supervivencia por lo general de 10 días, inyectar el animal con una sobredosis de uretano 10% (2 mL/100 g) por inyección intraperitoneal para inducir la eutanasia.
2. Inundar las ratas experimentales en la campana (figura 1O).
   1. Una vez que la respiración se detiene, usando tijeras y pinzas, abrir la cavidad torácica de la rata a pleno. Insertar un catéter intravenoso en el ventrículo izquierdo hacia la aorta y luego la aurícula derecha.
   2. Primera perfusión con 0.9% con tampón fosfato salino (PBS) a temperatura fisiológica (37 º C) alrededor de 1-2 minutos hasta que la sangre sale del corazón es claro y luego continuar con paraformaldehído al de 4% de 250-300 mL en tampón de fosfato de 0,1 M (PB, pH 7,4).
3. Después de la perfusión, haga una incisión en la piel de la cabeza y abrir el cráneo y luego disecar hacia fuera el cerebro de la rata. Después fije el cerebro disecado en paraformaldehído al 4% durante 2 h a temperatura ambiente (26 ° C), entonces cryoprotect en sacarosa al 30% en PBS de 0,1 M (pH 7,4) durante 3 días a 4 ° C hasta que el cerebro se encuentra inmerso en la solución (figura 1 P).
4. Una vez que el cerebro se sumerge en la solución, dividir el cerebro en tres bloques en dirección coronal en las matrices del cerebro (figura 1Q). El bloque central contiene el VPM y S1.
5. Cortar el bloque central del cerebro en 40 μm en un escenario de congelación sistema micrótomo en dirección coronal de desplazamiento. Recoger estas secciones ordenadamente en un plato de 6 pocillos con PBS de 0,1 M (pH 7,4) (figuras 1R, S).

3. estándar ABC tinción

Nota: Tramos libres flotantes de cada tercera sección coronal del cerebro fueron utilizados para la visualización de la BDA de etiquetado estándar ABC procedimiento¹⁰.

1. Enjuague las secciones en PBS de 0,1 M durante aproximadamente 1 minuto.
2. Incubar las secciones en solución al 1% ABC en PB 0.1m (pH 7.4) que contiene 0.3% Tritón X-100 por 1 h a temperatura ambiente.
3. Lávese las secciones tres veces en tampón de Tris 50 mM (pH 7,4).
4. Mancha de las secciones en una solución que contiene 0,02% 3, tetrahydrochloride 3'-diaminobenzidina (DAB) y 0.01% H₂O₂ en 50 mM de tampón Tris para unos 2-5 min a temperatura ambiente.
5. Lávese las secciones tres veces en tampón de Tris 50 mM (pH 7,4).
6. Monte las secciones sobre portaobjetos utilizando técnicas histoquímicas estándar (figura 1T; véase Suplemento Video archivo III, secciones y perfusión).
7. Secar las secciones en el aire durante la noche a temperatura ambiente.
8. Deshidrate las secciones brevemente en una serie de soluciones de alcohol (50%, 70%, 95%, 100%). Sumerja los portaobjetos en cada solución por cerca de 15 s. No permita que el portaobjetos se seque entre cada paso.
9. Claro las secciones en xileno tres veces, aproximadamente 20 minutos.
10. Poner 2 o 3 gotas de bálsamo en las rebanadas y colocar el cubreobjetos sobre las secciones.

4. doble coloración fluorescente para el BDA y elementos neurales en la corteza Cerebral

Nota: en cambio, la tinción fluorescente doble se llevó a cabo para observar la correlación de BDA etiquetado y elementos neurales básicos en las secciones adyacentes a la anterior con estreptavidina AF594 y contratinción con tinción de Nissl fluorescente AF500/525.

1. Enjuague las secciones en PBS de 0,1 M durante aproximadamente 1 minuto.
2. Incubar las secciones en una solución mixta de estreptavidina-AF594 (1: 500) y AF500/525 verde fluorescente tinción de Nissl (1:1, 000) en PBS de 0,1 M (pH 7,4) con 0.3% Tritón X-100 por 2 h a temperatura ambiente.
3. Lávese las secciones tres veces en PB 0.1m (pH 7.4).
4. Monte las secciones sobre portaobjetos utilizando técnicas histoquímicas convencionales. Secar las secciones en el aire durante aproximadamente 1 hora.
5. Cubreobjetos se aplican a las secciones fluorescentes con glicerina 50% en agua destilada antes de observación.

5. doble coloración fluorescente para el BDA e interneuronas en la corteza Cerebral

Nota: Doble tinción fluorescente se llevó a cabo para observar la correlación de BDA etiquetado e interneuronas en las secciones representativas en el destino cortical con estreptavidina AF594 y PV-inmunoquímica.

1. Enjuague las secciones representativas en PBS de 0,1 M (pH 7,4) durante aproximadamente 1 minuto.
2. Incubar las secciones en una solución de bloqueo que contiene suero de cabra normal 3% y 0.3% Tritón X-100 en PBS de 0,1 M durante 30 minutos.
3. Transferencia de las secciones en una solución de monoclonal mouse anti-PV IgG (1:1, 000) en 0.1 M PBS (pH 7.4) que contiene suero de cabra normal 1% y 0.3% Tritón X-100 para pasar la noche a 4 ° C.
4. Al día siguiente, lavar las secciones tres veces en PBS de 0,1 M (pH 7,4).
5. Exponer las secciones a una solución mixta de anticuerpo secundario de cabra anti-ratón anti-AF488 (1: 500), estreptavidina-AF594 (1: 500) y 4', diclorhidrato 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 1:40, 000) en el suero de cabra normal de 0,1 M PBS (pH 7.4) que contienen 1% y 0,3% de Triton X-100 para 1 h.
6. Repita los pasos 4.3 a 4.5.

6. observación

1. Tomar imágenes de las VPM, talamocorticales axones y neuronas corticothalamic.
   1. Observar las muestras fluorescentes con un sistema de imagen confocal equipado con lentes objetivos (4 x, NA: 0.13; 10 x, NA: 0.40; y 40 x, NA: 0,95). Utilizar longitudes de onda de excitación y de emisión de 405 488 (azul), (verde) y 559 nm (rojo).
      Nota: Aquí, el agujero de alfiler confocal es 152 μm (4 x, 10 x) y 105 (40 x). La resolución espacial de captura de la imagen es de 1024 × 1024 píxeles (4 x, 10 x) y 640 × 640 píxeles (40 x).
   2. Tomar veinte imágenes en fotogramas sucesivos de 2 μm de cada sección en el grueso del μm 40 (serie Z).
   3. Integrar las imágenes en una sola imagen en foco la imagen confocal, sistema de software para el análisis tridimensional de las siguientes: set Inicio plano focal → set Final plano focal → set paso tamaño → elegir profundidad patrón → imagen captura → Z serie.
2. Tomar imágenes trasmitida por un microscopio óptico equipado con una cámara digital (4 x, NA: 0.13; 10 x, NA: 0.40; y 40 x, NA: lentes de 0,95). Utilice un tiempo de exposición de la Sra. 500 uso de edición de fotos software para ajustar el brillo y el contraste de las imágenes y añadir etiquetas.

Resultados

Supervivencia de 10 días después de la inyección de BDA en el VPM fue suficiente para producir intenso neuronal de etiquetado en las correspondientes áreas corticales ipsolateral al lado de inyección (figura 2). ABC convencional y fluorescente procedimientos de tinción para BDA revelaron el patrón similar de nervios de etiquetado en el S1, incluyendo anterogradely etiquetado axones talamocorticales y etiquetada retrogradely corticothalamic neuronas (

Discusión

Seleccionar un palpador apropiado es un paso crítico para un experimento de éxito seguimiento neural. En la familia de la BDA, alto peso molecular BDA (10.000 peso molecular) se recomienda preferentemente transportarse a través de la vía neural anterograde en contraste con bajo peso molecular BDA (3.000 peso molecular)^{2,3 , 11 , 12 , 13}. sin embargo, muchos es...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Amina de dextrano biotinilada (BDA)	Sondas moleculares	D1956	10.000 peso molecular
Estreptavidina-Alexa Fluor 594	Sondas moleculares	S32356	Proteger de la luz
500/525 verde fluorescente tinción de Nissl	Sondas moleculares	N21480	Proteger de la luz
Instrumento de estereotaxis cerebral	Narishige	SR-50
Microtomo de congelación	Thermo	Microm International GmbH
Confocal Imaging	Sistema
Micro Drill	Saeyang Microtech	Marathon-N7
Sprague Dawley	Institute of Laboratory Animal Sciences, Academia China de Ciencias Médicas	SCKX (JUN) 2012-004
ABC Kit	Vector Laboratories	PK-4000
superfrost plus portaobjetos de microscopio	Thermo	#4951PLUS-001	25x75x1mm
Photoshop e Ilustración	Adobe	CS5