Aquí, presentamos un protocolo refinado para revelar con eficacia biotinilado amina de dextrano (BDA) etiquetado con un fluorescente tinción a través de una vía neural recíproca. Es conveniente para el análisis de la estructura fina de la BDA de etiquetado y distinguirlo de otros elementos neurales en un láser confocal de barrido microscopio.
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Artículo de método
Mejorar la aplicación de la amina de biotinilado dextrano de alto peso Molecular para la proyección de talamocorticales remontar en la rata
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Resumen
Resumen
Amina de alto peso molecular biotinilado dextrano (BDA) se ha utilizado como trazador neuroanatomical altamente sensible para muchas décadas. Puesto que la calidad de su etiqueta fue afectada por diversos factores, aquí ofrecemos un refinado protocolo para la aplicación de alto peso molecular BDA para el estudio de etiquetado neuronal óptima en el sistema nervioso central. Después de la inyección estereotáxica de BDA en el núcleo ventral posteromedial (VPM) del tálamo en la rata a través de una pipeta de vidrio delicado, BDA fue manchado con estreptavidina fluorescente-Alexa (AF) 594 y contratinción con tinción de Nissl fluorescente AF500/525. En el fondo del verde de la tinción de Nissl, el etiquetado de BDA rojo, incluyendo cuerpos de células neuronales y terminales axonales, se demostró más claramente en la corteza somatosensorial. Además, doble coloración fluorescente para el BDA y el calcio-que ata la proteína parvalbúmina (PV) se llevó a cabo para observar la correlación de BDA etiquetado y interneurons PV-positivo en el destino cortical, brindando la oportunidad de estudiar al local neural circuitos y sus características químicas. Por lo tanto, este método refinado no sólo es adecuado para la visualización de alta calidad neuronal etiquetado con peso molecular alto BDA a través de vías neuronales recíprocos entre el tálamo y la corteza cerebral, pero también permitirá la demostración simultánea de otros marcadores neuronales con histoquímica fluorescente o inmunoquímica.
Introducción
Alto peso molecular BDA (peso molecular 10.000), un palpador muy sensible, se ha utilizado para rastrear las vías nerviosas en sistema nervioso central para más de 20 años1. Aunque el uso de la AOE es un tracto neuronal comun técnica de rastreo, la calidad de la BDA de etiquetado puede ser afectada por varios factores1,2,3en animales. Nuestro reciente estudio indica que la estructura óptima de BDA etiquetado no sólo asociada con un tiempo de supervivencia después de la inyección adecuada, sino también correlacionan con la tinción del método
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Protocolo
Este estudio fue aprobado por el Comité de ética en la Academia China de China médica Ciencias (número de referencia 20160014). Todos los procedimientos se llevaron a cabo según los institutos nacionales de salud guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio (National Academy Press, Washington, D.C., 1996). Cuatro ratas macho adultas (250-280 g de peso) fueron utilizadas en este estudio. Todos los animales fueron alojados en un ciclo de luz/oscuridad de 12 h con temperatura y humedad controladas y permitió libre acceso a alimentos y agua. Los instrumentos y materiales utilizados en el presente estudio se mostraron en la figura 1. ....
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Resultados
Supervivencia de 10 días después de la inyección de BDA en el VPM fue suficiente para producir intenso neuronal de etiquetado en las correspondientes áreas corticales ipsolateral al lado de inyección (figura 2). ABC convencional y fluorescente procedimientos de tinción para BDA revelaron el patrón similar de nervios de etiquetado en el S1, incluyendo anterogradely etiquetado axones talamocorticales y etiquetada retrogradely corticothalamic neuronas (
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Discusión
Seleccionar un palpador apropiado es un paso crítico para un experimento de éxito seguimiento neural. En la familia de la BDA, alto peso molecular BDA (10.000 peso molecular) se recomienda preferentemente transportarse a través de la vía neural anterograde en contraste con bajo peso molecular BDA (3.000 peso molecular)2,3 , 11 , 12 , 13. sin embargo, muchos es.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este estudio fue financiado por la nacional Ciencias naturales Fundación de China (proyecto Código Nº 81373557, Nº 81403327).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Amina de dextrano biotinilada (BDA) | Sondas moleculares | D1956 | 10.000 peso molecular |
| Estreptavidina-Alexa Fluor 594 | Sondas moleculares | S32356 | Proteger de la luz |
| 500/525 verde fluorescente tinción de Nissl | Sondas moleculares | N21480 | Proteger de la luz |
| Instrumento de estereotaxis cerebral | Narishige | SR-50 | |
| Microtomo de congelación | Thermo | Microm International GmbH | |
| Confocal Imaging | Sistema | ||
| Micro Drill | Saeyang Microtech | Marathon-N7 | |
| Sprague Dawley | Institute of Laboratory Animal Sciences, Academia China de Ciencias Médicas | SCKX (JUN) 2012-004 | |
| ABC Kit | Vector Laboratories | PK-4000 | |
| superfrost plus portaobjetos de microscopio | Thermo | #4951PLUS-001 | 25x75x1mm |
| Photoshop e Ilustración | Adobe | CS5 |
Referencias
- Veenman, C. L., Reiner, A., Honig, M. G. Biotinylated dextran amine as an anterograde tracer for single- and double-labeling studies. J Neurosci Methods. 41, 239-254 (1992).
- Reiner, A., Veenman, C. L., Medina, L., Jiao, Y., Del Mar, N., Honig, M. G. Pathway tracing....
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Reimpresiones y permisos
