UN<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Ensayo de aversión al cobre basado en el estado nutricional

Resumen

Aquí, presentamos un ensayo específico de Caenorhabditis elegans diseñado para evaluar los cambios en el comportamiento de aversión al cobre y la capacidad de localizar una fuente de alimento común, a medida que el organismo progresa de un estado nutricional bien alimentado a hambriento.

Resumen

Para garantizar la supervivencia, los organismos deben ser capaces de evitar los hábitats desfavorables al tiempo que garantizan una fuente de alimento consistente. Caenorhabditis elegans alteran sus patrones locomotores tras la detección de diversos estímulos ambientales y pueden modular su conjunto de respuestas conductuales en respuesta a las condiciones de hambre. Los nematodos presentan típicamente una respuesta aversiva disminuida cuando se eliminan de una fuente de alimento durante más de 30 min. La observación de los cambios de comportamiento en respuesta a un estado nutricional cambiante puede proporcionar una visión de los mecanismos que regulan la transición de un estado bien alimentado a un estado de hambre.

Hemos desarrollado un ensayo que mide la capacidad de un nematodo para atravesar una barrera aversiva ( es decir, cobre) y luego alcanzar una fuente de alimento durante un período prolongado de tiempo. Este protocolo se basa en el trabajo previo mediante la integración de múltiples variables de una manera que permite la continua recogida de datos a medida que los organismos se desplazan hacia unN cada vez más hambre. Además, este ensayo permite un aumento del tamaño de la muestra de modo que pueden evaluarse simultáneamente poblaciones mayores de nematodos.

Organismos defectuosos para la capacidad de detectar o responder al cobre inmediatamente cruzar la barrera química, mientras que los nematodos de tipo salvaje son inicialmente repelidos. Como gusanos de tipo silvestre son cada vez más hambre, comienzan a cruzar la barrera y llegar a la fuente de alimentos. Hemos diseñado este ensayo para evaluar un mutante que es incapaz de responder a diversas señales ambientales, incluyendo la sensación de alimentos o la detección de productos químicos aversivos. Cuando se evaluaron a través de este protocolo, los organismos defectuosos cruzaron inmediatamente la barrera, pero también fueron incapaces de detectar una fuente de alimento. Por lo tanto, estos mutantes cruzan repetidamente la barrera química a pesar de llegar temporalmente a una fuente de alimento. Este ensayo puede probar directamente las poblaciones de gusanos para evaluar los posibles defectos de la vía relacionados con la aversión y la inanición.

Introducción

Caenorhabditis elegans se ha utilizado como modelo para el estudio de la neurobiología durante décadas debido a la relativa facilidad en el análisis de los circuitos de un sistema nervioso compuesto por sólo 302 neuronas [ ^1] . Siempre que el organismo dependa de responder a señales ambientales, gran parte del sistema nervioso se dedica a regular la integración de las señales ambientales ² . A pesar de la simplicidad de su sistema nervioso, C. elegans puede detectar y responder a diversas señales ambientales incluyendo repelentes ³ , atrayentes ⁴ , temperatura ⁵ e incluso humedad ⁶ . Un fallo para integrar adecuadamente las señales ambientales se ha relacionado con una serie de trastornos del comportamiento y condiciones neurodegenerativas en los sistemas modelo de mamíferos [ ^{7 - 9]} . Con una gama de modelos disponibles de enfermedad neural ¹⁰ en C. elegans y el desarrollo de pantallas farmacéuticas de nematodos ¹¹ , este organismo ha demostrado ser un sistema útil para el estudio de la neurobiología. Dada la disponibilidad de un nematodo asignado ¹ y de mutaciones a casi todos los genes del nematodo genoma ¹² , nuestra comprensión del sistema nervioso de los nematodos, y por extensión nuestra, está parcialmente limitada por el diseño de ensayos creativamente apropiados.

Se han desarrollado varios ensayos de quimiotaxis durante los últimos 40 años para evaluar la respuesta de los nematodos a diversos estímulos aversivos ^{3 , 4 , 13 , 14 , 15} . La experimentación inicial implicó la introducción de un estímulo ambiental agudo mientras que un solo gusano vagaba sobre una placa de agar= "Xref"> 3 ^{, 14 , 16} . Se registraron cambios inmediatos en las respuestas locomotoras. Por ejemplo, el octanol odorante volátil puede aplicarse a un cabello y ponerse delante de la nariz de un nematodo para estimular el inicio de la locomoción hacia atrás en gusanos de tipo salvaje [ ^17] . También se han desarrollado ensayos más complejos para incorporar múltiples variables como medio de evaluar la elección del comportamiento ¹⁸ . Una variación de este ensayo implica el uso de una solución de cobre para crear una barrera aversiva de la línea media ⁴ . Un atrayente, es decir, diacetil, se colocó en un lado de la barrera química con gusanos transferidos lejos de la fuente de diacetilo. Los gusanos defectuosos para las respuestas de aversión al cobre cruzaron inmediatamente la barrera para alcanzar el diacetilo, mientras que los gusanos de tipo silvestre fueron repelidos inicialmente por la barrera. Las respuestas fueron anotadas cuando los gusanos se acercaron por primera vez a la barrera de cobreSin observaciones a largo plazo.

Cuando los gusanos son evaluados después de sufrir condiciones de inanición, su sensibilidad a los estímulos ambientales se reduce ¹⁹ . Cuando el octanol químico aversivo se deposita frente a la nariz del nematodo, los organismos de tipo silvestre estimulan el movimiento hacia atrás dentro de 3-5 s cuando se alimentan. Después de que estos organismos se han retirado de los alimentos durante 10 min, que muestran una respuesta tardía de 8 - 10 s ²⁰ . Por lo tanto, con el aumento de la inanición, los nematodos muestran una menor respuesta aversiva a las señales ambientales perjudiciales como la búsqueda de alimentos se vuelve más esencial para la supervivencia. Por el contrario, los nematodos que sobreexpresan el receptor neuropéptido 9 ( npr-9) , no responden al octanol en o fuera de los alimentos y muestran una incapacidad para responder a una serie de estímulos aversivos [ ^21] . Estos organismos npr-9 (GF) también no modulan su frecuencia de inversión en presencia de alimento, pero puedenInversa en respuesta a los estímulos de tacto áspero que indica que son capaces de locomoción hacia atrás ²¹ . También hemos evaluado mutantes npr-9 (LF) dado que exhiben una frecuencia anormalmente baja de inversión de la comida, sin embargo, puede modular su comportamiento en la presencia de alimentos [ ^21] . El acoplamiento del estado nutricional del gusano con la introducción de estímulos externos agudos ha ayudado a dilucidar los mecanismos por los cuales una vía alimentaria puede modular ampliamente las vías de señalización sensorial ^{22 , 23} . La presencia de alimentos en el medio ambiente de nematodos también se ha utilizado para evaluar las respuestas de abstinencia de etanol [ ^24] . En este experimento, los gusanos se incubaron en diversas concentraciones de etanol y luego se colocaron en una placa de agar con un parche de alimento conocido como un "ensayo de raza alimentaria". El parche de alimentos se colocó en un borde de la placa, mientras que los nematodos wSe colocan lejos de la fuente de alimento. La retirada de etanol se evaluó midiendo la duración del tiempo requerido para que los gusanos alcanzaran el parche de alimento.

Este ensayo de aversión al cobre basado en la nutrición se basa en el ensayo de raza alimentaria para integrar variables ambientales adicionales, a saber, alimentos y cobre, a la vez que se evalúan los cambios de comportamiento a lo largo del tiempo. Esta es una adaptación de un protocolo de uso común en toda la comunidad C. elegans ⁴ . Este protocolo se ha utilizado para evaluar las respuestas aversivas y la detección de alimentos durante un período de cuatro horas [ ^21] . Dado que los gusanos muestran comportamientos de hambre después de 30 minutos de privación de alimentos ²⁵ , también podemos evaluar cómo los cambios en el estado nutricional pueden influir en las respuestas ambientales. Las condiciones de este ensayo miden cómo los organismos experimentales cambian la respuesta a los estímulos aversivos con el tiempo, por lo que se evalúan los cambios de comportamiento comoLos organismos progresan hacia un estado de hambre (y las mediciones continuadas de hambre prolongada). Dado que los animales npr-9 (GF) no alteran su comportamiento en respuesta a alimentos o muchas señales aversivas, buscamos identificar si estos déficits de comportamiento persistirían en el contexto de hambre. En última instancia, este diseño de ensayo se ha formulado para evaluar específicamente los mutantes npr-9 (GF), pero puede adaptarse adicionalmente para caracterizar también cepas nuevas.

Protocolo

1. Preparación de organismos experimentales

1. Elija 10 L4 de nematodos por cepa 24 h antes de comenzar el ensayo para asegurar que los organismos son adultos jóvenes cuando se prueban. Para cada nematodo mutante o de control ensayado, se seleccionan 10 L4s (10 para el testigo y 10 para el ensayo).
   1. Mantener los organismos L4 utilizando métodos estándar ^{26 , 27} durante 24 h en placas de agar estándar sembradas con OP50 Escherichia coli . Si se pierden organismos durante las etapas de lavado subsiguientes, compensar aumentando el tamaño de la muestra inicial ( es decir, recoger 20 gusanos en lugar de 10).
      Nota: El comportamiento es un fenotipo innatamente variable. Realizar el método por triplicado para cada cepa en tres días distintos. Incluir cepas de control adicionales y condiciones para cepas nuevas, como se destaca en la sección de discusión.
2. Inmediatamente antes del ensayo, transferir orga experimentalA una placa de agar sin bacterias y permitir que los nematodos se muevan libremente durante 1 minuto para eliminar el exceso de bacterias.
   1. Si los organismos experimentales experimentaron condiciones de contaminación durante las 24 h antes del ensayo, deséchelos.
3. Pipetee 1 mL de M9 sobre la placa libre de bacterias para lavar los gusanos en un tubo de microcentrífuga.
4. Centrifugar a 3.000 xg durante 1 min. Los gusanos deben formar un pellet en la parte inferior del tubo. Aspirar la solución de M9 sin interrumpir el gránulo de gusano. Añadir 1 ml de M9 a la bola de gusano, invertir el tubo para mezclar los gusanos con la solución.
5. Repita los pasos 1.4 tres veces más.
   1. Si el exceso de bacterias se transfirió inicialmente con los gusanos, repita un total de 5 veces. No se deben transferir bacterias a las placas de alimentación de cobre. Si el alimento se transfiere a la placa de ensayo, interferirá con la recolección exacta de datos.
6. Después del lavado final, se aspira el sobrenadante hasta 10081; L de M9 y el gránulo permanece.
   Precaución: Los comportamientos relacionados con el hambre se hacen evidentes después de 30 min. Por consiguiente, los gusanos deben ser inmediatamente transferidos de la solución una vez que se han completado los pasos de lavado.

2. Preparación de placas de ensayo

1. Preparar placas de agar NGM estándar dos días antes del ensayo.
   1. Si las placas se mantienen en un ambiente húmedo, hacer placas de agar 3 días antes del ensayo. Como alternativa, retire la tapa de la placa durante 3 - 6 h para asegurar la sequedad adecuada (si en un ambiente estéril).
2. Con un marcador permanente grueso, hacer una línea en la parte inferior de la placa a lo largo del borde exterior y otro para formar una barrera de línea media ( Figura 1 ). La barrera de línea media debe estar equidistante de cada borde de la placa. Utilice una regla para asegurar mediciones precisas. Estas líneas servirán de guía para la transferencia de bacterias y la solución de cobre. Siempre queE. coli se transfiere antes de la solución de cobre, estas líneas servirán como indicadores.
3. Plato de semilla con 50 μL de OP50 E. coli en un solo lado de la barrera de cobre para crear un césped uniforme ( Figura 2 ). La concentración bacteriana debe permanecer consistente en todos los ensayos; Sin embargo, se ha observado poca variabilidad en respuesta a ligeras diferencias en la concentración.
   1. Utilice las líneas marcadas en la parte inferior de la placa para asegurar que las bacterias no entren en contacto con la solución de cobre. Siempre que la solución de cobre alinee el borde de la placa y forme una barrera de línea media, transfiera las bacterias para que la solución de cobre no entre en contacto con la fuente de alimento.
4. Marque un segundo conjunto de placas y no transfiera ninguna E. coli OP50 ( Figura 2 ). Estas placas servirán para evaluar el control negativo. Estas placas también debenMarcando en la mitad de la placa para indicar el origen de la transferencia inicial.
5. Dejar secar las bacterias y luego incubar las placas a 37 ° C durante la noche. Asegúrese de que los parches bacterianos no se alteren al transferir a una incubadora o sala de 37 ° C. Una alteración excesiva podría alterar la ubicación o la forma del parche alimenticio.

3. Ensayo de quimiotaxis

1. Preparar de nuevo una solución de sulfato de cobre (II) 0,5 M antes de la hora de inicio del ensayo. Siempre que se utilicen 125 μl de la solución por placa, se aumenta este volumen dependiendo del número de placas de ensayo utilizadas ( por ejemplo, 5 placas de ensayo, 625 μl).
2. Pipetear 100 μL de la solución de sulfato de cobre (II) en el borde del agar para crear una barrera externa de cobre. La parte inferior marcada de la placa debe servir de guía.
3. Pipetear 25 μl de la solución de sulfato de cobre (II) para crear una barrera de línea media.
   1. Asegúrese de que la solución de sulfato de cobre (II)No entra en contacto con el parche bacteriano. Utilice una técnica manchada ya que la formación de rayas puede afectar la locomoción debido a las indentaciones / rasguños en el agar.
4. Deje que la solución de cobre se seque sobre la placa. El período de tiempo puede variar dependiendo de la placa y las condiciones del laboratorio. Compruebe visualmente la sequedad cada 5 minutos después de la transferencia.
   Nota: La solución de cobre muestra un matiz azulado y es fácilmente identificable. Utilizar un tejido de laboratorio para mojar ligeramente la solución cerca del borde de la placa para discernir la sequedad.
5. Pipetee 20 μL del sedimento de gusano desde el fondo del tubo sobre la mitad libre de bacterias de la placa de ensayo.
   1. Asegúrese de que 10 gusanos se transfieren a la placa de ensayo. Si los gusanos adicionales se incluyeron accidentalmente, eliminarlos por la recolección con aceite de halocarbono para asegurar que no se agregan bacterias a la placa. Cada ensayo debe tener un número uniforme de nematodos durante el ensayo.
      NOTA: Si hay pocos gusanos transfErrado durante los ensayos, el aumento del tamaño de la muestra inicial mitigará las pérdidas potenciales durante los lavados y las transferencias.
6. Retire el exceso de M9 de la placa con un tejido de laboratorio. M9 no debe entrar en contacto con la solución de sulfato de cobre (II).
   Precaución: Asegúrese de que los gusanos y la superficie del agar no se vean afectados al realizar este paso. Si se utiliza con demasiada dureza, el tejido de laboratorio puede crear muescas en la superficie de agar de la placa y puede eliminar los gusanos. Los gusanos eliminados accidentalmente a través de KimWipe deben desecharse.
7. Una vez que la solución M9 se ha eliminado y todos los gusanos han comenzado patrones locomotores no líquidos, iniciar el cronómetro de ensayo.
   1. De manera óptima, retire la solución M9 dentro de un minuto. El parámetro esencial es la identificación de la locomoción sinusoidal. Los gusanos se locomotan de manera diferente, por ejemplo , golpeando en lugar de sinusoidal, cuando están en líquido. Iniciar el ensayo de cronómetro una vez cada uno de los órganos experimentalesIsmos deja de golpear.
8. Revise las placas de ensayo cada 30 min.
   1. Para las placas de ensayo con parches bacterianos, marque positivamente los organismos si alcanzan el parche de alimentos durante un periodo de 4 h. Para las placas de control negativo, marque positivamente los organismos si han cruzado la barrera.

Resultados

Se utilizaron cepas de tipo salvaje (N2), npr-9 (tm1652) y una cepa de sobreexpresión npr-9 , es decir npr-9 (GF) (IC836 - npr-9 :: npr-9; sur-5 :: gfp; odr -1 :: rfp), para evaluar las respuestas a la inanición y la aversión al cobre. Los organismos de tipo salvaje son capaces de detectar y responder a la barrera aversiva de cobre, mientras que los mutantes npr-9 (GF) no inician una respuesta aversiva al cobre durante el ens...

Discusión

Este diseño de ensayo modifica el ensayo ^{24 de} raza alimentaria para incluir una solución de cobre para crear una barrera aversiva de línea media y alrededor del borde de la placa para evitar la pérdida de nematodos. Los organismos se ponen a prueba para determinar su capacidad para cruzar la barrera aversiva y alcanzar un parche alimenticio durante un período de 4 h. En el contexto de npr-9 (GF) , hemos utilizado este ensayo para evaluar cómo las condiciones de inanición podrían afectar...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
M9 Solution [3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O hasta 1 litro. Autoclave para esterilizar antes de usar.]			Producido en laboratorio
Cloruro Cúprico	Sigma	C-1297	Use agua para suspender apropiadamente a una concentración de 0.5M