Determinación de la óptima Localización cromosómica de un elemento de DNA en Escherichia coli utilizando un nuevo enfoque mediada por transposones

Resumen

Aquí, el poder de una inserción al azar de un elemento de DNA no codificante mediada por transposones se utilizó para resolver su posición cromosómica óptima.

Resumen

La posición o posiciones cromosómica óptima de un determinado elemento de ADN fue/fueron determinada por la inserción al azar mediada por transposones, seguido por la selección de fitness. En bacterias, el impacto del contexto genético de la función de un elemento genético puede ser difícil de evaluar. Varios mecanismos, incluyendo efectos topológicos, interferencia transcripcional de genes vecinos, o dosis de gen asociado de replicación, pueden afectar la función de un elemento genético. Aquí, describimos un método que permite la integración al azar de un elemento de DNA en el cromosoma de Escherichia coli y seleccionar las ubicaciones más favorables mediante una competencia de crecimiento simple experimentan. El método aprovecha de un bien-descrito transposones-sistema de inserción al azar, juntada con una selección de los más aptos clone(s) ventaja del crecimiento, un procedimiento que es fácilmente ajustable a las necesidades experimentales. Puede determinarse la naturaleza de la clone(s) más aptos por todo el genoma que ordenaba en una población clonal múltiples compleja o por gene fácil para la identificación rápida de clones seleccionados. Aquí, la región no codificante de ADN DARS2, que controla la iniciación de la replicación del cromosoma de e. coli, fue utilizada como ejemplo. La función de DARS2 es conocida por ser afectados por dosis de gen asociado de replicación; el más DARS2 obtiene el origen de replicación del ADN, más activo se convierte. DARS2 fue insertado al azar en el cromosoma de un DARS2-elimina la tensión. Los clones resultantes que contienen inserciones individuales se agruparon y compitieron entre sí a cientos de generaciones. Finalmente, los clones más aptos se caracteriza y contiene DARS2 en proximidad cercana a la ubicación original de DARS2 .

Introducción

La función de cualquier elemento genético puede verse afectada por su localización en el genoma. En las bacterias, esto resulta fundamentalmente de interferencia por la transcripción de genes vecinos, local topología de ADN o dosis de gen asociado de replicación. En particular, los procesos de replicación del DNA y la segregación son controlados, al menos en parte, por las regiones cromosómicas no codificante¹y el funcionamiento de estas regiones depende de situación/contexto genómico. En e. coli, los ejemplos son el sitio de dif , necesario para la hermana de resolución del cromosoma²; Secuencias KOPS, necesarias para de la segregación del cromosoma³; datos, DARS1y DARS2 regiones, requeridas para el control de la replicación cromosómica adecuada (abajo; ⁴). se presenta un método que permite la reubicación al azar, la selección y la determinación del contexto genético óptimo de cualquier elemento genético, ejemplificados aquí por el estudio de la región no codificante de DARS2 .

En e. coli, DnaA es la proteína del iniciador responsable de filamento de la DNA en la replicación solo origenoriCy para la contratación de la helicasa DnaB^5,6,7. DnaA pertenece a la AAA⁺ (es decir, asociados a diversas actividades de ATPasas) proteínas y puede enlazar ATP y ADP con similar alta afinidad⁵. El nivel de DnaA^ATP picos en iniciación⁸, donde DnaA^ATP forma un multimer en oriC que activa el ADN dúplex apertura⁹. Después de la iniciación, oriC se hace disponible para la iniciación debido a secuestro por un mecanismo que implica el atascamiento de la proteína SeqA hemimethylated oriC^10,11. Durante el secuestro, se reduce el nivel de DnaA^ATP por al menos dos mecanismos: la regulación inactivación de DnaA (RIDA)^12,13 y datos-DnaA dependiente^ATP hidrólisis (DDAH)^{14 ,15}. RIDA y DDAH promoción la conversión de DnaA^ATP a^ADPde DnaA. Antes de una nueva ronda de iniciación, DnaA^ADP se reactiva a DnaA^ATP en secuencias específicas de reactivación de DnaA (DARS): DARS1 y DARS2^16,17. La cromosómica datos, DARS1y DARS2 regiones son no codificante y actuar de una manera como acompañante para modular DnaA^ATPADP interconversión de /DnaA. Estas regiones, las afueras del origen de replicación, que al montaje de un complejo de DnaA para cualquiera la inactivación (datos; ¹⁴) o activación (DARS1 y DARS2; ¹⁷) de DnaA. Eliminación de DARS2 en una celda no altera masa doblar tiempo pero resulta en replicación asincrónica iniciación^15,16,18. Sin embargo, DARS2-células deficientes tienen un gimnasio costo comparado con un tipo de salvaje lo contrario isogénicas durante ambos competencia de continuo crecimiento en medio rico o en el establecimiento de la colonización en el intestino de ratón¹⁸. Esto indica que incluso pequeños cambios en la concentración de asincronía/origen tienen un efecto negativo en fitness bacteriano. En e. coli, hay una presión selectiva para mantener la simetría (es decir, dos brazos de la replicación de casi igual longitud) de cromosoma¹⁹. Los datos, DARS1y DARS2 regiones tienen la misma distancia relativa a oriC en todo e. coli cepas secuenciadas¹⁸, a pesar de grandes variaciones en el tamaño del cromosoma.

Aquí, utilizamos la región DARS2 de e. coli como ejemplo para la identificación de los puestos cromosómicas óptimos para su función. DARS2 fue insertado en el transposon NKBOR y la resultante NKBOR:: transposonDARS2 posteriormente se inserta al azar en el genoma de MG1655 ΔDARS2. Así generó una colección de células, cada posesión DARS2 colocado en un lugar diferente en el cromosoma. Se realizó un en vitro competencia experimento, donde todas las células de la colección fueron agrupadas y compitieron entre sí durante el crecimiento continuo en libras para un estimado generaciones 700. El resultado del experimento de competencia monitoreados/determinó mediante Southern blot, gene fácil caminar y secuenciación del genoma completo (gt; Figura 1). Clones de punto final resueltas por gene fácil caminar se caracterizaron por citometría de flujo para evaluar los parámetros de ciclo celular. En un análisis cytometric del flujo, tamaño de celda, el contenido de ADN y sincronía de iniciación se pueden medir para un gran número de células. En citometría de flujo, un flujo de células pasa un haz de luz de la longitud de onda adecuada para excitar el ADN teñido, que entonces está simultáneamente registrado por photomultipliers que recogen la fluorescencia emitida, una medida de contenido de ADN, siempre la las células se tiñen para ADN. La luz dispersada hacia adelante es una medida de masa celular²⁰.

El experimento de competencia en vitro que presentamos aquí se utiliza para abordar las cuestiones relativas a la importancia de la posición cromosómica y el contexto genómico del elemento genético. El método es fácil de usar e imparcial.

Protocolo

1. colección de la biblioteca del Transposon

Nota: el locus cromosómico de DARS2 fue clonado en la mini Tn 10-basado transposon, NKBOR (en pNKBOR) ²¹, resultando en NKBOR:: DARS2 (pJFM1). pNKBOR pueden obtenerse en línea ²². pNKBOR es un vector basado en R6K suicida que requiere el π de la proteína del iniciador para replicación ²³. Plásmido pJFM1 por lo tanto es capaz de replicar en una cepa de e. coli (por ejemplo, Dh5α λ pir) que contiene una copia cromosómica del gene del pir. Sin embargo, cuando pJFM1 se transforma en el Pir-deficiente wildtype MG1655, pJFM1 no pueden replicar, llevando a la selección de clones resistentes a kanamicina generados por las inserciones aleatorias de NKBOR:: DARS2 en el cromosoma bacteriano. Para simplificar, estas se denominan inserciones DARS2. Vea la figura 1 para una presentación esquemática de la metodología de.

1. Preparar espectro MG1655 Δ DARS2 de crecimiento de las células en caldo de lisogenia (LB) a 37 ° C ²⁴.
2. Electroporate pJFM1 en Δ de espectro MG1655 DARS2, según González et al. ²⁴
   1. agregue 1 μg de pJFM1 (en 1 μl de agua) a 40 μl de espectro MG1655 de e. coli Δ DARS2 y transferir esta mezcla a una cubeta de brecha de 0.2 cm estéril, previamente enfriada. Insertar la cubeta en la cámara de electroporación. Electroporate a 18 kV, Ω 500 y 25 μF; la constante de tiempo debe ser ~5.0 ms, y no hay formación de arcos ocurre.
   2. Recuperar rápidamente la suspensión bacteriana por resuspender en 1 mL de caldo LB precalentado y transfiéralo a un tubo de ensayo de 15 mL.
   3. Deje las células recuperar por incubar bajo condiciones de crecimiento aireada a 37 ° C por 30 min, sin la selección antibiótica. Plato de las bacterias en placas de agar LB con kanamicina 50 μg/mL e incubar a 37 ° C durante la noche.
3. Contar las colonias de la electroporación: una colonia se considera igual a una inserción del transposón cromosómica.
   Nota: Las colonias pueden ser contadas por el ojo o con un contador de colonias. El número de colonias es inversamente proporcional a la distancia media que separa los transposones localizados en el cromosoma de cada clon.
4. Agregue 1 mL de caldo LB a cada placa y lava todas las colonias, 1 mL de LB caldo debe ser suficiente para lavar ~ 100.000 colonias. Vuelva a usar el mismo 1 mL de caldo LB para aumentar la concentración bacteriana. Piscina de todas las colonias en el mismo tubo de 50 mL.
5. Vortex el tubo y el material de inicio (t = 0). Para congelarlo, mezclar 1 mL de la suspensión celular con 1 mL de glicerol al 50% en el hielo. Transferir los tubos para secar hielo durante 10 minutos. Una vez que las culturas son congeladas, transferirlos a un congelador de-80 ° C.
   Nota: Una concentración de células de un mínimo de 50.000 ufc/mL se espera en este paso.

2. Concurso de experimento en libras

1. deshielo la biblioteca transposon de-80 ° C en hielo. Mezclar por pipeteo.
2. Transferir 100 μl de la biblioteca del transposon a 10 mL de LB en un tubo de ensayo de 15 mL.
3. Crecen las células, aireadas por agitación continua (250 rpm), de 8 h a 37 ° C a la fase estacionaria (es decir, OD ₆₀₀ = ~ 4.0). Ajustar estos parámetros a diferentes condiciones de crecimiento, según se desee.
4. Propagar la población bacteriana por continuos traslados en medio fresco precalentado cada ~ 10 generaciones. Para ello, transferir 10 μl de la cultura de la anterior fase estacionaria a 10 mL de LB fresco y a la fase estacionaria de crecimiento para otro 8 h (es decir, OD ₆₀₀ = ~ 4.0).
   Nota: Como la densidad óptica inicial y final son iguales, una dilución de 1,000-fold corresponde a ~ 10 generaciones de crecimiento (2 ¹⁰ = 1.024). La población bacteriana puede ser propagada directamente en medio fresco precalentado o guardada 0-4 ° C (en hielo) y al día siguiente. LB se utilizó aquí para tantos doblajes celulares en más breve tiempo posible (un tiempo de duplicación cerca de 22 min).
5. Después de cada 100 generaciones de la competencia, ahorrar cinco muestras de 1 mL a-80 ° C (como se describe en el paso 3.3).
6. Si las diferencias de aptitud entre las células que contienen inserciones de transposones individual se esperan que sean pequeños, tener la duración de la competencia largo; aquí, generaciones 700 (t = 700) fueron utilizados.

3. Southern Blot análisis para controlar el experimento en tiempo de competencia

1. prepara la sonda para el Southern blot (sección de 1 kb de la NKBOR) realizando la amplificación de la reacción en cadena (PCR) polimerasa usando las cartillas específicas: NKBOR_Probe_FW : gatgttggacgagtcggaat y NKBOR_Probe_RV: cgttacatccctggcttgtt.
   1. Incubar a 98 ° C por 30 s para desnaturalización inicial. Luego, realizar 35 ciclos a 98 ° C por 10 s, 60 ° C durante 30 s y 72 ° C por 45 s. Para la extensión final, uso 72 ° C durante 10 minutos
      Nota: La plantilla para la reacción de PCR fue una de plásmido purificado pNKBOR ²¹.
   2. El fragmento resultante de la polimerización en cadena de la etiqueta con [α - 32P] dATP utilizando el sistema de cebador al azar, según Smith ²⁵.
2. Preparar la DNA celular total según Løbner-Olesen y von Freiesleben ²⁶ para t = 0 y seleccionado momentos hasta t = 700 Estimado las generaciones de la competencia.
3. Digerir el DNA celular total con Pvu, que corta el NKBOR que contiene la región de interés una vez solamente en una región no cubierto por la sonda, 1 unidad de Pvu puedo ser solía totalmente digest 1 μg de substrato ADN.
   Nota: La sonda reconoce fragmentos que contenían parte de transposones, junto con el ADN cromosómico de diferentes longitudes, dependiendo del sitio de inserción.
4. Realizar un Southern blot usando un gel de agarosa al 0,7% según Løbner-Olesen y von Freiesleben ²⁶.

4. Identificación de los Clones más aptos

1. gene fácil de uso a pie, según lo descrito por Harrison et al. ²⁷, para identificar los sitios de inserción DARS2 de clones solo (aislados en placas de LB) después de generaciones unas 700 de la competencia; las bandas más en el Southern blot, los más aislados son necesarios para cubrir todas las inserciones de transposones.
   1. Aislar ADN genómico para plantilla de PCR. Propagación de bacterias en un agar LB con kanamicina 50 μg/mL de la placa e incuban a 37 ° C durante la noche. Crecen solo colonias durante la noche en caldo LB a 37 ° C y posteriormente transferir 20 μl a 200 μL de agua destilada esterilizada (o usar de la purificación de DNA, como en el paso 3.2).
      1. Vortex para mezclar. Calentar la mezcla a 100 ° C para 10 min y centrifugar a velocidad máxima durante 5 minutos excepto la celda lisada a-20 ° C para su uso futuro.
   2. Diseño tres cebadores anidados a templar en el transposon de elección (ver figura 2 para una representación gráfica de la estrategia PCR).
      Nota: Diseñar cebadores anidados debe asegurar que anidado cartilla 3 está más cercana a las conocidas 5 ' final de transposones ADN, seguido por Nested Primers 2 y 1. El espaciado entre anidados cartilla 3 y los 5 ' final de la t conocidaransposon ADN debería ser suficiente para una lectura a través secuencia de la DNA conocida del ADN desconocido (para encontrar el sitio de inserción del transposón cromosómicos específicos). Para NKBOR se utilizaron los siguientes iniciadores anidados: pNKBOR_Nested3_RV: gcagggctttattgattcca, pNKBOR_Nested2_RV: tcagcaacaccttcttcacg y pNKBOR_Nested1_RV: actttctggctggatgatgg. También se utilizan primers al azar que contienen los sitios de reconocimiento de enzimas de restricción conocidos. Para asegurar un resultado, uno debe utilizar al menos dos diferentes primers al azar. Los sitios de restricción para las enzimas de restricción (e.g.,Sau 3AI y Hin dIII) deben estar ubicados en los 3 ' final y precedido por diez bases al azar así que 5 ' - NNNNNNNNNNGATC - 3 ' y 5 ' - NNNNNNNNNNAAGCTT - 3 ' son los iniciadores que contiene un Sau 3AI sitio (GATC) y un Hin dIII (PALINDROMIC), respectivamente, donde N = A, T, G o C.
   3. Uso 200 ng de ADN genómico en una 20 μl PCR la reacción. Incubar a 98 ° C por 30 s para la desnaturalización de la inicial. Realizar ciclos de 25 a 98 ° C por 30 s, 50 ° C por 15 s y 72 ° C durante 4 minutos. Para la extensión final, use 72 ° C para 10 min uso pares de cartilla de anidar la cartilla 1 y uno de los iniciadores al azar.
   4. Utilizar pares de cartilla que consta de 2 anidadas de la Primer y la misma cartilla al azar de la amplificación de la segunda, con 1 μl de la reacción anterior como plantilla.
   5. Repetir paso 4.1.4 con pares de primer consisten en 3 anidadas de la Primer y la cartilla al azar mismo.
   6. Ejecutar los productos de la reacción final de la PCR en un gel de agarosa al 1.5% y tinción con bromuro de etidio. Cortar una banda en el rango de 100-800 bp y aislar el ADN usando cualquier comercial gel de DNA extracción kit según el fabricante ' dirección s. Resuspender el DNA en 15 μl de agua.
      Nota: PRECAUCIÓN. Bromuro de etidio es tóxico y debe manipularse con cuidado.
   7. La secuencia de la banda aislada en el paso anterior (paso 4.1.6), con 3 anidadas de la Primer como la cartilla de la secuencia, usando Sanger secuenciación en un proveedor comercial.
2. Realizar WGS.
   1. WGS realizar sobre el total de ADN extraído de seleccionado muestras recolectadas durante el experimento de la competencia, según lo descrito por Frimodt-Møller et al ⁴.
3. Realizar el análisis de secuenciación.
   1. Lee fin de alinear junto a 150 Ns contiguos a NKBOR, AF310136.1 1.904 … 2.204 Bowtie2 ²⁸ con un intervalo entre subcadenas de semilla (S, 1, 1,15) y un número máximo de caracteres ambiguos (L, 0, 0.9).
   2. Seleccionar la Lee alineada y luego volver a alinear a ambos ref MG1655 | NC_000913.3 y NKBOR gb | AF310136 usando blastN ²⁹
   3. asignar transposición posiciones de inserción en las ensambladuras MG1655-NKBOR.

5. Citometría de flujo

1. recoger muestras para citometría de flujo.
   1. Balance cada cultura por mantener en la fase de crecimiento exponencial durante al menos 10 generaciones. Compruebe el OD ₆₀₀ y asegúrese de que no exceda 0.3.
   2. Recoge dos tipos de muestras de flujo.
      1. De RIF-descentramiento, transfiera 1 mL de cultivo a un tubo de 15 mL que contenga 30 μl de RIF-CEF (300 μg/mL rifampicina y cefalexina de 36 μg/mL disueltos en 12,5 mM NaOH). Dejar a 37 ° C durante un mínimo de 4 h de agitación.
         Nota: La rifampicina bloquea indirectamente la iniciación de la replicación de cromosomas permitiendo continuas rondas de replicación continúen hasta su finalización. Cephalexin previene la división celular, que resulta en replicación descentramiento (RIF-descentramiento) y la acumulación de células con cromosomas replicados completamente. El número de cromosomas completamente replicados es igual al número de origen en el momento del tratamiento con rifampicina y cefalexina ²⁰.
      2. Para la muestra de EXP, transferencia 1 mL de la exponencialmente creciente cultura a un tubo de 1,5 mL en hielo.
2. Fijar las celdas como sigue. La cosecha de las células por centrifugación a 15.000 x g durante 5 min a 4 ° C. Resuspender el precipitado en 100 μl de Tris, pH helada 10 mM 7.5 y añadir 1 mL de etanol al 77% helada. Almacenar las muestras a 4 ° C hasta su uso.
3. Mancha las células como sigue. Cosecha 100-300 μL de células fijas por centrifugación a 15.000 x g durante 15 minutos retirar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 130 μl de " solución de tinción de DNA " (90 μg/mL mitramicina, 20 bromuro de etidio μg/mL, 10 mM MgCl ₂ y 10 mM Tris pH 7.5). Poner las muestras en hielo y en la oscuridad; las muestras están listas para el análisis de citometría de flujo después de 10 minutos
   Nota: Otros ADN manchas de bromuro de etidio y mitramicina puede también ser utilizado ^{30 , 31}.
4. Determinar el origen celular, la masa relativa de la celda y el contenido relativo de ADN por citometría de flujo análisis.
   1. Realizar citometría de flujo, como se describió anteriormente ³². Ejecutar RIF-descentramiento y EXP-muestras utilizando el citometría de flujo fabricante ' instrucciones . Para células con tinción Bromuro etidio y mitramicina, longitudes de onda 395 y 440 nm de excitación y recoger la fluorescencia sobre 565 nm.
      1. Para determinar el relativa relativo y masa ADN contenido de celda, ejecutar el EXP-las muestras para obtener la dispersión de luz hacia adelante solo-parámetro versus histogramas número celular y la intensidad de fluorescencia versus histogramas número celular para un mínimo de 30.000 eventos correspondiente a la señal de celular.
      2. La distribución de luz dispersada hacia delante uso de solo-parámetro para medir la relativa promedio celular Massachusetts
         Nota: La luz dispersada hacia adelante es una medida de la masa celular promedio ²⁰.
      3. Distribuciones de solo-parámetro de intensidad uso fluorescencia para medir el ADN promedio contenido ²⁰.
      4. Obtener la concentración de ADN como la relación de medio contenido de ADN a la célula promedio masa ²⁰.
   2. Determinar el número de orígenes por la célula.
      1. Muestras de RIF-descentramiento de la gestión para obtener la intensidad de la fluorescencia del solo-parámetro versus celular número histogramas para un mínimo de 30.000 eventos correspondientes a la señal de celular.
      2. Distribuciones de solo-parámetro de intensidad uso fluorescencia para determinar el número de cromosomas en cada célula ²⁰.
5. Calcular el índice de asincronía (Ai).
   1. Calcular la inteligencia artificial, según lo descrito por Løbner-Olesen et al. ³², usando las distribuciones de parámetro de intensidad de fluorescencia de las muestras de descentramiento de la RIF y la fórmula Ai = (f3 + f5 + f6 + f7) / (f2 + f4 + f8), donde fx es las células de la fracción con x número de los cromosomas replicados completamente. Consideran iniciaciones asincrónica cuando A > 0.1.

Resultados

Una mancha blanca /negra meridional fue hecha para verificar que DARS2 se distribuyó al azar a lo largo del cromosoma en la biblioteca de transposon (t = 0) y que los clones más aptos persistiría en el tiempo. El Southern blot fue realizada en la DNA extraída de la piscina de transposon inicial (en t = 0) y cada 100 estimado de 700 generaciones de competencia (figura 3). Aquí, la DNA celular total de cada punto del tiempo fue digerido con Pvu

Discusión

La metodología utilizada aquí toma ventaja de las técnicas de vanguardia para responder a una pregunta difícil con respecto a la posición óptima de genomic de un elemento genético. La inserción al azar del elemento genético (mediada por el transposon) permite la fácil y rápida recopilación de miles de clones, que luego se pueden hacer para competir entre sí para seleccionar la posición óptima del elemento genético investigado (es decir, el clon más apto).

Aquí, DARS2 fue inse...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
	Mili-Q esterilizada en autoclave	Ninguna
Cubetas de electroporación, 0,1 cm	Thermo Fisher Scientific	P41050
Bio-Rad MicroPulsador Sistema de electroporación	Bio-Rad	165-2100
LB Caldo	Thermo Fisher Scientific	12780029
LB Agar, polvo (Lennox L agar)	Thermo Fisher Scientific	22700025
Glycerol	Thermo Fisher Scientific	17904
Fisherbrand  Placas de Petri de plástico	Fisher Scientific	S33580A
Falcon 50mL Tubos de Centrífuga Cónicos	Fisher Scientific	14-432-22
Falcon 15mL Tubos de Centrífuga Cónicos	Fisher Scientific	14-959-53A
Nunc  Tubos criogénicos	Sigma-Aldrich	V7634
Phusion ADN polimerasa de alta fidelidad (2 U/µ L)	Thermo Fisher Scientific	F530S
dATP, [α-32P]- 3000Ci/mmol 10mCi/ml, 250 µ Ci	PerkinElmer	BLU012H250UC
DECAprime II Kit de etiquetado de ADN	Espectrofotómetro Thermo Fisher Scientific	AM1455
SF/MBV/03.32	Farmacia
Centrífuga Hermle      SF/MBV/03.46	Hermle
Ole Dich  SF/MBV/03.29	Ole Dich
Eppendorftubes 1.5 mL	Sigma-Aldrich	T9661
Eppendorftubes 2.0 mL	Sigma-Aldrich	T2795
Cloruro de Sodio	Merck	6404
96% Etanol	Sigma-Aldrich	16368
Trizma HCl	Sigma-Aldrich	T-3253
Fenol Ultra puro	BRL	5509UA
Cloroformo	Merck	2445
Ribonucleasa A tipo II A	Sigma-Aldrich	R5000
Dodecilsulfato de sodio (SDS)	Merck	13760
Lisozima	Sigma-Aldrich	L 6876
Isopropanol	Sigma-Aldrich	405-7
0.5M Na-EDTA pH 8.0	BRL	5575 UA
Sulfato de Kanamicina	Sigma-Aldrich 10106801001
PvuI (10 U/µ L)	Thermo Fisher Scientific	ER0621
Agarosa ultrapura	Thermo Fisher Scientific	16500500
DNA Gel Load Dye (6X)	Thermo Fisher Scientific	R0611
Tampón Tris-Borato-EDTA	Sigma-Aldrich	T4415
Bromuro de etidio	Sigma-Aldrich	E7637
Ácido	clorhídricoSigma-Aldrich	433160
Hidróxido de sodio	Sigma-Aldrich	71687
Whatman  Papeles de 3MM	Sigma-Aldrich	WHA3030931
SSC Buffer 20× Concentrado	Sigma-Aldrich	S6639
Amersham Hybond-N+	GE Healthcare RPN119B
Ficoll  400	Sigma-Aldrich	F8016
Polivinilpirrolidona	Sigma-Aldrich	PVP40
Albúmina sérica bovina - Fracción V	Sigma-Aldrich	85040C
Ácido desoxirribonucleico sal sódica de testículos de salmón	Sigma-Aldrich	D1626
Carestream Kodak   BioMax   película ligera	Sigma-Aldrich	Z373494
GenElute   Kit de extracción de gel	Sigma-Aldrich	NA1111
GenElute   kit de limpieza para PCR	Sigma-Aldrich	NA1020
T100  Termociclador	Bio-Rad
SmartSpec Plus Espectrofotómetro	Bio-Rad
rifampicina	Serva	34514.01
Cefalexina	Sigma-Aldrich	C4895
Mitramicina	Serva	29803.02
Cloruro de magnesio hexahidratado	Sigma-Aldrich	246964
Instrumento Apogee A10	Apogee