Purificación del compartimento de la membrana de retículo endoplasmático asociado degradación de antígenos exógenos en presentación cruzada

Summary

El método descrito aquí es un nuevo protocolo de aislamiento de la vesícula, que permite la purificación de los compartimentos celulares donde se procesan los antígenos exógenos por degradación retículo endoplasmático asociado en presentación cruzada.

Abstract

Las células dendríticas (DCs) son altamente capaces de procesar y presentar antígenos exógenos internalizados a clase principal de histocompatibilidad (MHC) las moléculas también conocido como Cruz-presentación (CP). CP desempeña un papel importante no sólo en la estimulación de la ingenua CD8⁺ T memoria CD8 y células⁺ T las células infecciosas e inmunidad del tumor sino también en la inactivación de automática ingenuo T células por anergia de células T o células T de supresión. Aunque el mecanismo molecular crítico de CP queda por ser aclarada, acumulando indicios que antígenos exógenos se procesan a través del retículo endoplasmático asociado degradación (ERAD) después de su exportación de no clásicas endocíticas compartimientos. Hasta hace poco, las caracterizaciones de estos compartimentos endocíticos fueron limitadas porque no había marcadores moleculares específicos distintos antígenos exógenos. El método descrito aquí es un nuevo protocolo de aislamiento de la vesícula, que permite la purificación de estos compartimentos endocíticos. Usando esta purificado microsoma, hemos reconstituido la ERAD-como transporte, ubiquitinación y procesamiento de los antígenos exógenos en vitro, sugiriendo que el sistema ubiquitina-proteasoma procesado el antígeno exógeno después de la exportación de este compartimiento celular. Este protocolo se puede aplicar más a otros tipos de células para aclarar el mecanismo molecular de CP.

Introduction

El MHC las moléculas se expresan en la superficie de todas las células nucleadas, con cortos péptidos antigénicos derivados de antígenos endógenos, que son procesados por el sistema ubiquitina-proteasoma en el citosol¹. Después de procesar, se transportan péptidos antigénicos en el lumen del retículo endoplásmico (ER) por el transportador de péptidos TAP. En el lumen del re, una serie de chaperonas específicas ayudan a la carga del péptido y el plegamiento correcto del MHC I complejo. Esta serie de moléculas se llama el complejo de carga (PLC), que indica que el ER es un compartimiento central para péptido cargando al MHC y². Después de la carga, de péptidos del MHC las moléculas son transportadas a la superficie de la célula y juega un papel clave en el sistema inmune adaptativo auto marcadores, como permite el CD8⁺ los linfocitos T citotóxicos (CTLs) para detectar células cancerosas o agentes infecciosos por antigénica péptidos de las proteínas del mismo³.

En el antígeno que presenta las células (APC), péptidos antigénicos de los antígenos exógenos son también presentados en MHC^4,5,6,7,8 a través de CP, que es fundamentalmente por DCs^9,10,11. CP es esencial tanto para la activación de ingenuo CD8⁺ T memoria CD8 y células⁺ T células antiinfecciosas y anti-tumoral CTLs^12,13y en el mantenimiento de la tolerancia inmune mediante la inactivación de autoactuante ingenuo T células^14,15. El CP juega un papel importante muchos en el sistema inmune adaptativo, sin embargo, los mecanismos moleculares de CP tienen todavía ser descrito en detalle. Estudios previos de CP revelaron que antígenos exógenos fueron localizados en el retículo endoplasmático y el endosome y fueron procesados por ERAD, lo que sugiere que los antígenos exógenos son transportados desde el endosome a ER para ERAD-como proceso y péptido carga¹⁶ . Sin embargo, evidencia acumulada indica que la carga de péptido de CP se realiza no en la sala de emergencia sino en compartimentos endocíticos no clásica, que también tienen características distintivas de la ER (figura 1)^{17,18 ,19,20,21}. Para evitar la degradación de los precursores del péptido antigénico por la alta actividad de aminopeptidasa²² en el citosol, el procesamiento y el péptido carga en CP se produce en la zona proximal de estos compartimentos endocíticos no clásica (figura 1). Aunque las caracterizaciones de estos compartimentos endocíticos son polémicas, hay no hay moléculas específicas existentes distintos antígenos exógenos en este compartimiento.

ERAD es una vía celular, que elimina específicamente proteínas mal plegadas de la ER. En el camino ERAD, proteínas mal plegadas retrogradely son transportadas a través de la membrana del ER al citoplasma y procesadas por el sistema de ubiquitina-proteasoma^23,24,25. Cuando las moléculas grandes, como las proteínas, son transportadas a través de la bicapa lipídica, estas moléculas pasan a través de un aparato molecular llamado un translocon, tales como el complejo Sec61 y Derlin complejo en el ER²⁶y el complejo de Tom y Tim complejo en la las mitocondrias²⁷. Cuando exógeno agregado antígenos son transportados a través de la membrana del ER, que deben penetrar la bicapa lipídica en complejo con translocons, como el complejo Sec61. El método descrito aquí purificada la vesícula específica mediante la utilización de estas moléculas de penetración de la membrana como marcadores para los compartimentos endocíticos.

El método descrito aquí es un nuevo protocolo de purificación de vesícula usando el celular de DC como línea DC2.4²⁸ y biotinilado ovoalbúmina (bOVA) como un antígeno exógeno. Los compartimentos endocíticos se purificaron por estreptavidina (SA)-granos magnéticos mediante la penetración de la membrana bOVA como fabricante. En esta purificado microsoma, algunos añaden exógenamente bOVA se conservan en fracciones de membrana pero se transporta al exterior del microsoma y entonces ubiquitinated, procesaron en vitro²⁹. Este microsome purificada contiene proteínas específicas del compartimiento endocíticas, sino también proteínas ER residente para ERAD y el péptido carga compleja; lo que sugiere que el compartimiento celular el compartimiento endocítico prospectivo para CP²⁹. Este protocolo no es dependiente en el tipo de antígenos exógenos y también es aplicable para otros subconjuntos de DC y otros tipos de células, como macrófagos, células B y las células endoteliales, para aclarar el mecanismo molecular exacto de DCs para perito CP.

Protocol

1. cultivo de células y la adición de antígenos exógenos

bOVA

1. preparar utilizando un etiquetado de biotina-proteína kit siguiendo el fabricante ' Protocolo s.
   Nota: Normalmente, bOVA contiene biotina de 2 M por 1 M huevos en promedio.
2. DC2.4 crecer las células en RPMI-1640 suplementado con 2 mM L-glutamina, piruvato de sodio 1 mM, 0.1 mM aminoácidos no esenciales, 100 U/mL de penicilina-estreptomicina, 2-Mercaptoetanol de 55 mM, 10 mM HEPES (pH 7,5) y suero de ternera fetal 10% (en lo sucesivo RPMI) a 37 ° C en 5 % CO ₂ en una incubadora humidificada (en lo sucesivo sin mención, las células se incuban en esta condición). También es posible utilizar DMEM suplementado con 10% de suero fetal de becerro, 3,7 g/L de NaHCO ₃ (en adelante DMEM) en lugar del RPMI.
3. Un día antes de la purificación, dividir las células en RPMI a 1 x 10 ⁵ células/mL en una placa de cultivo de tejidos. Evitar mantener las células en un estado confluente. Las células DC2.4 pueden altamente incorporar antígenos exógenos hasta un estado semi-confluente, pero pierde rápidamente la capacidad después de alcanzar un estado de excesiva confluentes.
4. Antes la DC2.4 las células son parcialmente confluentes, Añadir 250 μg/mL de bOVA para 1 x 10 ⁶ células/mL e incube durante 2-4 h.
   Nota: Durante los experimentos posteriores, todos los buffers y reactivos se mantienen a 4 ° C a menos que se indique lo contrario.

2. Preparación de los microsomas

1. las células DC2.4 de la cosecha mediante pipeteo suave de la placa de tejido en un tubo cónico de 50 mL nuevo.
2. Centrifugar a 1.000 x g durante 5 min, 4 ° C y retirar cuidadosamente el medio con bOVA por la aspiración de.
3. Lavar las DC2.4 las células dos veces con 40 mL de tampón PBS (1,37 mM NaCl, 8,1 mM Na ₂ HPO ₄, 2,68 mM KCl, 1,47 mM KH ₂ PO ₄) por centrifugación a 1.000 x g durante 5 min, 4 ° C y descarte el sobrenadante cada vez por la aspiración de.
Células
4. Resuspender el precipitado en el paso 2.3 en 1-2 mL (1/20-1/10 volumen de medio de cultivo) de homogeneización medio (0.25 M sacarosa, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES-NaOH [pH 7.4]) con el volumen de 1/1.000 de cócteles inhibidores de proteasa y transferencia DC2.4 resuspendidos en un helada homogeneizadores Dounce.
5. Romper las células DC2.4 resuspendidas suavemente por 10-20 movimientos con la helada homogeneizadores Dounce.
   Nota: Durante la etapa de interrupción, los homogeneizadores Dounce es enfriado en hielo.
6. La suspensión celular interrumpió la transferencia a un nuevo tubo cónico de 15 mL.
7. Medio de homogeneización de 8-9 mL total 10 mL y centrifugar el tubo cónico 10 min a 2.000 x g y 4 ° C.
8. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo cónico de 15 mL para eliminar las células intactas y núcleos y centrifugar el tubo cónico nuevamente durante 10 minutos a 2.000 x g y 4 ° C.
9. Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo de ultracentrifugación y centrifugar durante 45 min a 100.000 x g y 4 ° C.
10. Aspirar el sobrenadante y resuspender el precipitado cuidadosamente en 1-2 mL de medio de homogeneización con volumen de 1/1.000 de cócteles inhibidores de proteasa por pipetear la solución arriba y abajo varias veces para hacer una fracción del microsoma para experimentos posteriores.
11. Transferencia de la fracción del microsoma en un nuevo tubo de fondo redondo 5 mL.
    Nota: Después de este paso, es posible enriquecer los microsomas objetivo de iodixanol centrifugación gradiente de densidad según el fabricante ' protocolo de s, para quitar los microsomas no específicos. Las fracciones de pico para los antígenos exógenos son recogidas y luego sometidas al siguiente paso de purificación (paso 3).

3. Purificación de los microsomas con bOVA que ERAD

1. Agregar de 1/100 volumen de frescos granos SA-magnéticos para la fracción del microsoma de paso 2.11 en 5 mL redondo tubo inferior.
   Nota: Antes de este paso, es posible borrar previamente la fracción del microsoma por perlas de control magnético para reducir la contaminación de los microsomas no específico.
2. Mezclar bien suavemente y gire el tubo de fondo redondo despacio durante 30 minutos a 4 ° C.
3. Añadir 2-3 mL de medio de homogeneización total 4 ml en el tubo de fondo redondo y suavemente mezclar bien.
4. Coloque el tubo de fondo redondo sobre un soporte magnético e incubar 10 min a 4 ° C. Puesto que los granos a las vesículas son atraídos por el imán, micro-beads marrón poco a poco se acumularán a la pared del tubo más cercana al imán.
5. Con el tubo restante en el soporte magnético, descartar cuidadosamente el sobrenadante por aspiración para eliminar las vesículas.
6. Lavado los granos magnéticos enlazados a las vesículas dos veces con 5 mL de medio de homogeneización por el magnético reposar 10 min a 4 ° C y descarte el sobrenadante cada vez por aspiración cuidadosamente.
   Nota: Sin el soporte magnético, purificación por centrifugados a 2.000 x g durante 10 min, 4 ° C está también disponible.
7. Resuspender las bolas magnéticas vinculadas a las vesículas con cuidado en 100 μl de medio de homogeneización por pipetear la solución arriba y abajo varias veces.
8. Transferir las vesículas resuspendidas en un microtubo nuevo como del microsoma purificado para experimentos posteriores.
   Nota: Típicamente, 50 fracción del microsoma de μl que contiene 1 x 10 ⁷ células de 5-20 μg proteínas puede ser aislado.

4. Análisis de los microsomas purificada

perlas

1. Resuspender el magnético a las vesículas de paso 3.8 por 100-200 μL de tampón de TNE (pH de 20 mM Tris-HCl 7.4, 150 mM NaCl, 0.5 M de EDTA, de 1% Nonidet P-40) con volumen de 1/1.000 de cócteles inhibidores de proteasa en lugar del medio de homogeneización.
2. Transferir el lisado de paso 4.1 a un nuevo microtubo de 1.5ml.
3. Determinar la concentración de proteína de paso 4.2 usando un kit de ensayo BCA por el fabricante ' Protocolo s.
   Nota: Normalmente, 5-10 μl lisado de paso 4.2 es suficiente para determinar la concentración de proteína.
4. Transferir el lisado de paso 4.2 (2 μg de proteína para la tinción de plata y 10 μg de proteína para el borrar occidental) en microtubos nuevo.
5. Colocar los microtubos en un bloque de calor las proteínas 95 ° C y hervir en 1 x de tampón de carga de gel SDS (100 mM Tris-HCl de pH 6.8, azul de bromofenol 200 mM Ditiotreitol, 4% SDS, de 0,2%, 20% de glicerol) por 5 min
6. Centrifugar microtubos 10 min a 21.500 x g y 4 º C. recoger el sobrenadante en nuevos microtubos para quitar las fracciones insolubles.
7. Analizar las proteínas resueltas en el paso 4.6 (2 μg) por página de SD standard.
8. Visualiza las bandas de proteínas por la tinción utilizando la tinción de plata de plata kit siguiendo el fabricante ' Protocolo s.
9. Analizar las proteínas resueltas en el paso 4.6 (10 μg) por estándar SD-PAGE y Western-blotting. Utilizar el reactivo (SA-HRP) por el fabricante ' s protocolo y visualizar por fluorografía.

5. In Vitro Reconstitución de ubiquitinación ERAD de bOVA usando microsomas de purificada

1. transferencia la purificada microsomas (5-10 μg de proteína) de paso 3.8 con un volumen de 50% de reticulocitos lisado (RL), en 1 x buffer de reacción (50 mM Tris, pH 7.4, 3 mM ATP, 0,5 mM MgCl ₂) y 12:02 bandera etiqueta ubiquitina en un microtubo nuevo. El volumen final de este experimento es 20-40 μl.
2. Incubar los microtubos por 2 h a 37 ° C.
   Nota: Si la cantidad de ubiquitinated bOVA en paso 5.12 es demasiado pequeña para detección por Western blotting, agregue 10 μm de MG132 o 2 μm de lactacystin para inhibir el procesamiento de la bOVA ubiquitinated por proteasomas.
3. Detener la reacción mediante la colocación de los microtubos en hielo.
4. Resolver los microsomas por agregar 500 μl de tampón de TNE con volumen de 1/1.000 de cócteles inhibidores de proteasa.
5. Centrifugar microtubos 10 min a 21,500 x g y 4 º C. recoger el sobrenadante a un nuevo microtubo para quitar las fracciones insolubles, que contienen ubiquitinated bOVA en DC2.4 antes del ensayo de ubiquitinación en vitro.
6. Transferir el sobrenadante a un microtubo nuevo y añadir volumen 1/100 de nuevos granos SA-magnético (generalmente 5 μL para 500 μl del sobrenadante).
7. Mezclar bien suavemente y gire el microtubo lentamente durante 30 minutos a 4 ° C.
8. Centrifugar microtubos 10 min a 21.500 x g y 4 ° C. desechar el sobrenadante por aspiración a recuperar la bOVA y bOVA ubiquitinated atado con las bolas magnéticas SA.
9. Lavar dos veces los granos SA-magnético recogidos con 1 mL de tampón de la TNE por centrifugación 10 min a 21.500 x g y 4 ° C. descarte el sobrenadante cada vez por la aspiración de.
10. Hervir los granos SA-magnético en 1 x gel SDS cargando buffer por 5 min a 95 ° C en un bloque de calor para resolver las proteínas purificadas por las bolas magnéticas SA.
11. Centrifugar microtubos 10 min a 21.500 x g y 4 º C. recoger el sobrenadante a un nuevo microtubo para quitar las fracciones insolubles.
12. Analizar los granos SA-magnético enlazados a las proteínas por estándar SD-PAGE y Western-blotting. Es el uso de anticuerpos (Anti-Flag, anti-multi-Ub y anti-mouse IgG-HRP) y el reactivo (SA-HRP) por el fabricante ' Protocolo s y visualizados por fluorografía.

Results

Para dilucidar el mecanismo molecular de la CP, es necesario identificar los compartimentos celulares donde someterse a antígenos exógenos ERAD-como transporte y procesamiento. Mientras que observaciones por microscopía de inmunofluorescencia o microscopia electrónica identificaron el compartimento celular donde antígenos exógenos acumularon^16,17,18,1

Discussion

En estudios previos de CP, los antígenos exógenos incorporados acumulan en el área restricta del último endosome o ER por microscopía inmunofluorescente^16,30,31,32. Se estima que ERAD-como transporte y procesamiento de antígenos exógenos se llevan a cabo en estas áreas especializadas de la ER o último endosome, el compartimento celular fue identificado por sacarosa o iodixanol centrifugación de...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640	gibco de life technologies	11875-093
Suero fetal bovino	Equitech bio	SFB30
Piruvato de sodio	gibco de life technologies	11360-070
MEM aminoácidos no esenciales	gibco de life technologies	11140-050
HEPES	gibco de life technologies	15630-080
2-mercaptoetanol	gibco de life technologies	21985-023
L-glutamina	gibco de life technologies	25030-164
penisicilina-esreptomicina	gibco de life technologies	15140-122
DMEM	gibco de life technologies	12100-46
OVA	SIGMA	A5503
biotina-proteína kit de etiquetado	Thermo Fisher Scientific	F6347
MG-132	Santa Cruz Biotechnology	201270
lactacistina	SIGMA	L6785
Homogeneizador Dounce	IUCHI	131703
cócteles inhibidores de la proteasa	SIGMA	P8340
iodixanol	Cosmo bio	1114542
Perlas magnéticas SA	New England Biolabs	201270
perlas magnéticas de control	Chemagen	M-PVA012
soporte magnético	BD Biosciences	552311
BCA kit de ensayo de proteínas Thermo	Fisher Scientific	23225
kits de tinción de plata	Cosmo bio	423413
Lisado de reticulocitos	Promega
ubiquitina marcada con bandera	SIGMA	U5382
anti-ovoalbúmina (OVA, ratón)	Tienda	de anticuerpos HYB 094-06
ant-multi-ubiquitina (ratón)	MBL	D058&menos;
anti-Bandera (ratón)	SIGMA	F3165
tripsina	SIGMA	85450C