Method Article

Purificación del compartimento de la membrana de retículo endoplasmático asociado degradación de antígenos exógenos en presentación cruzada

DOI:

10.3791/55949

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August 21st, 2017

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1Laboratory of Physiological Chemistry, Faculty of Pharmacy, Takasaki University of Health and Welfare

In This Article

Summary

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El método descrito aquí es un nuevo protocolo de aislamiento de la vesícula, que permite la purificación de los compartimentos celulares donde se procesan los antígenos exógenos por degradación retículo endoplasmático asociado en presentación cruzada.

Abstract

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Las células dendríticas (DCs) son altamente capaces de procesar y presentar antígenos exógenos internalizados a clase principal de histocompatibilidad (MHC) las moléculas también conocido como Cruz-presentación (CP). CP desempeña un papel importante no sólo en la estimulación de la ingenua CD8+ T memoria CD8 y células+ T las células infecciosas e inmunidad del tumor sino también en la inactivación de automática ingenuo T células por anergia de células T o células T de supresión. Aunque el mecanismo molecular crítico de CP queda por ser aclarada, acumulando indicios que antígenos exógenos se procesan a través del retículo endoplasmático asociado degradación (ERAD) después de su exportación de no clásicas endocíticas compartimientos. Hasta hace poco, las caracterizaciones de estos compartimentos endocíticos fueron limitadas porque no había marcadores moleculares específicos distintos antígenos exógenos. El método descrito aquí es un nuevo protocolo de aislamiento de la vesícula, que permite la purificación de estos compartimentos endocíticos. Usando esta purificado microsoma, hemos reconstituido la ERAD-como transporte, ubiquitinación y procesamiento de los antígenos exógenos en vitro, sugiriendo que el sistema ubiquitina-proteasoma procesado el antígeno exógeno después de la exportación de este compartimiento celular. Este protocolo se puede aplicar más a otros tipos de células para aclarar el mecanismo molecular de CP.

Introduction

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El MHC las moléculas se expresan en la superficie de todas las células nucleadas, con cortos péptidos antigénicos derivados de antígenos endógenos, que son procesados por el sistema ubiquitina-proteasoma en el citosol1. Después de procesar, se transportan péptidos antigénicos en el lumen del retículo endoplásmico (ER) por el transportador de péptidos TAP. En el lumen del re, una serie de chaperonas específicas ayudan a la carga del péptido y el plegamiento correcto del MHC I complejo. Esta serie de moléculas se llama el complejo de carga (PLC), que indica que el ER es un compartimiento central para péptido cargando al MHC y2

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Protocol

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1. cultivo de células y la adición de antígenos exógenos

bOVA
  1. preparar utilizando un etiquetado de biotina-proteína kit siguiendo el fabricante ' Protocolo s.
    Nota: Normalmente, bOVA contiene biotina de 2 M por 1 M huevos en promedio.
  2. DC2.4 crecer las células en RPMI-1640 suplementado con 2 mM L-glutamina, piruvato de sodio 1 mM, 0.1 mM aminoácidos no esenciales, 100 U/mL de penicilina-estreptomicina, 2-Mercaptoetanol de 55 mM, 10 mM HEPES (pH 7,5) y suero de ternera fetal 10% (en lo sucesivo RPMI) a 37 ° C en 5 % CO 2 en una incubadora humidificada (en lo sucesivo sin mención, las células se incuban en esta condición). Tambi....

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Results

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Para dilucidar el mecanismo molecular de la CP, es necesario identificar los compartimentos celulares donde someterse a antígenos exógenos ERAD-como transporte y procesamiento. Mientras que observaciones por microscopía de inmunofluorescencia o microscopia electrónica identificaron el compartimento celular donde antígenos exógenos acumularon16,17,18,1

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Discussion

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En estudios previos de CP, los antígenos exógenos incorporados acumulan en el área restricta del último endosome o ER por microscopía inmunofluorescente16,30,31,32. Se estima que ERAD-como transporte y procesamiento de antígenos exógenos se llevan a cabo en estas áreas especializadas de la ER o último endosome, el compartimento celular fue identificado por sacarosa o iodixanol centrifugación de.......

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Disclosures

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Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgements

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Este trabajo es apoyado por la Universidad de Takasaki de la salud y el bienestar.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
RPMI 1640gibco de life technologies11875-093
Suero fetal bovinoEquitech bioSFB30
Piruvato de sodiogibco de life technologies11360-070
MEM aminoácidos no esencialesgibco de life technologies11140-050
HEPESgibco de life technologies15630-080
2-mercaptoetanolgibco de life technologies21985-023
L-glutaminagibco de life technologies25030-164
penisicilina-esreptomicinagibco de life technologies15140-122
DMEMgibco de life technologies12100-46
OVASIGMAA5503
biotina-proteína kit de etiquetadoThermo Fisher ScientificF6347
MG-132Santa Cruz Biotechnology201270
lactacistinaSIGMAL6785
Homogeneizador DounceIUCHI131703
cócteles inhibidores de la proteasaSIGMAP8340
iodixanolCosmo bio1114542
Perlas magnéticas SANew England Biolabs201270
perlas magnéticas de controlChemagenM-PVA012
soporte magnéticoBD Biosciences552311
BCA kit de ensayo de proteínas ThermoFisher Scientific23225
kits de tinción de plataCosmo bio423413
Lisado de reticulocitosPromega
ubiquitina marcada con banderaSIGMAU5382
anti-ovoalbúmina (OVA, ratón)Tiendade anticuerpos HYB 094-06
ant-multi-ubiquitina (ratón)MBLD058&menos;
anti-Bandera (ratón)SIGMAF3165
tripsinaSIGMA85450C
17307143

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. van Endert, P. Providing ligands for MHC class I molecules. Cell Mol Life Sci. 68 (9), 1467-1469 (2011).
  2. Janeway, C., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. Immunobiology: The Immune System in Health and Disease. , 5th ed, Garland Press. New York. (2001).
  3. McDevitt, H. O.

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Cross presentationEndoplasmic Reticulum associated DegradationExogenous Antigen ProcessingDendritic Cell IsolationVesicle Purification ProtocolMicrosome PreparationERAD like TransportUbiquitination AssayAntigen PresentationCellular Compartment Purification

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