Se presenta un protocolo para el establecimiento de un modelo genético de ratón de cáncer colorrectal por infección segmentaria de adenovirus y su vigilancia mediante colonoscopia de alta resolución.
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Artículo de método
Un modelo de ratón de ingeniería genética de cáncer colorrectal esporádico
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Resumen
Resumen
A pesar de las ventajas de la fácil aplicabilidad y rentabilidad, los modelos de ratones de cáncer colorrectal basados en la inyección de células tumorales tienen limitaciones severas y no simulan con precisión la biología tumoral y la diseminación de células tumorales. Se han introducido modelos de ratón genéticamente modificados para superar estas limitaciones; Sin embargo, tales modelos son técnicamente exigentes, especialmente en órganos grandes como el colon en el que sólo se desea un solo tumor.
Como resultado, se desarrolló un modelo inmunocompetente, modificado genéticamente, de cáncer colorrectal que desarrolla tumores muy uniformes y puede usarse para estudios de biología tumoral así como para ensayos terapéuticos. El desarrollo tumoral se inicia mediante la infección quirúrgica segmentaria del colon distal con el virus adeno-cre en ratones mutantes condicionalmente compuestos. Los tumores pueden ser fácilmente detectados y monitorizados vía colonoscopia. Aquí describimos la técnica quirúrgica de la infección segmentaria adeno-cre deEl colon, la vigilancia del tumor vía colonoscopia de alta resolución y presentan los tumores colorrectales resultantes.
Introducción
El cáncer colorrectal (CRC) sigue siendo una de las principales causas de muerte relacionada con el cáncer en los países occidentales. 1 Aunque el pronóstico de los pacientes con enfermedad en estadio temprano es bueno, muchos tumores son diagnosticados en etapas posteriores en los que, a pesar de las numerosas opciones de tratamiento, el pronóstico es limitado. 2 , 3 , 4 , 5
La mayoría de los actuales modelos de CRC de ratones se basan en la implantación de células tumorales derivadas de líneas celulares o tumores de pacientes en ratones inmunodeficientes. 6 , 7 , 8 Esto conduce a local y, dependiendo del sitio de inyección y de las células tumorales utilizadas para inyección, a veces tumores metastásicos. 9 , 10 Sin embargo, los modelos de xenoinjerto resultantes tienen majoR limitaciones. Deben establecerse en ratones inmunodeficientes, eliminando así la interacción compleja entre el tumor y el sistema inmune del huésped. Además, como el estroma tumoral se deriva de las células huésped, la interacción entre el parénquima tumoral humano y el estroma murino es defectuosa y por lo tanto no es representativa de la enfermedad. Estas deficiencias pueden evitarse mediante el uso de líneas de células murinas para inyección. Sin embargo, sólo hay pocas líneas de células de CRC murinas disponibles y, similares a la mayoría de las líneas de células CRC humanas disponibles, son monoclonales y altamente anaplásticas. En resumen, la mayoría de los modelos de ratón CRC actualmente disponibles son altamente artificiales y no son totalmente representativos de la enfermedad humana.
Modelos de ratón genéticamente modificados (GEMM) de CRC pueden evitar estos inconvenientes, ya que presentan verdaderos tumores de ratón que se crean a través de la inducción de las principales mutaciones de CRC en el colon. 12 , 13 ,Esto puede lograrse mediante la activación de las mutaciones de la línea germinal condicional (floxed) por cre recombinasa dentro de la mucosa colorrectal. Mientras que en GEMMs de muchas otras entidades tumorales germline (inducible) cre expresión impulsada por promotores específicos de tejidos se utiliza, línea germinal cre no se puede utilizar en el colon, ya que esto conduce a un gran número de adenomas en todo el colon causando la muerte por tumor benigno carga a Una edad muy joven. Por lo tanto, en el modelo descrito aquí se utiliza un vector adenoviral que expresa cre para infectar un segmento de colon corto. Esto conduce a la inducción de la tumorigénesis dentro de este segmento de la mucosa en un punto de tiempo definido por el investigador, dando lugar a adenomas en última instancia, progresando a carcinoma invasivo y metastásico. Los tumores son verdaderos tumores de ratón, crecen en un microambiente intacto y por lo tanto son capaces de simular la totalidad de la oncogénesis colorrectal incluyendo la interacción tumor-huésped y la cascada metastásica. Este modelo esPor lo tanto, una plataforma atractiva para estudios de biología del cáncer y ensayos terapéuticos preclínicos.
Una de las principales desventajas de los modelos de CRC modificados genéticamente es su complejidad técnica. Se ha descrito anteriormente la administración local de crema usando enemas de adeno-crema rectales en ratones que llevan alelos de Apc floxed; Sin embargo, la incidencia, multiplicidad y localización de los tumores intestinales puede ser altamente variable con esta técnica. Por lo tanto, se ha desarrollado la técnica de confinar la infección adeno-cre por pinzamiento quirúrgico del segmento a inducir. 13 Hemos modificado este procedimiento con el fin de mejorar el bienestar animal, así como reducir la mortalidad y el número de tumores resultantes. Con este protocolo, todos los laboratorios con experiencia en cirugía de roedores pequeños deben ser capaces de reproducir el modelo y producir tumores que sean altamente reproducibles y de fácil acceso a la colonoscopia. Dependiendo del condicional mUvas utilizadas para la tumorigénesis, se puede observar el espectro completo de adenoma, carcinoma invasivo y metástasis. Como los tumores se localizan en el colon distal, la evaluación endoscópica seriada es fácilmente posible en este modelo.
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Protocolo
Los experimentos con animales presentados aquí fueron revisados y aprobados de forma independiente por un Comité institucional y gubernamental de Cuidado y Uso de Animales y se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices de la Federación de Asociaciones de Ciencia Animal de Laboratorio (FELASA). Todas las medidas posibles fueron tomadas para minimizar el sufrimiento incluyendo anestesia y analgesia o, si es necesario, eutanasia prematura.
1. Inducción local del tumor a través de la infección adenovirúrgica quirúrgica
- Preparación de animales para la cirugía
NOTA: Prácticamente cualquier mutación condicional ("floxed") puede ser inducida a través del método aquí descrito. Se recomienda el uso de mutaciones en genes relevantes en cáncer colorrectal como Apc, Kras o Tp53. La eficacia de la recombinación cre es dependiente del tamaño del constructo que se va a extirpar. Las secuencias floxed grandes son excised menos eficientemente. La recombinación de todos los alelos debe ser confirmada en los tumores por PCR.- Para el desarrollo de tumores colorrectales, utilice un cruzamiento de los siguientes alelos condicionales para un modelo básico de CRC (número de base de datos MGI entre paréntesis):
Apc tm2Rak (MGI: 3688435) 16
Kras tm4Tyj (MGI: 2429948) 17
Tp53 tm2Tyj (MGI: 3039263) 18 - Si se requiere un alelo indicador de fluorescencia ( por ejemplo , para detectar micrometástasis), utilice el siguiente alelo:
Gt (ROSA) _ { 26 } S o tm _ { 6 } (CAG - ZsGreen _ {1 }) Hze (MGI: 3809522) 19
NOTA: Todas las cepas anteriores están disponibles a través del NCI Mouse Repository o el Laboratorio de Jackson. No se requiere ayuno, ya que toda la materia fecal restante puede eliminarse antes de la infección adenoviral. El ayuno preoperatorio conduce a una mayor mortalidad perioperatoria y constituye un tremendo estrés para los pequeños roedores. - Utilice sevoflurano a 3 - 3,5% en volumen para anestesia general. Una pérdida de tEl reflejo de pellizcar el dedo del pie indica suficiente anestesia.
- Antes de la primera incisión, inyectar 0,05 mg / kg de buprenorfina por vía subcutánea.
- Cubrir los ojos del ratón anestesiado con pomada oftálmica para evitar la desecación de la córnea.
- Coloque el ratón en posición supina sobre una mesa pequeña. Utilice cintas adhesivas no traumáticas para restringir el ratón.
- Afeitar el abdomen con una máquina de afeitar eléctrica (la crema depilatoria se puede utilizar alternativamente) y desinfectar con los hisopos del alcohol o el yodo. Use el tiempo de contacto recomendado por el fabricante.
- Cubrir el campo quirúrgico con cortinas estériles.
NOTA: El uso de antibióticos perioperatorios es opcional y está sujeto a las pautas institucionales. - Utilice instrumentos estériles de un solo uso o esterilizados para todos los procedimientos quirúrgicos.
- Para el desarrollo de tumores colorrectales, utilice un cruzamiento de los siguientes alelos condicionales para un modelo básico de CRC (número de base de datos MGI entre paréntesis):
- Laparotomía de la línea media y la exposición del colon
- Utilice las tijeras (los escalpelos se pueden utilizar alternativamente) para hacer una incisión de la línea media(~ 15 mm) de la piel en la parte inferior del abdomen.
- Recoger la musculatura de la pared abdominal con fórceps y cuidadosamente incise con tijeras, abriendo así la cavidad abdominal.
- Identificar el colon distal, sólo tocarlo con pinzas atraumáticas. Abrazadera del colon con una pinza delgada ( por ejemplo , una abrazadera vascular Micro Serrefine) aproximadamente 15 mm proximal del ano.
NOTA: Preste especial atención a la vulnerabilidad del colon en todo momento. La perforación conduce inevitablemente a peritonitis y sepsis y requiere eutanasia del animal.
- Infección del colon segmentario con el virus Adeno-cre
- Insertar un tubo de Teflón flexible transanalmente y avanzar cuidadosamente hasta alcanzar la oclusión del lumen lograda por la abrazadera colocada previamente a 15 mm del borde anal. No utilice el exceso de fuerza, ya que esto puede provocar perforación.
- Cannulate el tubo con una cánula 30G, conecte una jeringuilla estándar de 1 mL y enjuague el coloN con solución salina normal con el fin de evacuar la materia fecal restante. Esto puede requerir varios ml de solución salina.
- Una vez que el colon distal está vacío quitar el tubo y reemplazarlo con un tubo de Teflon fresco y de nuevo la posición directamente distal a la abrazadera como se describe anteriormente.
- Ocultar el colon con una segunda pinza ~ 3 mm distal a la abrazadera proximal ( es decir , sobre el tubo insertado, ~ 12 mm desde el borde anal), resultando en un segmento aislado de 3 mm para ser infectado.
NOTA: Para la oclusión distal del segmento, los clips de la arteria coronaria de Fogarty han demostrado ser los más adecuados ya que están cauchutados, lo que lleva a una oclusión del colon a pesar del tubo intraluminal entre las ramas de la abrazadera. - Utilice una segunda jeringa (1 ml estándar con una cánula de 30 G) para inyectar cuidadosamente 50 a 80 μL de tripsina-EDTA al 0,25% en el segmento de colon fijado e incubar durante 10 min. Deje la cánula y la jeringa unidas al tubo de Teflón para evitar que el líquido se filtre hacia atrás.
NOTA: El colon debe ser inflado para romper la barrera mucosal y llegar a las células madre de la cripta, pero no demasiado inflado para evitar la perforación del segmento sujetado. - Primero quite la abrazadera distal, y luego el tubo de tripsina.
- Enjuague el colon distal con ~ 500 μL de solución salina normal para eliminar la tripsina restante.
- Inserte un nuevo tubo de Teflón, vuelva a colocar la abrazadera distal e infle el segmento de colon con 50 - 80 μl de solución adenoviral (10 11 unidades formadoras de placas (PFU) / ml en solución salina tamponada con fosfato) e incube durante 30 min Figura 2A ).
NOTA: No derrame la solución viral ya que el contacto con el adenol puede conducir al desarrollo del tumor en cualquier tejido de ratones mutantes condicionalmente. - Retire las abrazaderas y el tubo.
- Cierre del abdomen y recuperación postoperatoria
- Cierre la pared abdominal con 6-0 de absorción rápida(Por ejemplo , polidioxanona (PDS)).
- Cierre la piel con clips para heridas quirúrgicas.
- Coloque el ratón sobre la almohadilla calentadora ajustada a 38 ° C hasta que se haya recuperado completamente de la anestesia.
- Administrar otro bolo de buprenorfina ip 0,05 mg / kg 12 h después de la cirugía, seguido de bolos adicionales de buprenorfina cada 12 h si es necesario.
- Vigilar a los ratones al menos una vez al día para detectar signos de angustia debido al crecimiento del tumor.
2. Colonoscopia
NOTA: Dependiendo de las mutaciones condicionales utilizadas, la infección adenoviral conduce a tumores endoscópicamente visibles dentro de 2 a 4 semanas. Por lo tanto, realice la primera colonoscopia postoperatoria 2 semanas después de la inducción adenoviral y repita cada 2 semanas. Se recomienda un sistema disponible comercialmente para la colonoscopia murina. 20
- Preparación de animales para colonoscopia
NOTA: No hay necesidad de ayunoEd. La materia fecal restante suele estar bien formada en el colon distal y puede ser empujada más allá del tumor durante la colonoscopia, lo que hace innecesario el proceso estresante del ayuno repetido.- Utilice sevoflurano a 3 - 3,5% en volumen para anestesia general. Una pérdida del reflejo de pinza del dedo del pie indica suficiente anestesia.
- Cubrir los ojos de los ratones anestesiados con pomada oftálmica para evitar la desecación de la córnea.
- Retenga los ratones en posición supina sobre una mesa pequeña.
- Colonoscopia
- Insertar el espacio (diámetro 1,9 mm, longitud 10 cm) en el tracto intestinal a través del ano y cuidadosamente insuflar aire bajo control visual para distender el colon. No inflar más aire de lo necesario para el examen.
NOTA: Para la insuflación de aire, se puede usar la bomba de aire anti-niebla del sistema de colonoscopia. Si no hay bomba de aire antiniebla disponible, se puede usar cualquier otra bomba de aire con ajustes de presión muy baja, o preAire ssurized con una válvula de reducción de presión delicado. El dióxido de carbono (CO 2 ) conduce fácilmente a la acidosis en roedores pequeños y debe ser evitado. - Cuidadosamente empuje el alcance hacia adelante hasta que una lesión mucosa en el colon distal puede ser identificado ( Figura 1A - 1D ).
- Guarde las imágenes endoscópicas para una evaluación posterior. Se ha descrito anteriormente un sistema de puntuación endoscópica para tumores intraluminales. 20
- Retire con cuidado el alcance y coloque el ratón sobre la almohadilla calentadora ajustada a 38 ° C hasta que se haya recuperado completamente de la anestesia.
- Insertar el espacio (diámetro 1,9 mm, longitud 10 cm) en el tracto intestinal a través del ano y cuidadosamente insuflar aire bajo control visual para distender el colon. No inflar más aire de lo necesario para el examen.
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Resultados
Si se realiza adecuadamente,> 85% de los animales desarrollan tumores. La mortalidad del procedimiento quirúrgico aquí presentado es <5%, la mortalidad de la colonoscopia es prácticamente inexistente. En la mayoría de los ratones, se detecta una sola lesión; En aproximadamente el 30% se pueden detectar 2 - 3 adenomas pequeños que usualmente se fusionan a un solo tumor dentro de 2 a 3 semanas después de la inducción del tumor.
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Discusión
Mientras que son generalmente fáciles de generar y de mantener, los modelos clásicos del ratón del CRC basados en la inyección de la línea celular son artificiales y no pueden recapitulate completamente la enfermedad humana. Como consecuencia, se han desarrollado GEMMs. El primer CRC GEMM fue el ratón Apc Min , que alberga una mutación nula heterocigótica en el gen Apc, por lo tanto imitando la enfermedad hereditaria humana poliposis adenomatosa familiar (FAP). Sin embargo, los ratones Apc Min de...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo está dedicado a la memoria del profesor Moritz Koch.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Reactivos / consumibles | |||
| Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco | Life Technologies GmbH | 14190169 | |
| Tripsina-EDTA (0,25%, fenol-rojo) | Life Technologies GmbH | 25200072 | |
| solución salina normal 0,9% (E154) | Serumwerk Bernburg AG | 10013 | |
| Aqua ad injectabilia | B. Braun Melsungen AG | 235144 | |
| Ad5CMV-Cre (adenovirus, c = 2E+11 PFU/mL) | Vector de transferencia de genes Core Universidad de Iowa | ||
| 15 mL, 50 mL tubos de centrífuga | Greiner Bio-One GmbH | 188271/227270 | |
| Tubos Eppendorf 1,5 mL/ 2 mL | Sarstedt AG & Co. | 72.695.400 | |
| Placa de Petri PS 100/15 mm (estéril, Nuclon) | Fisher Scientific GmbH | 10508921/ NUNC150350 | |
| Jeringa de 1 mL (sin volumen muerto) - Injekt-F SOLO | Braun/neoLab | 194291661 | |
| aguja de inyección de 30G | BECTON DICKINSON | 304000 | |
| Name | Company | Número de catálogo | Comments |
| Analgesia / anestesia | |||
| Sevoflurane (Sevoflurane AbbVie) | AbbVie Germany GmbH & Co. KG-Medical | ||
| oxygen | Air Liquide Medical | ||
| (Temgesic) | Indivior Eu Ltd. | - | |
| Bepanthen - ungüento oftálmico | Bayer Vital GmbH | 10047757 | |
| Máquina de anestesia de investigación de mesa x/O2 Flush con vaporizador de sevoflurano | Parkland Scientific | V3000PS/PK | |
| strong>Name | Company | >Número de catálogo | Comments |
| celulosa | Lohmann & Rauscher Deutschland | 13356 | |
| Jeringa de insulina EMG 1 mL (con cánula de 30 G) | B. Braun Melsungen AG | 9161627S | |
| Tubo de diámetro fino (diámetro: 0,28 mm/ diámetro: 0,61 mm) | Smiths Medical Deutschland | 800/100/100 | |
| Micro-Adson Pinzas | de ciencia fina Herramientas | 11018-12 | |
| Tijera de iris - ToughCut | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Portaagujas Olsen-Hegar | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| AutoClip Kit | Fine Science Tools | 12020-00 | |
| PDS Z1012H 6/0 C1 (sutura quirúrgica) | Johnson & Johnson Medical GmbH | Z1012H | |
| Abrazadera vascular Micro Serrefine curvada | Fine Science Tools | 18055-05 | |
| Clips de resorte Fogarty | Edwards | CDSAFE 6 | |
| Placa calefactora 062 | Labotect | 13854 | |
| Isis - Afeitadora de pelo | Aesculap - Braun | - | |
| Name | Company | >Número de catálogo | >Comments |
| Colonoscopia | |||
| Cold Light Fountain XENON 175 SCB Karl | Storz | 20132101-1 | Karl Storz Cable |
| fibra óptica | Karl Storz | 69495NL | Karl Storz Coloview System Mainz |
| TRICAM Cabezal de cámara de tres chips | Karl Storz | 20221030 | Karl Storz Coloview System Mainz |
| TRICAM SLII Unidad de control de cámara | Karl Storz | 20223011-1 | Karl Storz Coloview System Mainz |
| Monitor de pantalla plana de 15" EndoVue | Karl Storz | 9415NN | Karl Storz Coloview System Mainz Mainz |
| Telescopio HOPKINS Straight Forward diámetro 1,9 mm; longitud 10 cm esterilizable en autoclave transmisión de luz de fibra óptica incorporada | Karl Storz | 64301AA | |
| funda de protección y examen | Karl Storz | 61029C |
Referencias
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