Este protocolo describe un método para la observación de embriogénesis en Arabidopsis vía separación de óvulo, seguido por la inspección de la formación de patrones de embrión bajo un microscopio.
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Artículo de método
Un método para la caracterización de embriogénesis en Arabidopsis
En este artículo
Resumen
Resumen
Dada la naturaleza altamente predecible de su desarrollo, embriones de Arabidopsis se han utilizado como modelo de estudios de morfogénesis en plantas. Sin embargo, embriones en fase temprana de plantas son pequeños y contienen pocas células, haciéndolas difíciles de observar y analizar. Aquí se describe un método para caracterizar la formación de embriones de la planta bajo el microscopio utilizando el organismo modelo Arabidopsis. Tras la separación de óvulos frescos usando solución de Hoyer, pudieran observarse el número de celular de y morfología de los embriones, y su etapa de desarrollo podría ser determinado por microscopía de contraste de interferencia diferencial usando un 100 X lente de inmersión de aceite. Además, la expresión de proteínas del marcador específico etiquetadas con proteína fluorescente verde (GFP) fue supervisada para anotar la especificación de identidad de la célula durante el dibujo de embrión por microscopía de láser confocal. Así, este método puede utilizarse para observar la formación de embriones de la planta de tipo salvaje a nivel celular y molecular y caracterizar el papel de genes específicos en modelar embrionario mediante la comparación de la formación de patrones en los embriones de las plantas de tipo silvestre y mutantes letales para el embrión. Por lo tanto, el método puede utilizarse para caracterizar la embriogénesis en Arabidopsis.
Introducción
Embriogénesis es el evento más temprano en el desarrollo de las plantas superior. Una forma de embriones maduros de un cigoto por división celular y diferenciación bajo estricto control genético1,2. Embriones de Arabidopsis son un modelo útil para estudiar el control de la morfogénesis porque la secuencia de divisiones celulares durante la embriogénesis sigue un patrón esperado3,4. Sin embargo, un embrión de Arabidopsis con una a varias células es demasiado pequeño para ser observado y analizado. Además, la mutación de ciertos genes p....
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Protocolo
Nota: Este protocolo tiene tres partes: 1) observando la formación de patrones en embriones de Arabidopsis de tipo salvaje utilizando microscopía DIC; 2) caracterizar el embrión patrón formación a través de la observación de la expresión de la proteína del marcador mediante láser confocal de barrido microscopía; y 3) determinar el papel de un gen específico en la embriogénesis (usando el mutante de naa10 como ejemplo).
1. el óvulo claro
- Preparación de material de planta
Nota: El protocolo descrito aquí es un ejemplo de cómo hacer crecer plantas sanas; otras maneras de crecer plantas....
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Resultados
El método descrito en este documento puede utilizarse para observar la embriogénesis directamente bajo un microscopio, anotar la especificación de identidad celular durante la embriogénesis con marcadores específicos y caracterizar el papel de un gen en particular durante la embriogénesis.
Resultados representativos a partir del análisis de patrones (de la etapa de cigoto alargada a la etapa madura del bastón) en el tipo salvaje.......
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Discusión
Óvulo es un método útil para detectar la división celular y la evaluación de morfología durante la embriogénesis en Arabidopsis; usando esta técnica, embriones pueden ser observados directamente bajo DIC microscopía5,12. El paso crítico para la remoción del óvulo es paso 1.3.4. El tiempo requerido para la remoción del óvulo en el paso 1.3.4 es variable. Embriones en la etapa de 2/4-cell pueden observarse claramente después de 2 h en solución de Hoyer, qu.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos a Dr. Jessica Habashi para la lectura crítica del manuscrito. Agradecemos a Dr. Xianyong Sheng de la centro de la imagen, Facultad de Ciencias de la vida, Capital Normal University (Beijing, China), para realizar la localización de ensayo DR5-GFP . Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación de Ciencias de Gobierno Municipal de Beijing (CIT & TCD20150102) y de la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (31600248).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Hidrato de cloral | Sigma | 15307 | |
| Murashige y Skoog Medio basal | Sigma | M5519 | |
| Phytagel | Sigma | P8169 | |
| Higromicina | Roche | 10843555001 | |
| Cámara de crecimiento | Percival | CU36L5 | |
| Microscopio de fluorescencia | Zeiss Oberkochen | Zeiss Image M2 | cámara: AxioCam 506 color |
| Microscopía de escaneo láser confocal | Zeiss Oberkochen | Zeiss LSM 5 | filtros: BP 495 - 555 nm |
| Estereoscopio | Zeiss Oberkochen | Axio Zoom V16 | cámara: AxioCam MRc5 |
| suelo rico en nutrientes | KLASMANN, Alemania | ||
| Tubo de 50 ml | Corning Inc. | ||
| Tubo de 1,5 ml | Corning Inc. | ||
| de hipoclorito de sodio al 10% | Reactivo analítico doméstico | ||
| sacarosa | Reactivo analítico doméstico | ||
| KOH | Reactivo analítico doméstico | ||
| glicerol | Reactivo analítico doméstico | ||
| placa de cultivo Suministros | domésticos | ||
| Vermiculita | Suministros domésticos | ||
| portaobjetos de | Suministros | ||
| domésticos aguja de jeringa | Suministros domésticos | ||
| pinzas de punta fina | Suministros domésticos | ||
| banco | Equipo doméstico |
Referencias
- Jenik, P. D., Gillmor, C. S., Lukowitz, W. Embryonic patterning in Arabidopsis thaliana. Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 207-236 (2007).
- Lau, S., Slane, D., Herud, O., Kong, J., Jurgens, G. Early embryogenesis in flowering plants: setting up the basic body pattern. Annu Rev P....
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Reimpresiones y permisos
Etiquetas
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