Espectroscopia de la fuerza de las moléculas de proteína sola utilizando un microscopio de fuerza atómica

Resumen

Se describen los procedimientos y estrategias para medir las propiedades mecánicas y las vías despliegue mecánicas de las moléculas de proteína sola utilizando un microscopio de fuerza atómica. También mostramos resultados representativos como referencia para la selección y justificación de las grabaciones de molécula única de proteína buena.

Resumen

La determinación del proceso de plegado de las proteínas de su secuencia de aminoácidos en su estructura 3D nativa es un problema importante en biología. Microscopía de fuerza atómica (AFM) puede solucionar este problema permitiendo el estiramiento y relajación de las moléculas de proteína única, que da una evidencia directa de despliegue y refolding características específicas. Basada en AFM solo-molécula-espectroscopia de fuerza (AFM-SMF) proporciona un medio para medir consistentemente alta energía conformaciones de las proteínas que no son posibles en las mediciones (bioquímicos) a granel tradicionales. Aunque numerosos artículos fueron publicados para mostrar principios de AFM-SMF, no es fácil llevar a cabo experimentos de SMF debido a la falta de un protocolo de manera exhaustiva completa. En este estudio, nos ilustran brevemente los principios de la AFM y detalle ampliamente los protocolos, procedimientos y análisis de datos como guía para lograr buenos resultados de los experimentos de SMF. Demostramos representante SMF resultados de proteína único mecánico despliegue mediciones y proporcionar resolución de problemas estrategias algunos comúnmente encontrado problemas.

Introducción

Avances en espectroscopía de fuerza sola molécula (SMF) por AFM permitieron manipulación mecánica y caracterización precisa de las moléculas de proteína sola. Esta caracterización ha producido nuevos insights sobre proteína mecánica^1,2, proteína plegable³, de las interacciones proteína-ligando⁴, de las interacciones proteína-proteína⁵, y basados en proteína de ingeniería materiales^6,7,8. SMF es especialmente útil para el estudio de proteína desple....

Protocolo

1. preparación de la proteína

1. Clonación de ADN.
   1. Sintetizar una secuencia de ADN de interés, por ejemplo, la secuencia de ADN de NI₁₀C¹⁰, o aislar mediante PCR del organismo anfitrión mediante técnicas de biología molecular estándar¹¹. Flanquean el gen de interés, con sitios de restricción durante la síntesis o mediante la colocación de sitios en el extremo 5' de los cebadores de la PCR para corresponder a un módulo en el plásmido pEMI91 (Addgene #74888)¹².
   2. Digerir por separado el plásmido pEMI91¹² y la secuencia de ADN de int....

Resultados

Resultados representativos de este protocolo se muestran en la figura 2. Ambos paneles muestran las curvas de fuerza representativa-extensión de proteínas. La parte superior muestra los resultados de una poliproteína I91, mientras que la parte inferior muestra la proteína I91 flanqueando un proteína de interés, la molécula de₁₀C de NI. Estas grabaciones muestran la fuerza característica de I91 (200 pN) y el incremento de la longitud del contorno (2.......

Discusión

Un paso crítico en el protocolo es el uso de una poliproteína, descrito en el paso 1.1.2, que sirve como un control positivo a la "huella digital" eventos de una sola molécula. Generalmente, allí debe ser desplegar eventos de las proteínas de la poliproteína (I91, esto significa una fuerza de despliegue de unos 200 pN y contorno incremento de longitud de aproximadamente 28 nm) a concluir inequívocamente que la proteína de interés se ha revelado. Por ejemplo, cuando la proteína del interés está flanqueada por tres dominio.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Discos de muestra AFM, 15 mm de diámetro	Ted Pella, Inc.	16218	Sirve como base para sustrato de vidrio
Cubreobjetos de vidrio redondos, 15 mm de diámetro No.1 Grueso	Ted Pella, Inc.	26024	sirven como sustrato de vidrio y base para
las pestañas adhesivas de recubrimiento de	Ted Pella, Inc.	16079	Pegar en los discos de muestra AFM para proporcionar una cara adhesiva para fijar cubreobjetos
de vidrio Conjunto de cabezal multimodo STD	Bruker Nano Inc.	1B75C	Cabezal AFM
Soporte de sonda de vidrio	Bruker Nano Inc.	MTFML-V2	Soporte de sonda de vidrio para escaneo en fluido con el AFM MultiMode.
Sondas AFM de Microlever	Bruker Nano Inc.		Voladizos de nitruro de silicio MLCT con puntas de nitruro de silicio, ideales para modos de imagen de contacto
Sondas AFM con puntas recubiertas de Au	Bruker Nano Inc.	OBL-10	Voladizos para tirar de proteínas con baja fuerza de despliegue
Tarjeta de adquisición de datos (DAQ) multifunción, 16 bits, 1 MS/s (multicanal), 1,25 MS/s (1 canal), 32 entradas analógicas	de datos PCI-6259	National Instruments	para señales de cabezal AFM y actuadores piezoeléctricos
LISA Actuadores de etapa piezoeléctricos lineales LISA	Physik Instrumente LP	P-753.11C	Actuador piezoeléctrico para controlar la posición del sustrato y realizar mediciones de tracción
XY Piezo Stage	Physik Instrumente LP	P-541.2CD	Actuador piezoeléctrico para controlar la posición del sustrato y escanear la superficie del sustrato

oro Adquisición de