En este artículo, se discute un protocolo detallado para cuantificar la longitud de los telómeros usando un análisis de fragmentos de restricción terminal modificado que proporciona una medición directa rápida y eficiente de la longitud de los telómeros. Esta técnica puede aplicarse a una variedad de fuentes celulares de ADN para cuantificar la longitud de los telómeros.
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Artículo de método
Análisis de fragmentos de restricción de terminales modificados para cuantificar longitud de telómeros mediante hibridación en gel
En este artículo
Resumen
Resumen
Existen varias técnicas diferentes para medir la longitud de los telómeros, cada una con sus propias ventajas y desventajas. El enfoque tradicional, el análisis de fragmentos de restricción Telomere (TRF), utiliza una técnica de hibridación de ADN mediante la cual las muestras de ADN genómico son digeridas con enzimas de restricción, dejando atrás las repeticiones del telómero y algún ADN sub-telomérico. Éstos se separan mediante electroforesis en gel de agarosa, se transfieren a una membrana de filtro y se hibridan con sondas de oligonucleótidos marcadas con quimioluminiscencia o radioactividad para visualizar fragmentos de restricción de telómeros. Este enfoque, aunque requiere una mayor cantidad de ADN que otras técnicas como la PCR, puede medir la distribución de la longitud de telómeros de una población de células y permite la medición expresada en kilobases absolutas. Este manuscrito demuestra un procedimiento de hibridación de ADN modificado para determinar la longitud de los telómeros. El ADN genómico se digiere primero con enzimas de restricción (que no se cortanTelómeros) y separados por electroforesis en gel de agarosa. El gel se seca entonces y el ADN se desnaturaliza y se hibrida in situ a una sonda oligonucleotídica radiomarcada. Esta hibridación in situ evita la pérdida de ADN del telómero y mejora la intensidad de la señal. Después de la hibridación, se forman imágenes de los geles utilizando pantallas de fósforo y se cuantifica la longitud del telómero utilizando un programa de representación gráfica. Este procedimiento fue desarrollado por los laboratorios de los Dres. Woodring Wright y Jerry Shay en la Universidad de Texas Southwestern 1 , 2 . A continuación se presenta una descripción detallada de este procedimiento, con algunas modificaciones.
Introducción
Los telómeros, situados en los extremos de los cromosomas, son repeticiones nucleotídicas de la secuencia TTAGGG (en los cromosomas humanos) que juegan un papel crítico en la protección de la información genética celular 3 , 4 , 5 . Los telómeros tienen varios miles de pares de bases de longitud y sirven para proteger la integridad del resto del cromosoma durante la replicación del ADN. La replicación de los cromosomas no es perfecta, resultando en que los extremos del cromosoma no estén completamente copiados. Esta ineficiencia en la replicación se denomina el "problema de ....
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Protocolo
1. Extracción de ADN genómico
- Realizar una extracción de ADN genómico de las células (en este caso, la línea celular BJ-hTERT) para ser analizado utilizando un kit comercial de extracción de ADN, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Medir la concentración de ADN con un espectrofotómetro. Si la concentración de ADN es inferior a 100 μg / ml, precipitar el ADN con etanol y resuspender en un volumen de tampón TE (Tris-Cl 10 mM, EDTA 0,1 mM (ácido etilendiaminotetraacético), pH 8.0), para asegurar una concentración de ADN de 100 - 600 mu g / ml).
2. Evaluación de la integridad del ADN
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Resultados
Se analizaron tres concentraciones de ADN (1, 2 y 3 μg) aisladas de la línea celular BJ-hTERT (fibroblastos de prepucio humano inmortalizado con telomerasa) 22 y células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) humanas para determinar la longitud de los telómeros. La Tabla 1 muestra las asignaciones de carriles para cada muestra de ADN. La Figura 1 muestra una tinción fluorescente de ácido nucleico del gel. Los patr.......
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Discusión
Después de la electroforesis, el frotis de ADN genómico es superior a 800 pb. Esto puede ocurrir si las enzimas de restricción son defectuosas o si se necesitan enzimas adicionales (como se ha descrito anteriormente). Una segunda explicación posible es que la proteína todavía está unida al ADN. Cuando se determina la concentración de ADN por espectrofotómetro, la relación 260/280 debe ser de alrededor de 1,8. Si esta proporción es <1,5, hay contaminación de proteínas que puede interferir con la digestión con enzimas .......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores reconocen el apoyo de la Universidad de Pittsburgh Cancer Institute Biobehavioral Oncología instalación compartida que es apoyado en parte por el premio P30CA047904.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Biologics | |||
| Rsa1, enzima de restricción | New England Biolabs, Inc | R0167S | 10,000 U/mL, digestión de ADN Viene con Cutsmart Buffer (tampón de digestión) |
| Hinf1, enzima de restricción | New England Biolabs, Inc | R0155S | 10,000 U/mL, digestión de ADN. Viene con Cutsmart Buffer (tampón de digestión) |
| Seakem GTG Agarose | Lonza | 50071 | grado de electroforesis |
| agarosa Optikinase | affymetrix | 78334X 500 UN | T4 Polinucleótido quinasa |
| SYBR Tinción de ácido nucleico verde I | ThermoFisher Scientific | S7567 | Syber |
| Green Escalera de ADN exactGene 24- kB | Fisher Scientific | BP2580100 | |
| Sonda de hebra C (3'-(G3AT2)4-'5) | Tecnologías de ADN integradas | Oligonucleótido de ADN pedido a medida | |
| Gamma-ATP-P32 | Perkin Elmer | BLU502Z | Radioisótopo |
| Qiagen Sangre y cultivo celular Mini kit de ADN | Qiagen | 13323 | Kit de extracción de ADN |
| GE Illustra Microspin G-25 columna | GE Healthcare Life Sciences | 27-5325-01 | Para la purificación de la sonda de oligonucleótidos readioactivos |
| Ficoll 400 | sintético no iónico | ||
| Equipo/Software | |||
| Sistema de electroforesis en gel Owl A5 (20 cm x 25 cm) | ThermoFisher Scientific | A5 | |
| electroforesis en gel Horizon 11.4 (11 cm x 14 cm) | Corel Life Sciences | 11068020 | Electroforesis en gel |
| Malla de nylon, 50, 12" x 12" | Ted Pellam, Inc | 41-12105 | |
| Pantallas de fósforo de almacenamiento GE | GE Healthcare Ciencias de la Vida | 28-9564-75 | |
| Pantalla de fósforo Casete de exposición | GE Healthcare Ciencias de la Vida | 63-0035-44 | |
| Incubadora de hibridación Isotemp | Fisher Scientific | 13-247-20Q Tubos | |
| cilíndricos de hibridación | Fisher Scientific | 13-247-300 | |
| The Belly Dancer agitador orbital | Sigma-aldrich | Z768499-1EA | Agitador orbital |
| Typhoon 9400 | ABI | Para la obtención de imágenes de geles y pantallas de fósforo | |
| GraphPad Prisma 6 | GraphPad | versión 6.05 | Programa de gráficos |
| Microsoft Excel | Microsoft | Office 365 | Programa de hojas de cálculo |
| Nanodrop | Thermo Scientific | Espectrofotómetro | Nanodrp 2000 |
Referencias
- Herbert, B. S., Shay, J. W., Wright, W. E. Analysis of telomeres and telomerase. Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 18 Unit 18 16(2003).
- Mender, I., Shay, J. W. Telomere Restriction Fragment (TRF) Analysis. Bio Protoc. 5 (22), (2015).
- Blackburn, E. H.
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Reimpresiones y permisos
