Reprogramación de primario líquido amniótico y las células de la membrana a pluripotencia en condiciones libres de Xeno

Summary

Este protocolo describe la reprogramación de primaria amniótico líquido y membrana de las células madre mesenquimales en células pluripotentes inducidas mediante un enfoque episomal no integrar en condiciones totalmente químicamente definidas. Se detallan los procedimientos de extracción, cultivo, reprogramación y caracterización de las células pluripotentes inducidas resultante por métodos rigurosos.

Abstract

Terapias basadas en células autólogas consiguieron un paso más a la realidad con la introducción de células madre pluripotentes inducidas. Células madre fetales, líquido amniótico y células madre mesenquimales en membrana representan un tipo especial de células indiferenciadas con promesa en la ingeniería de tejidos y de reprogramación en iPSC para futuras intervenciones pediátricas y banca de la célula de vástago. El protocolo que presentamos describe un procedimiento optimizado para la extracción y cultivo primario amniótico líquido y membrana de las células madre mesenquimales y generando episomal inducida por células pluripotentes de estas células en cultura totalmente químicamente definida condiciones de utilización de vitronectina recombinante humana y el medio de E8. También se describe la caracterización de las nuevas líneas mediante la aplicación de métodos rigurosos – citometría de flujo, proyección de imagen confocal, formación de teratoma y perfilamiento transcripcional. Las líneas recién generadas expresan marcadores de células madre embrionarias – Oct3/4A, Nanog, Sox2, TRA-1-60, TRA-1-81, SSEA-4, mientras que siendo negativo para el marcador SSEA-1. Las líneas de células madre forman teratomas en ratones scid-beige en 6-8 semanas y los teratomas contienen tejidos representativos de las tres capas del germen. Transcripcional de perfiles de las líneas mediante la presentación de datos de microarrays de expresión global a un algoritmo de evaluación bioinformática pluripotencia consideran todas las líneas pluripotentes y por lo tanto, este enfoque es una alternativa atractiva a los ensayos con animales. Las nuevas líneas de iPSC pueden utilizarse fácilmente en experimentos posteriores con la optimización de la diferenciación y la ingeniería de tejidos.

Introduction

La tecnología de células madre pluripotentes inducidas (iPSC), trae consigo potenciales terapias de reemplazo celular, enfermedad y desarrollo modelado y drogas y detección toxicológica^1,2,3. Terapias de reemplazo de expresiones se logra por la inyección de la célula, in vitro había distinguido implantación de tejido (como los parches cardíacos), o la regeneración guiada mediante ingeniería de tejidos. Líquido amniótico (AFSC) y células de membrana (AMSC) son una excelente fuente de células para estas intervenciones ya sea directamente^4,

Protocol

El protocolo sigue las directrices del Comité de ética para la investigación en humanos. Se obtuvo consentimiento por escrito del paciente para usar el líquido amniótico para la investigación.

Este protocolo sigue las políticas de cuidado de Animal institucional y Comité de uso de la Universidad de Alabama del sur.

1. aislamiento y cultivo de células mesenquimales amniótico primaria

1. Placas de células del líquido amniótico
   1. Obtener un mínimo de 2.5 mL de líquido amniótico que se cosechan en el proceso de la amniocentesis por un médico.
      Nota: Toda la gestión de células vivas ....

Results

Consentimiento informado se obtuvo de pacientes antes de la cosecha de líquido amniótico para realizar pruebas genéticas y dedicar una pequeña alícuota del líquido para la investigación. Ningún consentimiento es necesario para el uso de la membrana amniótica en la investigación como la placenta representa la eliminación de residuos. Amniótico líquido y membrana de las células madre mostrar propiedades mesenquimales típicos, morfológicamente las células son fusiformes y fase luminosa. Repr.......

Discussion

La fase inicial de generación de iPSC de células madre fetales consiste en la extracción de las células de origen de los tejidos fetales, su cultura, la expansión y la introducción de la plásmidos reprogramación episomal. Esta fase es seguida por un período de cultivo de alrededor de 14-18 días antes de las primeras colonias totalmente reprogramadas pueden ampliarse. La última fase es la maduración de los clones de iPSC. La extracción inicial de las células de vástago de la membrana amniótica se consigue mediante una dig.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kit de disociación tumoral, humano	Miltenyi Biotec	130-095-929	sistema de disociación de tejidos, kit de reactivos, incluye tubos de disociación de tejidos y enzimas de disociación de tejidos
gentleMACS Disociator	Miltenyi Biotec	130-093-235	sistema de disociación de tejidos, disociador
Thermo Scientific™ Shandon&comercio; Bisturí desechable n.º 10, estéril, envuelto individualmente, 5,75 (14,6 cm)	Thermo-Fisher	3120032
70 y micro; filtros de celdas m	Corning	10054-456
RPMI 1640 medio	Thermo-Fisher	32404014
plataforma mecedora	VWR	40000-300
Tubos de centrífuga de 50 ml	Thermo-Fisher	339652
tubos de centrífuga de 15 ml	Thermo-Fisher	339650
EBM-2 medio basal	Lonza	CC-3156	para medio AFMC
FGF 2 Humano (expresado en E. coli, no glicosilado)	Prospec Bio	CYT-218	bFGF, suplemento para el medio AFMC
EGF Humano, Pichia	Prospec Bio	CYT-332	EGF, suplemento para el medio AFMC
LR3 Insulin Like Growth Factor-1 Human Recombinant	Prospec Bio	CYT-022	IGF, suplemento para medio AFMC
Suero fetal bovino, calificado para células madre embrionarias	Thermo-Fisher	10439024	FBS
Antibiótico-Antimicótico (100X)	Thermo-Fisher	15240062	para AFSC/AMSC primario, para AFSC/AMSC de rutina no debería ser necesario, ¡no lo use en medio para células transfectadas!
Accutase solución de desprendimiento de células	StemCell Technologies	07920	enzima de desprendimiento de células
CryoStor™ CS10	StemCell Technologies	07930	medio de congelación completo
PBS, pH 7.4	Thermo-Fisher Scientific	10010023
EndoFree Plasmid Maxi Kit (10)	Qiagen	12362	para el aislamiento de plásmidos
pEP4 E02S EN2K	Addgene	20925	EN2K, factores de reprogramación Oct4+Sox2, Nanog+Klf4
pEP4 E02S ET2K	Addgene	20927	ET2K, factores de reprogramación Oct4+Sox2, SV40LT+Klf4
pCEP4-M2L	Addgene	20926	M2L, factores de reprogramación c-Myc+LIN28
Espectrofotómetro UV-Vis NanoDrop 2000c	Espectrofotómetro	Thermo-Fisher	ND-2000C
Neon® Sistema de transfección	Thermo-Fisher	MPK5000	sistema de transfección, componentes: Pipeta de neón - pipeta de transfección Dispositivo de neón - dispositivo de transfección
Neon® Sistema de transfección 10 µ L Kit	Thermo-Fisher	MPK1025	kit de consumibles para el sistema de transfección de neón, contiene: Punta de neón - punta de transfección Tubo de neón - tampón de tubo de transfección R - tampón de resuspensión tampón E - tampón electrolítico
Stemolecule™ Butirato de sodio	StemGent	04-0005	potenciador de molécula pequeña de reprogramación
TeSR-E8	StemCell Technologies	05940	E8
medio Vitronectina XF™	StemCell Technologies	07180	VTN, concentración de existencias 250 y micro; g/ml, utilizado para el recubrimiento a 1 y micro; g/cm2 en tampón de dilución de vitronectina (CellAdhere
) CellAdhere™ Tampón de dilución	StemCell Technologies	07183	tampón de dilución de vitronectina
UltraPure™ 0,5M EDTA, pH 8,0	Thermo-Fisher	15575020	diluir con PBS a 0,5 mM antes de usar
EVOS® FL Sistema	de imagen Thermo-Fisher Scientific	AMF4300	LCD sistema de microscopio
de imagen CKX53 Microscopio invertido Microscopio	cultivo celular con contraste de fase	Olympus
Pierce™ 16% de formaldehído (p/v), sin metanol	Thermo-Fisher	28908	diluido al 4% con PBS antes de su uso, diluido se puede almacenar a 2-8 grados; C durante 1 semana
Perm Buffer III	BD Biosciences	558050	tampón de permeabilización, enfriar hasta -20 & deg; C antes de usar
Mouse IgG1, κ Control de isotipos, Alexa Fluor® 488	BD Biosciences	557782	control de isotipos para Oct3/4A, Nanog
Mouse IgG1 y kappa; Control de isotipos, Alexa Fluor® 647	BD Biosciences	557783	control de isotipos para Sox2
Mouse anti-humano Oct3/4 (Isoforma A humana), Alexa Fluor® 488	BD Biosciences	561628
Ratón anti-humano Nanog, Alexa Fluor® 488	BD Biosciences	560791
Ratón anti-humano Sox-2, Alexa Fluor® 647	BD Biosciences	562139
Ratón IgGM, κ Control de isotipos, Alexa Fluor® 488	BD Biosciences	401617	control de isotipos para TRA-1-60
Mouse IgGM, κ Control de isotipos, Alexa Fluor® 647	BD Biosciences	401618	control de isotipos para TRA-1-81
Ratón antihumano TRA-1-60, Alexa Fluor® 488	BD Biosciences	330613
Ratón antihumano TRA-1-81, Alexa Fluor® 647	BD Biosciences	330705
Ratón IgG1, κ Control de isotipos, Alexa Fluor® 488	BD Biosciences	400129	control de isotipos para IgG3 de ratón SSEA-1
, κ Control de isotipos, Alexa Fluor® 647	BD Biosciences	401321	control de isotipos para SSEA-4
Ratón anti-humano SSEA-1, Alexa Fluor® 488	BD Biosciences	323010
Ratón anti-humano SSEA-4, Alexa Fluor® 647	BD Biosciences	330407
Affinipure F(ab')2 Fragmento Cabra Anti-Ratón IgG+IgM, Alexa Fluor® 488	Jackson Immunoresearch	115-606-068	úselo a una dilución de 1:600 u optimice aún más
Affinipure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM, Alexa Fluor® 647	Jackson Immunoresearch	115-546-068	úselo a una dilución de 1:600 u optimice aún más
DAPI	Thermo-Fisher Scientific	D21490	solución madre 10 mM, diluya aún más a 1:12.000 para una solución de trabajo
Corning® Matrigel® Factor de crecimiento reducido, sin fenol	Rojo Corning	356231	matriz de membrana basal (BMM)
Ratones scid-beige, hembra	Taconic	CBSCBG-F
RNeasy Plus Mini Kit (50)	Qiagen	74134	kit de aislamiento de ARN
Matraces T-25, tratados con cultivo de tejidos	Thermo-Fisher	156367
Matraces T-75, tratados con cultivo de tejidos	Thermo-Fisher
Nunc™ placa de cultivo de tejidos	Thermo-Fisher	12-567-650	Plato de cultivo de tejidos de 10 cm
Placas de 6 pocillos, tratadas con cultivo de tejidos	Cámara de recuento Thermo-Fisher	140675
Neubauer (hemacitómetro)	VWR	15170-173
Mr. Frosty™ contenedor de congelación	Thermo-Fisher	5100-0001	Contenedor de congelación
Tubos FACS, Tubo de ensayo de poliestireno de fondo redondo, 5 ml	Corning	352058	5 ml tubos de poliestireno
Tubos Eppendorf, 1,5 ml	Thermo-Fisher	05-402-96	Tubos de microcentrífuga de 1,5 ml Tubos
PCR, 200 y micro; l	Thermo-Fisher	14-222-262
puntas de pipeta, 100 a 1250 y micro; l	Thermo-Fisher	02-707-407	puntas de 1 mL de diámetro estrecho
puntas de pipeta, 5 a 300 y micro; l	Thermo-Fisher	02-707-410
puntas de pipeta, 0,1 a 10 y micro; l	Thermo-Fisher	02-707-437
puntas de pipeta de diámetro ancho, 1000 y micro; l	VWR	89049-166	de puntas de 1 mL
diámetro ancho pipetas Pasteur	Thermo-Fisher	13-678-20A
etanol, 200 pruebas	Thermo-Fisher	04-355-451
mezclador de vórtice	VWR	10153-842
cubreobjetos con cámara, 8 pocillos, vidrio de borosilicato de 1,5 mm	Thermo-Fisher	155409	fondo de vidrio de grado confocal
Agujas 22G Jeringas	VWR	82002-366
	Thermo-Fisher	22-253-260
Solución de formol, tamponada neutra, 10%	Sigma-Aldrich	HT501128-4L	fijación de teratomas explantados
Illumina HT-12 v4 Expression BeachChip	Illumina	BD-103-0204	microarray de expresión, compatible con PluriTest, descatalogado por el fabricante
Placa de matriz PrimeView Human Genome U219	Microarray de expresión 901605 Thermo-Fisher		(anteriormente marca Affymetrix), que pronto será compatible con PluriTest
GeneChip™ Genoma humano U133 Plus 2.0 Array	Thermo-Fisher	microarray	expresión 902482 (anteriormente marca Affymetrix), respaldado por CellNet, pronto será compatible con PluriTest
PluriTest®	Coriell Institute		www.pluritest.org, servicio gratuito para la evaluación bioinformática de la pluripotencia, acepta datos de microarrays - Archivos *.idat de la plataforma HT-12 v4, pronto serán compatibles con los microarrays U133, U219 y datos de secuenciación de ARN
CellNet	Johns Hopkins University		cellnet.hms.harvard.edu, servicio gratuito para la identificación bioinformática del tipo de célula, incluidas las células madre plutipotentes, basado en datos de microarrays U133 - Archivos *.cel, pronto para soportar ARN Datos de secuenciación