Artículo de método

Un método basado en la filtración para preparar núcleos de alta calidad a partir de músculo esquelético reticulado para inmunoprecipitación de cromatina

DOI:

10.3791/56013

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6 de julio de 2017

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Texas Health Science Center at Houston

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Presentamos un protocolo basado en la filtración para aislar núcleos de alta calidad a partir de músculo esquelético de ratón reticulado en el que eliminamos la necesidad de ultracentrifugación, haciéndolo fácilmente aplicable. Mostramos que la cromatina preparada a partir de los núcleos es adecuada para la inmunoprecipitación de la cromatina y probables estudios de secuenciación con inmunoprecipitación de la cromatina.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP) es un poderoso método para determinar la unión de proteínas al ADN de la cromatina. Sin embargo, el músculo esquelético rico en fibra ha sido un desafío para ChIP debido a la dificultad técnica en el aislamiento de núcleos de alta calidad con mínima contaminación de miofibrillas. Los protocolos anteriores han intentado purificar los núcleos antes de la reticulación, lo que entraña el riesgo de alteración de la interacción ADN-proteína durante el proceso de preparación prolongada de los núcleos. En el protocolo actual, primero se reticuló el tejido muscular esquelético recogido de ratones, y los tejidos fueron picados y sonicated. Dado que se encontró que la ultracentrifugación no era capaz de separar los núcleos de las miofibrillas utilizando tejido muscular reticulado, se ideó un procedimiento de filtración secuencial para obtener núcleos de alta calidad carentes de contaminación significativa de miofibrillas. Posteriormente se preparó la cromatina mediante el uso de un ultrasonista, y los ensayos de ChIP con anticuerpo anti-BMAL1 reveló fuerte vinculación circadianaPatrón de BMAL1 a los promotores de genes de destino. Este protocolo de filtración constituye un método fácilmente aplicable para aislar núcleos de alta calidad a partir de tejidos de músculo esquelético entrecruzados, permitiendo un procesamiento consistente de muestras para estudios circadianos y otros estudios sensibles al tiempo. En combinación con la secuenciación de próxima generación (NGS), nuestro método puede desplegarse para varios estudios mecánicos y genómicos centrados en la función del músculo esquelético.

Introducción

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El músculo esquelético juega un papel importante en la fisiología y el comportamiento. La fibra muscular multi-nucleada consiste en miofibrillas donde la actina y la miosina forman unidades funcionales llamadas sarcómeros para generar fuerza contráctil. El músculo esquelético es también el órgano metabólico más grande del cuerpo, que representa> 80% de la ingesta postprandial de glucosa y la regulación de la respuesta insulínica y la homeostasis metabólica 1 , 2 . La fisiología y el metabolismo muscular están estrechamente regulados por el reloj circadiano, un temporizador biológico intrínseco 3 , 4 , 5 , 6 . Por ejemplo, la deleción específica del músculo esquelético de Bmal1 , uno de los componentes del reloj circadiano núcleo, resultó en la resistencia a la insulina y disminución de la captación de glucosa en el músculo esquelético, y los animales se descubrió desarrollar diabetes tipo 2 [ 7] . yoAdemás, el músculo esquelético también se aprecia cada vez más como un órgano endocrino 8 , secretando mioquinas para regular el metabolismo sistémico y la fisiología. Se requieren estudios mecánicos para entender completamente estas funciones reguladoras en el músculo esquelético.

ChIP es un poderoso enfoque para delinear el reclutamiento del promotor de las proteínas de unión al ADN. ChIP se desarrolló inicialmente para identificar la organización de los nucleosomas en cromatina ADN [ 9 , 10] . Desde entonces, se ha informado de una variedad de métodos para reticular proteínas y ADN de cromatina usando formaldehído, sulfato de dimetilo o irradiación ultravioleta (UV) 11 , 12 . El entrecruzamiento del formaldehído es el más comúnmente utilizado, conservando la estructura de la cromatina y las interacciones ADN-proteína 9 , 13 , 14 . Cromatografía reticuladaEn es desmenuzado por sonicación e inmunoprecipitado con anticuerpo contra la proteína de unión al ADN particular de interés 15 , 16 . En los últimos años se ha desarrollado la secuenciación de ChIP (ChIP-seq), un método que combina ChIP con NGS, para interrogar la unión del factor de transcripción del genoma 17 y, en algunos casos, para monitorear los cambios dinámicos a lo largo del tiempo 18 , 19 , 20 . Por ejemplo, los estudios circadianos de ChIP-seq han revelado una secuencia altamente orquestada de unión genómica de componentes de reloj circadiano y marcadores de histonas, que impulsa la expresión de genes temporalmente precisa durante todo el ciclo circadiano de ~ 24 h [ 18] .

La mayoría de los protocolos disponibles de ChIP están diseñados para tejidos blandos ( por ejemplo , hígado, cerebro, etc. ), y muy pocos han sido publicados para tejidos duros incluyendo el esqueletoTal músculo. Es técnicamente difícil homogeneizar músculo esquelético rico en fibra y aislar núcleos de alta calidad [ 21] , especialmente para los experimentos de ChIP que requieren reticulación. En un reciente estudio de ChIP muscular 22 , las células satélite se separaron de las miofibras, y los núcleos se prepararon a partir de ambos tipos de células a través de un procedimiento prolongado que implica la digestión de los tejidos. El proceso completo tardó aproximadamente tres horas en completarse antes de que se realizara reticulación de formaldehído en núcleos aislados. Si bien este procedimiento evitó el entrecruzamiento de la fibra muscular, lo que hace que el tejido muscular sea aún más refractario a la homogeneización eficiente, y fue capaz de producir núcleos de alta calidad, el importante tiempo transcurrido desde la recolección de tejidos hasta la reticulación de núcleos incurre en el riesgo de alteración del ADN -proteína. Por el contrario, la mayoría de los estudios realizaron reticulación inmediatamente después del tratamiento experimental o recolección de tejidos con el fin de preservar el ADN en tiempo realN de unión 12 . Un segundo inconveniente del aislamiento de núcleos antes de la reticulación es que impide aplicaciones sensibles al tiempo tales como la recolección circadiana de muestras que típicamente ocurre a intervalos de 3 - 4 h. Sin la reticulación de los núcleos, el aislamiento debe proceder inmediatamente después de la disección, mientras que las muestras reticuladas pueden ser procesados ​​juntos después de todo el curso del tiempo se ha completado, lo que garantiza una mayor consistencia experimental.

También se han descrito otros protocolos para el aislamiento de núcleos a partir de músculo esquelético no reticulado. Dos estudios describieron el uso de la ultracentrifugación gradiente para separar los núcleos de las restantes miofibrillas y restos celulares 23 , 24 . Mientras que la sacarosa o la ultracentrifugación con gradiente coloidal es eficaz con tejidos musculares no reticulados, nuestros experimentos revelaron que después de la reticulación, la ultracentrifugación en gradiente falló al separar los núcleos de la célula dEbris en el gradiente.

Por lo tanto, desarrolló un procedimiento para aislar núcleos de alta calidad utilizando tejidos de músculo esquelético de ratón reticulado. En lugar de la ultracentrifugación gradiente, hemos ideado un método de filtración en serie para separar eficazmente los núcleos de los desechos. Después de la ultrasonicación, las muestras de cromatina se aplicaron con éxito para los estudios ChIP que mostró un patrón circadiano de la proteína BMAL1 vinculante a los promotores objetivo. Nuestro método puede ser ampliamente aplicable a varios estudios mecanicistas de los tejidos musculares.

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Protocolo

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El cuidado de los animales se llevó a cabo bajo las directrices del Comité de Uso y Cuidado de Animales Institucionales (IACUC), y los procedimientos se llevaron a cabo de acuerdo con un protocolo animal aprobado por el Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad de Texas en Houston.

1. Aislamiento de Nucleos a partir del Músculo Esquelético Reticulado

  1. Pesar y picar el músculo esquelético de la extremidad posterior, aislado de ratones machos C57BL / 6 de aproximadamente 20 semanas de edad, en solución salina tamponada con fosfato (PBS) helada como se describe con detalle anteriormente 22 .
    NOTA: Usualmente obtenemos 1,0 - 1,5 g de músculo esquelético de un ratón.
    1. Coloque el tejido muscular esquelético picado en un tubo cónico de 50 ml que contenga 10 ml de PBS sobre hielo.
  2. Centrifugar a 300 xg a 4 ° C durante 5 min.
  3. Quitar cuidadosamente el sobrenadante de PBS por aspiración.
  4. Estimar el volumen de pellets en cada tubo de 50 ml usando tubos de referencia con 1, 2, 3 y 4 ml de agua.
  5. Añadir 7 volúmenes deDe formaldehído al 1% enfriado con hielo en PBS y homogeneizar las muestras sobre hielo usando un homogeneizador de tejido sonda (véase la Tabla de Materiales ).
    NOTA: Opcional: El procedimiento de homogeneización se puede realizar en una habitación fría.
  6. Reticular la muestra incubando a temperatura ambiente durante 10 min.
  7. Enfriar la reacción de reticulación mediante la adición de glicina 1 M a una concentración final de 0,125 M e incubar durante 5 min a temperatura ambiente.
  8. Centrifugar las muestras a 3.000 xg durante 5 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante por aspiración.
  9. Enjuagar con 10 ml de tampón de base enfriado con hielo (HEPES-KOH 10 mM a pH 7,3, EDTA 10 mM, KCl 10 mM, MgCl2 5 mM, DTT 0,5 mM) que contiene inhibidores de proteasa recién añadidos (fluoruro de fenilmetilsulfonilo 0,2 mM (PMSF) , Y 10 μg / ml de leupeptina). Centrifugar a 3.000 g durante 5 min a 4 ° C y retirar cuidadosamente el sobrenadante por aspiración.
  10. Resuspender el sedimento en 6 ml de tampón de lisis (HEPES-KOH 10 mM a pH 7,3, EDTA 10 mM, KCl 10 mM, MgCl _ {2} 5 mM, DTT 0,5 mM, Triton X - 100 al 1%) que contenían inhibidores de proteasas recién añadidos (PMSF 0,2 mM y leupeptina 10 mu g / ml).
  11. Transferir la muestra a un homogeneizador de 15 mL Dounce prechilado e incubar durante 10 min en hielo. Dividir homogeneizar cada muestra en hielo con 15 carreras lentas usando pilón suelto seguido de 15 carreras con pilón apretado para liberar los núcleos.
  12. Se filtra el homogeneizado (6 ml) a través de un filtro de células (tamaño de poro: 100 μm) y se enjuaga con 4 ml de tampón de lisis. Centrifugar las muestras a 1.000 xg durante 10 min a 4 ° C. Resuspender en 5 ml de tampón de base helado y dounce 10 veces con el mazo apretado para liberar los núcleos.
    1. Eliminar una alícuota de 20 μL para la medición de la concentración de ADN con un espectrofotómetro (OD260 / OD280) y observar microscópicamente con azul de tripano si es necesario (ver más adelante) ( Figura 1 A ).
  13. Filtrar la suspensión a través deUn filtro de células (tamaño de poro: 70 μm), enjuague el tubo y vuelva a filtrar con 2 ml de tampón de base como se indica más arriba.
  14. Repetir la filtración como en el paso 1.13 con filtros de células de tamaño de poro gradualmente reducido (40 μm, 30 μm, 20 μm y 10 μm).
    NOTA: En total, se utilizaron filtros de 6 tamaños de poro en los pasos 1.12-1.14.
  15. Centrifugar a 1.000 g a 4 ° C durante 10 min. Eliminar el sobrenadante y resuspender el sedimento en 500 μ l de tampón base.
  16. Mida la concentración de ADN como se ha indicado anteriormente.
    NOTA: Se obtuvieron aproximadamente 200 μg de ADN nucleico combinando ambas extremidades traseras de un animal. Opcionalmente, ahorre 20 μl para la observación microscópica con tinción con azul de tripano (concentración de stock 0,4%, dilución 1: 5); Los núcleos se tiñen de azul ( Figura 1 B ).
  17. Centrifugar a 1.000 g a 4 ° C durante 10 min, y desechar el sobrenadante. Almacenar el gránulo a -80 ° C.

2. Sonicación

    Descongelar las muestras en 500 μl de tampón de lisis SDS y resuspender con pipeteado suave.
  1. Transferir la suspensión de ADN del núcleo a un vial de vidrio sobre hielo.
  2. Ejecute la sonicación con ráfagas enfocadas de energía acústica ultrasónica de un transductor en forma de plato. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre el equipo. Utilice el siguiente ajuste: ciclos por ráfaga: 200; Intensidad: 5; Ciclo de trabajo: 20; Temperatura 4 - 6 ° C; 30 s encendido / apagado.
    NOTA: Un ejemplo para evaluar la eficacia de la sonicación se muestra en la Figura 2 .
  3. Transferir la cromatina sonicada a un tubo de 1,5 ml. Centrifugar a 12.000 xg durante 15 min y transferir el sobrenadante a un nuevo tubo. Transferir 50 μl de muestras sonicadas (~ 7 - 10 μg / muestra de músculo) en un nuevo tubo de 1,5 ml para reticulación inversa durante la noche a 65 ° C. Congele las muestras restantes a -80 ° C.

3. Evaluación de Sonicación y Cuantificación

  1. Añadir 1.0Μ l de RNasa A (500 U / ml RNasa A: 20.000 U / mL RNasa T1) a las muestras de 50 μl de sonicación almacenadas y se incuba durante 30 minutos a 37ºC.
  2. Añadir 8 μl de proteasa K (10 mg / ml) e incubar durante 30 minutos a 55 ° C.
  3. Cosecha del ADN mediante el uso de un kit de extracción de ADN.
    1. Añadir 5 volúmenes de tampón de unión, aplicarlo a la columna de centrifugado y centrifugar a 4.000 xg, 10 min.
    2. Aplicar el paso a través de la misma columna y centrifugar nuevamente.
    3. Lavar con tampón de lavado dos veces a 13.000 xg, 1 min.
    4. Centrifugar de nuevo a 13.000 xg, 1 min para secar la columna.
    5. Añadir 50 μL de H2O y centrifugar a 13.000 xg, 1 min para eluir ADN.
    6. Aplicar el paso a través de la misma columna y centrifugar nuevamente.
  4. Cuantificar la cantidad de ADN con un espectrofotómetro (OD260 / OD280). Ejecutar muestras sobre geles al 0,8% para evaluar el tamaño y la cantidad (1 μ g) de los productos sonicated ( Figura 2 ].
    NOTA: El rendimiento promedio de la cromatina es aproximadamente ~ 20%.

4. ChIP

  1. Deshielo la cromatina guardada previamente a -80 ° C y alícuota de la cromatina a ~ 100 - 120 μ g por tubo. Diluir 1:10 con tampón de ensayo de radioimmunoprecipitación (RIPA) (Tris-HCl 20 mM (pH 7,4), NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, NaF 1 mM, Na3VO4 1 mM, PMSF 1 mM, cóctel inhibidor de la proteasa 1x (PIC), desoxicolato de Na al 0,1% P / v), Triton X - 100 al 1%).
    1. Si hay múltiples muestras en cada grupo, combine cantidades iguales de ADN de cromatina hasta la cantidad final de ~ 100 - 120 μg / muestra. Ahorre un 10% como entrada.
  2. Se añaden 40 μl (50% v / v de lechada en tampón RIPA) de agarosa BSA-pre-bloqueada (~ 2 h, 4 ° C) de agarosa de proteína A / G (anticuerpo no de pollo) o perlas de IgY Un rotador durante 3 ha 4 ° C.
  3. Centrifugar a 1.000 xg, 10 min y transferir cuidadosamente el sobrenadante a nuevos tubos.
  4. Añadir anticuerpos a 1 μ g de anticuerpos por ~25 - 100 mu g de ADN de cromatina.
  5. Girar suavemente a 4 ° C durante la noche a aproximadamente 15 rpm.
  6. Añada 10 μl de agarosa BSA-pre-bloqueada (~ 2 h, 4 ° C) de agarosa de proteína A / G (anticuerpo no de pollo) o de perlas de IgY (anticuerpo de pollo) y gírela en la habitación fría durante 2 h.
  7. Lavar las perlas de la siguiente manera. Lavar con 1 ml de tampón RIPA durante 3 min dos veces, lavar con 1 ml de tampón salino alto (Tris-HCl 20 mM (pH 7,4), NaCl 500 mM, EDTA 2 mM, PMSF 1 mM, Triton X-100 al 1%) durante 3 min dos veces , Lavar con 1 ml de tampón LiCl (Tris-HCl 20 mM (pH 7,4), LiCl 250 mM, EDTA 2 mM, PMSF 1 mM, Na-desoxicolato al 1%, NP40 al 0,5%) durante 3 min dos veces.
    1. Lavar con 1 ml de tampón Tris-EDTA (TE) (Tris-HCl 10 mM (pH 7,4), EDTA 1 mM) durante 3 min una vez. Luego eluir ADN con tampón de elución (Tris-HCl 20 mM, EDTA 5 mM y SDS al 0,5%).
  8. Centrifugar a 1.000 g, 1 min y retirar cuidadosamente el sobrenadante.
  9. Resuspender el cordón con 50 μl de tampón de elución.
  10. Incubar durante 10Min a 65 ° C.
  11. Centrifugar a 12.000 g durante 5 min.
  12. Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo, añadir otros 50 μL y centrifugar nuevamente a 12.000 g durante 5 min. El volumen de elución final será de 100 μl.
  13. Reticulación inversa y elución de ADN.
    1. Incubar la cromatina eluida durante la noche a 65 ° C.
    2. Añadir 1,0 μl de RNasa A e incubar durante 30 min a 37 ° C.
    3. Añadir 8 μl de proteasa K (10 mg / ml) e incubar durante 30 minutos a 55 ° C.
    4. Coseche el ADN utilizando un kit de limpieza de PCR con volumen de elución a 50 μl de acuerdo con el protocolo del fabricante.
  14. Analizar los perfiles por tiempo real qPCR como se describe anteriormente [ 25 , 26] .
    NOTA: Las secuencias de cebadores se listan en la Figura 3 Leyenda . Los datos se presentan como media ± SEM ( Figura 3 ).

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Resultados

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Aquí se realizó formaldehído reticulación inmediatamente después de la recolección de tejidos para preservar en tiempo real la interacción ADN-proteína. Sin embargo, se encontró que la sacarosa o gradiente coloidal, comúnmente utilizado para el aislamiento de núcleos 23 , 24 , no fue eficaz en la separación de núcleos de miofibrillas (datos no presentados). La razón puede ser que el entrecruzamiento confería gravedad similar para...

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Discusión

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Aquí describimos un método robusto en el que se utilizaron tejidos de músculo esquelético entrecruzados para aislar núcleos de alta calidad. La filtración secuencial se llevó a cabo para separar eficazmente los núcleos de los residuos, y la energía acústica ultrasónica del transductor en forma de plato cizalló la cromatina para el análisis de ChIP. Los resultados mostraron que el tiempo circadiano específico de unión de BMAL1 a los promotores objetivo.

ChIP se puede emplear para capturar la ...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Agradecemos a Karyn Esser, Nobuya Koike y Noheon Park por sus consejos útiles. Este trabajo fue apoyado en parte por NIH / NIGMS (R01GM114424) a S.-HY, y la Fundación Robert A. Welch (AU-1731) y NIH / NIA (R01AG045828) a ZC

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Materiales
Solución de formaldehídoSigma AldrichF8775 
GlicinaFisher ScientificBP381-5
Solución de azul de tripano (0,4%)Fisher Scientific
RNasa ASigma Aldrich10109142001
Proteasa KSigma Aldrich3115887001
Chicken Anticuerpoanti-BMAL1Se generó en pollo (Cocalico Biologicals) contra el antígeno aa 318 - 579, y la IgY se purificó por afinidad utilizando el mismo antígeno.
Resina precipitanteIgY GenScriptL00405
Equipment
KINEMATICA  Polytron PT2100 Homogeneizador de sobremesaFisher Scientific08-451-178
15 mL Molinillo de tejidos DounceWhearton357544
Falcon Cell Strainers 100 µ mFisher Scientific08-771-19
Coladores de células de halcón 70 y micro; mFisher Scientific08-771-1
Coladores de células de halcón 40 y micro; mFisher Scientific08-771-2
pluriStrainer 30 µ mPluriSelect43-50030-03
pluriStrainer 20 µ mPluriSelect43-50020-03
pluriStrainer 10 µ mPluriSelect43-50010-03
Covaris S2 Ultrasonido focalizadoCovarisModelo S2
Labquake Cámara
CCD  Leica MicrosystemsDFC3000 G
Reagent Kit
ScientificK0691
Buffers
se describen en el protocolo. Cada componente fue comprado a Sigma Aldrich
15250061 de pollo de microscopio Thermo Scientific C415110 DNA extraction kit Thermo Todos los componentes del tampón

Referencias

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