Electroconvulsiva convulsiones (ECS) es un modelo animal experimental de la terapia electroconvulsive para la depresión severa. ECS a nivel mundial estimula la actividad en el hipocampo, a sinaptogénesis y plasticidad sináptica. Aquí, describimos los métodos para la inducción de ECS en ratas y para el fraccionamiento subcelular de sus hipocampos para examinar los cambios inducidos por la incautación en proteínas sinápticas.
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Artículo de método
Electroconvulsiva convulsiones en ratas y fraccionamiento de sus hipocampos para examinar los cambios inducidos por la incautación en densidad Postsynaptic proteínas
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Resumen
Resumen
Electroconvulsiva convulsiones (ECS) es un modelo animal experimental de la terapia electroconvulsiva, el tratamiento más efectivo para la depresión severa. ECS induce convulsiones tonico-clónicas generalizadas con baja mortalidad y muerte neuronal y es un modelo ampliamente utilizado para drogas antiepilépticas de pantalla. Aquí, describimos un método de inducción de ECS en que se entrega una breve corriente de 55 mA para 0.5 s para hombre ratas 200-250 g de peso por medio de electrodos clip de oreja. Tal estimulación bilateral producida etapa 4-5 convulsiones clónicas que duró cerca de 10 s. Tras el cese de ECS aguda o crónica, las ratas más recuperadas para ser indistinguible su comportamiento simulado ratas "no crisis". Porque ECS a nivel mundial eleva la actividad cerebral, también se ha utilizado para examinar alteraciones dependientes de la actividad de proteínas sinápticas y sus efectos en la fuerza sináptica mediante varios métodos. En particular, fraccionamiento subcelular de la densidad postsináptica (PSD) en combinación con Western Blot permite la determinación cuantitativa de la abundancia de proteínas sinápticas a esta estructura sináptica especializada. En contraste con un método de fraccionamiento anterior que requiere gran cantidad de cerebros de roedores, se describe aquí un método de fraccionamiento en pequeña escala para aislar el PSD desde el hipocampo de una rata sola, sin centrifugación gradiente de sacarosa. Usando este método, nos muestran que la fracción aislada del PSD contiene proteínas de la membrana postsináptica, incluyendo PSD95, GluN2B y GluA2. Sinaptofisina marcador presinápticos y citoplasmática soluble de la proteína α-tubulina fueron excluidos de la fracción PSD, demostrando el aislamiento exitoso de PSD. Además, ECS crónica disminuyó la expresión de GluN2B en PSD, lo que indica que nuestro método de fraccionamiento de PSD en pequeña escala puede aplicarse para detectar los cambios en las proteínas PSD hipocampales de una rata sola después de tratamientos genéticos, farmacológicos o mecánicos .
Introducción
La terapia electroconvulsiva se ha utilizado para tratar a pacientes con trastornos depresivos mayores, incluyendo depresión severa resistente a los medicamentos, depresión bipolar, enfermedades de Parkinson y esquizofrenia1,2. En esta terapia, crisis es generada por estímulos eléctricos a la cabeza de los pacientes anestesiados vía epicranial electrodos1,2,3. Administración repetitiva de ECS ha sido clínicamente beneficiosa para los trastornos depresivos resistentes a los medicamentos1,
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Protocolo
Todos los procedimientos experimentales incluyendo temas animal han sido aprobados por el cuidado de animales institucional y Comité de uso de la Universidad de Illinois en Urbana-Champaign.
1. mantener una colonia de la rata
- Raza de ratas Sprague-Dawley (véase la Tabla de materiales) y mantenerlas en condiciones estándar con un ciclo de luz-oscuridad de 12 h y acceso ad libitum al alimento y al agua.
- Destetar las crías de rata en el día postnatal (P) 28 y alojarlos en grupos de 2-4 hermanos de camada machos o hembras.
- Marque las colas de ratas macho con un marcador negro permanente no tóxico p....
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Resultados
Utilizando el procedimiento detallado aquí, presenta una descarga eléctrica (55 mA, 100 pulsos/s para 0.5 s) suministra a través de clip de oreja electrodos inducida por etapa no recurrente asimientos tónico-clónicos 4-5 en la rata (figura 1A-B). Un total 8 de ratas recibió inducción aguda de ECS y aparecen convulsiones tónico-clónicas etapas 4-5. Las crisis duraron cerca de 10 s y todas las ratas recuperadas dentro de 1-2 minutos de cese de .......
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Discusión
Aquí, describimos un método de inducción de ECS en ratas que provoca la estimulación global de la actividad neuronal en sus hipocampos. ECS es un modelo animal de terapia electroconvulsiva, que se utiliza clínicamente para tratar trastornos depresivos refractarios de drogas en los seres humanos1,2,3. A pesar de uso de la terapia electroconvulsiva para tratar la depresión severa, el mecanismo exacto subyacente sigue siendo confus.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.
Agradecimientos
Los autores agradecen a Dr. Eric C. Bolton por permitirnos usar su centrífuga para el fraccionamiento y el Dr. Graham H. Diering en laboratorio del Dr. Richard L. Huganir Universidad de John Hopkins por facilitarnos el protocolo en pequeña escala para el fraccionamiento de la PSD.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Rata Spargue-Dawley | Charles River Laboratories Suministros | ECS | |
| Un generador de pulsos | Ugo Bsile, Comerio, Italia | 57800 | Suministros ECS |
| Sistema de purificación de agua MilliQ | EMD Millipore | Z00Q0VWW | Suministros de fraccionamiento subcelular |
| Sacarosa | Em science | SX 1075-3 | Suministros |
| de fraccionamiento subcelularNa4O7P2 | SIGMA-ALDRICH | 221368 | Suministros de fraccionamiento subcelular |
| Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) | SIGMA-ALDRICH | E9884 | Suministros de fraccionamiento subcelular |
| HEPES | SIGMA-ALDRICH | H0527 | Suministros de fraccionamiento subcelular |
| Ácido okadaico | TOCRIS | 1136 | Suministros de fraccionamiento subcelular |
| Inhibidor de la proteasa Halt | Thermo Scientific | 78429 | Suministros de fraccionamiento subcelular |
| NaVO3 | SIGMA-ALDRICH | 72060 | Suministros de fraccionamiento subcelular |
| EMD Millipore Sterito Filtros estériles de | Scientific | SCGPS05RE | Suministros de fraccionamiento subcelular |
| Tijeras de iris | WPI (World Precision Instrumentos) | 500216-G | Suministros de fraccionamiento subcelular |
| Placa de cultivo de tejidos de 30 mm | Fisher Scientific | 08-772B | Suministros de fraccionamiento subcelular |
| Homogeneizador de vidrio y un mortero de teflón | VWR | 89026-384 Suministros de | fraccionamiento subcelular |
| Tubo de microcentrífuga de 1,7 mL | DENVILLE SCIENTIFIC INC. | C2170 (1001002)Suministros | de fraccionamiento subcelular |
| Centrífuga Sorvall Legend XT/XF | Thermo Fisher | 75004521 | Suministros de fraccionamiento subcelular |
| Reactivo A de ensayo de proteínas Pierce BCA, 500 mL | Thermo Fisher | #23228 | Suministros de Western blot |
| Reactivo de ensayo de proteínas BCA de Pierce B, 25 mL | Thermo Fisher | #1859078 | Western blot suministra |
| gel de poliacrilamida SDS (SDS-PAGE) | BIO-RAD | #4561086S | Suministros de Western blot |
| En funcionamiento Tampón | Hecho en el laboratorio | Suministros de Western blot. | |
| Célula de electroforesis vertical Tetra Tetra Mini-PROTEAN para geles miniprefabricados, 4 geles | BIO-RAD | #1658004 | Western blot suministra |
| membrana de difluoruro de polivinilo (PVDF) | Milipore | IPVH00010 | Western blot suministra |
| tampón de transferencia | Hecho en el laboratorio | Western blot suministra blot. | |
| Tris-base | Fisher Scientific | BP152-1 | Western blot suministra |
| glicina | Fisher Scientific | BP381-5 | blot |
| suministra Dodecil sulfato de sodio | SIGMA-ALDRICH | 436143 | Western blot suministra |
| Metanol | Fisher Scientific | A454-4 | Western blot suministra |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | detergente para el aislamiento |
| PSD Mini Trans-Blot Module | BIO-RAD | #1703935 | Suministros de Western blot |
| Leche en polvo instantánea descremada | Suministros de Western blot | de gran valor | |
| Rotador multiusos | Thermo Scientific | Model-2314 | Western blot suministra |
| la película de autorradiografía Hyblot CL | DENVILLE SCIENTIFIC INC. | E3018 (1001365)Suministros | Western blot |
| Sustrato de quimiofluorescencia mejorado | transferencia occidental | Thermo Scientific | 32106 |
| un procesador de película Konica SRX-101A | KONICA MINOLTA | SRX-101A | La transferencia occidental suministra |
| Nombre del anticuerpo | |||
| PSD-95 | Señalización | #2507 | Dilución de anticuerpos = 1:500 - 1,000, tiempo = 9 - 12 h, temperatura de reacción = 4 & grados; C, Especie huésped = Señal |
| celular | sinaptofisina | #4329 | Dilución de anticuerpos = 1:500 - 1,000, tiempo = 9 - 12 h, Temperatura de reacción = 4 ° C, Especie Huésped = Conejo |
| alfa-Tubulina | Santacruz | SC-5286 | Dilución de anticuerpos = 1:500 - 1,000, tiempo = 9 - 12 h, Temperatura de reacción = 4 ° C, Especie huésped = |
| Ratón GluN2B | Neuromab | 75-097 | Dilución de anticuerpos = 1:500 - 1.000, tiempo = 9 - 12 h, Temperatura de reacción = 4 & deg; C, Especie huésped = |
| Ratón GluA2 | Sigma-aldrich | Sab 4501295 | Dilución de anticuerpos = 1:500 - 1.000, tiempo = 9 - 12 h, temperatura de reacción = 4 & grados; C, Especie Huésped = Conejo |
| STEP | Santacruz | SC-23892 | Dilución de anticuerpos = 1:200 - 500, tiempo = 9 - 12 h, Temperatura de reacción = 4 ° C, Especie huésped = |
| Peroxidas de ratón AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H + L) | Laboratorio Jackson ImmunoReserch | 715-035-150 | Dilución de anticuerpos = 1:2,000-5,000, tiempo = 1 h, Temperatura de reacción = RT, Especie huésped = Burro |
| Peroxidas AffiniBurro puro Anti-Conejo IgG (H + L) | Laboratorio Jackson ImmunoReserch | 711-035-152 | Dilución de anticuerpos = 1:2,000-5,000, tiempo = 1 h, Temperatura de reacción = RT, Especie huésped = Burro |
Referencias
- Dierckx, B., Heijnen, W. T., van den Broek, W. W., Birkenhager, T. K. Efficacy of electroconvulsive therapy in bipolar versus unipolar major depression: a meta-analysis. Bipolar Disord. 14 (2), 146-150 (2012).
- McClintock, S. M., et al.
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Reimpresiones y permisos
