Se trata de una dieta alta en grasas alimentación protocolo para inducir obesidad en Drosophila, un modelo de mecanismos moleculares fundamentales comprensión implicados en la lipotoxicidad. También proporciona un análisis de alto rendimiento triacylglyceride para medir la acumulación de grasa en Drosophila y potencialmente otros modelos (insectos) en diversas condiciones de dieta, ambientales, genéticas o fisiológicas.
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Artículo de método
Alimentación dieta alta en grasas y alto rendimiento Triacylglyceride ensayo en Drosophila Melanogaster
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Resumen
Resumen
Enfermedad cardíaca es la causa número una de muerte humana en todo el mundo. Numerosos estudios han demostrado fuertes conexiones entre la obesidad y fallo cardíaco en los seres humanos, pero se necesitan más herramientas y esfuerzos de investigación para dilucidar mejor los mecanismos implicados. Para más de un siglo, el modelo genético altamente manejable de Drosophila ha sido fundamental en el descubrimiento de genes clave y vías moleculares que demostró ser altamente conservadas entre especies. Muchos procesos biológicos y mecanismos de la enfermedad se conservan funcionalmente en la marcha, como el desarrollo (p. ej., plan de cuerpo, corazón), cáncer y enfermedades neurodegenerativas. Recientemente, el estudio de la obesidad y patologías secundarias, tales como enfermedades del corazón en organismos modelo, ha desempeñado un papel muy importante en la identificación de los principales reguladores implicados en el síndrome metabólico en los seres humanos.
Aquí, nos proponemos utilizar este organismo modelo como una herramienta eficaz para inducir la obesidad, es decir, la acumulación excesiva de grasa y desarrollar un protocolo eficiente para monitorear el contenido de grasa en forma de acumulación de TAGs. Además de altamente conservado, pero menos complejo genoma, la mosca también tiene una vida útil corta para la experimentación rápida, combinada con la rentabilidad. Este documento proporciona un protocolo detallado para la alimentación de la dieta de grasa alto (HFD) en Drosophila para inducir a la obesidad y un análisis de alto rendimiento triacylglyceride (etiqueta) para medir el aumento asociado en contenido de grasa, con el objetivo de ser altamente reproducibles y eficiente para la detección genética o química a gran escala. Estos protocolos ofrecen nuevas oportunidades para eficiente investigar mecanismos regulatorios involucrados en la obesidad, así como proporcionar una plataforma estandarizada para la investigación de descubrimiento de drogas para la prueba rápida del efecto de fármacos candidatos en el desarrollo o prevención de la obesidad, diabetes y enfermedades metabólicas relacionadas.
Introducción
Estamos en un momento donde la obesidad y sus cargas económicas asociadas, es un problema mundial1. Dos de cada tres estadounidenses tienen sobrepeso u obesidad con cardiopatías relacionadas, la principal causa de muerte en la población adulta de2. Se necesitan nuevos métodos eficientes para investigar adecuadamente los componentes genéticos y moleculares implicados en la regulación del síndrome metabólico utilizando organismos modelo. Por esta razón, elegimos el modelo de Drosophila mosca de la fruta porque comparte los procesos biológicos más básicos con los mamíferos, como ratones y seres humanos3,4,5,6. Genoma de drosophilaes altamente conservados durante la evolución, pero en general mucho más pequeña con menos duplicación del gene y complejidad metabólica, lo que es ideal para la comprensión de los mecanismos fundamentales implicados en muchas enfermedades humanas4 , 7 , 8. Asimismo, procesos característicos realizados por el tejido adiposo, intestino y páncreas están representados en la marcha y mediar funciones reguladoras en el metabolismo de glucosa y de lípido, por ejemplo, que son similares a los seres humanos9, 10,11. Por otra parte, las vías moleculares básicas implicados en el control de la obesidad, resistencia a la insulina y la diabetes en los seres humanos son funcionalmente conservadas en Drosophila melanogaster12,13,14 , 15 , 16. como organismos superiores, Drosophila tiene un corazón que se forma durante el desarrollo de procesos similares a la de los mamíferos corazón3,17. Así, el desarrollo de un confiable HFD alimentación protocolo y ensayo de etiqueta de alto rendimiento, adaptado para los propósitos de la investigación eficiente utilizando la caja de herramientas genética de Drosophila, proporcionan un medio importante para estudiar y comprender la base genética fundamental subyacente a enfermedades metabólicas complejas.
La comida HFD sí mismo se hace de un alimento mosca de laboratorio estándar suplementado con aceite de coco, que se compone principalmente de ácidos grasos saturados sabidos para ser asociado con síndrome metabólico18. Mientras que inducir obesidad en modelos de mamíferos, como roedores, puede tomar meses19,20, nuestro HFD optimizado protocolo de alimentación en Drosophila efectiva y reproducible aumenta la grasa en cuestión de días12,14. Este protocolo, junto con un análisis de alto rendimiento etiqueta, permite la investigación total eficaz para los efectos de factores genéticos, influencias ambientales y los candidatos de la droga para descubrir nuevos moduladores del metabolismo de las grasas. En consecuencia, estos protocolos son probablemente relevantes para entender y combatir la obesidad y patologías humanas asociadas a la obesidad.
El protocolo de alimentación es versátil y se puede aplicar para estudiar los efectos metabólicos y funcionales de solo ácidos de grasos saturados o insaturados. El uso de este análisis de etiquetas de alto rendimiento no se limita a la D. melanogaster, pero puede ser adaptado a una variedad de organismos modelo pequeño con cutícula o matrices extracelulares difíciles (p. ej., otras especies de Drosophila , C. elegans y otros organismos invertebrados modelo) para medir el contenido de grasa en diferentes condiciones ambientales, genéticas o fisiológicas, en cualquier etapa del desarrollo, la adultez o fase de enfermedad metabólica. El ensayo de la etiqueta se basa en una medición colorimétrica de una serie de reacciones enzimáticas que degradan las etiquetas en ácidos grasos libres, glicerol glicerol 3-fosfato y finalmente H2O2 reacciona con 4-aminoantipirina (4-AAP) y 3,5- Dicloro-2-hidroxibenceno sulfonato (DHBS 3,5) para producir un producto de color rojo que se mide mediante un espectrofotómetro de 96 pocillos.
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Protocolo
1. HFD protocolo de alimentación
tabla 1. Receta de comida mosca.
Esta tabla resume los diferentes ingredientes utilizados para preparar nuestro control alimentos. Una vez hecho, 10 mL del alimento se vierte en frascos, enfriado y almacenado a 4 ° C para almacenamiento a largo plazo.
- Preparación de HFD
- para hacer 1 kg de alimentos grasa, pesan 700 g de moscas normales hecha de antemano de los alimentos (ver tabla 1) y 300 g de aceite de coco en dos envases separados utilizando una balanza analítica.
- Caliente cada envase individualmente en el microondas, hasta que el contenido se derrita completamente. Vierta el aceite de coco en el contenedor para volar. Revuelva con un batidor hasta que el aceite esté bien mezclado en el alimento de la mosca.
Nota: Hay trozos de comida o aceite deben ser visibles. Cuando la comida mosca se está derritiendo en el microondas, dejar a intervalos de 1 minuto para mezclar los alimentos y evitar que rebosen. - Volver a pesar la comida grasa alta. Si el peso total es menos de 1 kg (700 g de comida + 300 g de aceite de coco), añadir agua (aproximadamente 10 mL) para compensar la evaporación durante el calentamiento y para llevar el peso a 1 kg.
- Pour bien mezclado unos 10 mL alimentos grasa por vial (alrededor del 25% del volumen del frasco). A continuación, cubrir con una gasa para evitar moscas ' contaminación. Enfriar durante 1 hora a temperatura ambiente y transferencia de los frascos a 4 ° C para el almacenamiento de hasta 4 semanas.
Nota: El alimento Normal (NF) se utiliza como un alimento de control. También verter 10 mL (aproximadamente 25% del volumen del frasco) de NF por vial. Para la comida HFD, reemplazar 30% de los alimentos de NF con aceite de coco. Para el control y las condiciones experimentales, las moscas se les dio la misma cantidad de NF y HFD (10 mL de alimentos por frasco).
figura 1 . Alimentación en Drosophila HFD.
El esquema muestra las diferentes etapas de alimentación para las moscas en un alimento de control (dieta normal sin adición de aceite de coco-NF) o HFD (con la adición de aceite de coco). Todo el proceso tarda 10 días después de la colección inicial de moscas adultas. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
- HFD la alimentación de D. melanogaster
Nota: este protocolo incluye control alimentos y HFD alimentación procedimientos que son compatibles con cualquier línea de mosca. Control y experimentales moscas se ponen en frascos que contienen la misma cantidad de alimentos (NF o HFD).- Uso de CO 2 para anestesiar las moscas.
Nota: Para los neófitos, por favor leer referencia 21 para tener una visión general sobre la cría y manejo de D. melanogaster. - Recoger 0-5 moscas días de viales y la transferencia (poniendo) las moscas en los nuevos frascos que contienen NF (previamente calentado a temperatura ambiente). Que la edad de moscas para 5 días adicionales a los 21 ° C.
- Al final de los 5 días, sacar los frascos de HFD y NF de 4 ° C.
Nota: como frío puede tensionar moscas vivos, deje los frascos durante 30 min a temperatura ambiente para calentar antes de usar. - El uso de toallitas, limpiar y eliminar exceso de líquido de los lados de los frascos de.
- Insertar un pequeño trozo de papel de filtro, de 1 cm x 3 cm, en la alta comida grasa para absorber cualquier exceso de líquido.
Nota: Este paso es vital para evitar que las moscas se peguen los alimentos HFD. - a continuación, transferir las moscas en la comida grasa alta (los bancos). Coloque los frascos horizontalmente por su parte, (no permanente) a 21-22 ° C durante 5 días.
Nota: Evite temperaturas más altas como parcialmente esto puede derretir el grasa alimentos, haciendo que las moscas se adhiera al alimento y muere. - Después de 5 días, la transferencia (poniendo) las moscas de NF y HFD en nuevos viales sin alimentos para permitir que sus agallas al vacío durante 30 minutos. A continuación, proceder al pesaje de las moscas.
Nota: Uno de los pasos críticos en este HFD protocolo de alimentación es preparar un HFD bien mezclado, libre de cualquier pedazos de comida de mosca o aceite condensado. Mezcla homogénea y el enfriamiento HFD a 45-30 ° C son recomendable, antes de verter en los frascos y guardar los alimentos en la edad adecuada de 4 ° C. juego de control y experimentales moscas es importante así como previo de las condiciones nutricionales y ambientales controladas a la alimentación de HFD. Durante la fase de alimentación, control y experimentales moscas deben tener la misma cantidad de HFD y NF. Nunca recoger moscas abarrotados frascos o botellas (para evitar efectos transgeneracionales). Siempre poner un máximo de 25 moscas por frasco durante NF y HFD para evitar otros efectos crowding o restricción dietética. El HFD se compone de aceite de coco 30%, así temperaturas superiores a 22 º C podrían derretir parcialmente HFD, causando las moscas pegar en la comida grasosa y mueren. Antes de colocar las moscas el HFD, limpie los frascos para eliminar cualquier aceite residual e insertar un filtro de papel para absorber cualquier exceso de líquido en la comida. Durante la incubación de las moscas en HFD, los frascos se colocan en sus lados para proporcionar una superficie horizontal libre de grasa para las moscas.
- Uso de CO 2 para anestesiar las moscas.
- Peso de las moscas
- para que cada genotipo y sexo para ser probado, utilice una escala ultra sensible para registrar los pesos de los tubos previamente etiquetados, vacío 1,7 mL.
- Mosca anestésico o CO 2, anestesiar y recoge 36 moscas del mismo genotipo, sexo, y la alimentación status con un cepillo en uno pesaba tubo de 1,7 mL.
- Pesar el tubo que contiene moscas con la misma escala ultra sensible.
- Determinar el peso promedio de la mosca siguiendo esta fórmula:
Nota: el número de moscas en el presente Protocolo es de 36. - Flash congela los tubos de 1,7 mL que contiene moscas por sumergirse en nitrógeno líquido durante 2 minutos recoger y colocar los tubos en las cajas. A continuación, transferir las cajas a-80 ° C (preferible) para el almacenamiento hasta su uso con el ensayo de etiqueta.
PRECAUCIÓN: Nitrógeno líquido está a una temperatura extremadamente baja. Utilice equipo de protección personal apropiado.
2. Etiqueta ensayo
- preparación de las concentraciones estándar de etiqueta
- preparar 500 mL de PBT (PBS 1 X, 0.05% Triton).
- Usando tubos de 0.5 mL y la solución de la etiqueta (Tabla de materiales), se preparan 100 μl de espacio en blanco (sólo PBT) y 100 μl de seis concentraciones de etiqueta estándar (2 μg/μl, 1 μg/μl de 0,5 μg/μl; 0,25 μg/μl; 0.125 μg/μl; 0.0625 μg/μl) con el PBT.
- Coloque los tubos en hielo y continuar con el pulido de las moscas.
- Pulido las moscas
- sacar las moscas congeladas de-80 ° C (paso 1.3). Transferir los tubos con las moscas en hielo.
- En primer lugar, Coloque 2 mm metal bolas de molienda en un dispensador de bolas de 96 pocillos, use una brocha pequeña para eliminar bolas extras. Placa de
- lugar el rectificado de 96 pocillos boca abajo encima del dispensador de la bola y flip para transferir las bolas de metal directamente en la placa de pulido. Debe ser una bola por bien.
- Con una pipeta multicanal, añadir 600 μl de PBT en cada fila de la placa de 96 pocillos pulida.
- Con pinzas, añadir 3 vuela por pozo. Indicar la condición de genotipo, sexo y comida de las moscas en cada fila/pocillo de la placa de 96 pocillos pulida.
- Coloque firmemente las tapas sobre la placa de 96 pocillos pulida. Cinta puede ser colocada en la parte superior para asegurar que no hay ninguna salida.
- Coloque correctamente las 96 pocillos de las placas de pulido en la máquina de pulir. Coloque la máquina a la velocidad más alta y la prensa " ejecutar " para moler las moscas durante 3 min
- Después de 3 min, dejar de moler y proceder con centrifugación de placa: 11bagGE durante 15 min a 4.000 x g, 4 º C. Después de la centrifugación, gestionar la placa pulida cuidadosamente para evitar mezclar el sobrenadante con la bolita de.
- Carga de muestra y determinación del contenido de etiqueta
- tomar una nueva placa de 96 pocillos espectrofotómetro. Utilizando una pipeta multicanal, carga 200 μL del reactivo de etiqueta en cada fila de la placa de.
- Carga 20 μl de PBT en el primer pozo de la primera fila, para crear un espacio en blanco. Mezclar mediante pipeteo arriba y abajo. Evitar la formación de burbujas de. Pozos de
- carga 20 μl de cada dilución estándar (en el paso 2.1.2) en el resto de la primera fila y mezclar mediante pipeteo arriba y abajo. Evitar la formación de burbujas de.
- Con una pipeta multicanal, transferencia 20 μl del sobrenadante de cada fila de la placa de pulido a la fila correspondiente en la placa de 96 pocillos espectrofotómetro. Pipetee hacia arriba y hacia abajo para mezclar bien. Evitar la formación de burbujas de.
- a continuación, coloque una hoja permeable al gas en la parte superior de la placa de 96 pozos.
- Incubar la placa a 37 ° C durante 10 minutos
Nota: Si hay burbujas en los pocillos, centrifugar la placa durante 2 minutos a 2.000 x g para eliminar todas las burbujas. La presencia de burbujas interfieren con la lectura de la absorbancia. - Leer la absorbancia de cada pocillo de la placa a 550 nm utilizando un lector de microplacas compatibles. A continuación, trazar la curva estándar y determinar la concentración [μg/μl] de las muestras desconocidas.
- Para determinar la cantidad de contenido de la etiqueta por medio de peso mosca, utilice la siguiente fórmula:
Nota: en el presente Protocolo, 3 moscas fueron picados en 600 μl de PBT; en consecuencia, el volumen promedio por vuelo es de 200 μl.
- Ensayo de Bradford y la normalización del contenido de la etiqueta con el contenido de proteína
- preparar siete 100 μl de las diluciones estándar de albúmina de suero bovino (BSA) (75 μg/mL, 100 μg/mL, 150 μg/mL, 200 μg/mL; 250 μg/mL; 500 μg/mL; 1.000 μg/mL) con el PBT.
- Tomar una placa de 96 pozos nuevos y cargar 200 μL de reactivo de Bradford X 1 en cada fila de la placa de.
- En el primer pozo de la primera fila, añadir 10 μl de PBT para crear un espacio en blanco. Mezclar mediante pipeteo arriba y abajo. Evitar la formación de burbujas de.
- Añadir 10 μl de cada dilución estándar en el resto de pozos de la primera fila y mezclar mediante pipeteo arriba y abajo. Evitar la formación de burbujas de.
- Con una pipeta multicanal, transferir 10 μl de la mosca del sobrenadante de cada fila de la placa de pulido en la fila correspondiente en la placa de 96 pocillos. Pipetee hacia arriba y hacia abajo para mezclar bien. Evitar la formación de burbujas de.
- Colocar una hoja permeable al gas en la parte superior de la placa de 96 pozos.
- Incubar la placa a temperatura ambiente durante 5 minutos. Si hay burbujas en los pocillos, centrifugar la placa durante 2 minutos a 2.000 x g para eliminarlos.
Nota: La presencia de burbujas interfieren con la lectura de la absorbancia. - Uso de un espectrofotómetro para leer la absorbancia del blanco, estándares y muestras desconocidas a 595 nm. Utilice la curva estándar para determinar las concentraciones [μg/μl] de las muestras en cada fila.
- Normalizar la etiqueta contenida con nivel de proteína mediante la fórmula siguiente:
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Resultados
En D. melanogaster, como es el caso con otras especies Existe dimorfismo sexual entre machos y hembras22. Es bien sabido que las hembras son más grandes, con más grasa en su abdomen que los machos22. Para probar la efectividad de nuestro protocolo, realizamos ensayos de etiqueta para determinar las diferencias en el contenido de la etiqueta entre machos y hembras de laboratorio estándar wildtype (w1118) vuela. Lo...
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Discusión
La inducción de la obesidad en ratones puede tomar meses19,20. En moscas, este HFD protocolo de alimentación permite la inducción de la excesiva acumulación de grasa en cuestión de días o menos, causando aumento en la acumulación de grasa solamente después de 18 h (ver figura 2). HFD de alimentación con el protocolo descrito aumenta glucosa contenido 12 y disminuye Bmm lipasa y de la expresión de PGC-...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Nos gustaría dar las gracias a Erika Taylor para la edición de este manuscrito. Este trabajo fue financiado por subvenciones de los institutos nacionales de salud (P01 HL098053, P01 AG033561 y HL054732 R01) a R.B., un suplemento de investigación post-doctoral (R01 HL085481) y compañerismo (AAUW) a S.B.D. y becas de la American Heart Association a S.B.D. y R.T.B.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Talboys Cuentagotas/Dispensador de cuentas | Talboys | #: 930150 | |
| Talboys Homogeneizador de Alto Rendimiento | Talboys | #: 930145 | |
| bolas de molienda, acero inoxidable | OPS Diagnostics, LLC | # GBSS 156-5000-01 | 5000 bolas |
| Masterblock 96 Microplacas profundas de pozos | Greiner Bio-One | # T-3058-1 | caja de 80 placas |
| Greiner Microplaca de 96 pocillos de fondo plano | Sigma Aldrich | # M4436 | 40 placas |
| Greiner CapMat para el sellado de placas de pocillos múltiples | Sigma Aldrich | # C3606 | 50 placas de sellado |
| Reservorios de reactivos& nbsp; | Thomas Scientific | # 1192T71 | 12/PK |
| Thermo Scientific Finnpipeta 4661040 | Thermo Scientific | # 4661040 | 1-10 ul Multipipeta |
| Thermo Scientific Finnpipeta 4661070 | Thermo Scientific | # 4661070 | 30-300ul multipipeta |
| Thermo Scientific Finnpipeta 4661020 | Thermo Scientific | #4661020 | 10-100ul multipipeta |
| multicanal Puntas | Denville Scientific Inc | # P3131-S | para pipeta de 10 uL |
| Puntas multicanal | Denville Scientific Inc | # P3133-S | para pipeta de 200 uL |
| Puntas multicanal | Denville Scientific Inc | #P1125 | para pipeta de 100 uL |
| Pinzas | Roboz Quirúrgico | # 5 Dumonts | Pinza superfina |
| Mettler Toledo Excellence XS Balanza analítica Mfr# XS64 | Cole-Parmer expertos científicos | # EW-11333-00 | |
| Metler Toledo Excellence XS Balanza de carga superior | Cole-Parmer expertos científicos | # EW-11333-49 | |
| Microplaca de 96 pocillos Centrífuga | Hettich Zentrifugen | # Microplaca Rotina 420R | |
| Lector | Dispositivos moleculares | # SpectraMax 190 | |
| Lab-Line Bench-Top Orbit Environ Shaker Incubadora | Biostad | # 3527 | |
| Reactivo de triglicéridos infinitos | Thermo Scientific | # TR22421 | |
| Estándar de triglicéridos | Stanbio | #2103 - 030 | |
| Inicio rápido Bradford Ensayo de proteínas | Bio-RAD | # 500-0205 | 1x reactivo de colorante |
| Aceite de coco | Nutiva | # 692752200014 | 15 0z tarro |
| PBS 10X | Thermo Scientific | # AM9625 | 500 ml |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | # 9002-93-1 | |
| Lámina permeable al gas | Macherey-Nagel | # | 740675 50 piezas |
| de filtro Papel | VWR | # 28317-241 | Paquete de 100 |
| viales de | DrosophilaGenesee Scientific | Cat #: 32-116SB | |
| Inicio Rápido Albúmina Suero Bovino Estándar | Bio-Rad | # 5000206 | |
| Anestésico FlyNap | Carolina | # 173025 | 100 mL |
| Kimwipes Low-Lint | Uline | # S-8115 | 1 capa, 4.4 x 8.4" |
Referencias
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