Artículo de método

Trasplante de células de germen primordiales para basada en CRISPR/Cas9 Leapfrogging en Xenopus

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DOI:

10.3791/56035

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1 de febrero de 2018

1Department of Developmental and Cell Biology, University of California, Irvine

En este artículo

Resumen

Genes esenciales para la supervivencia de plantean obstáculos técnicos para la creación de líneas mutantes. Leapfrogging evita mortalidad combinando genoma corrige con el trasplante de células de germen primordiales para crear tipo de salvaje animales portadores de mutaciones del germline. Evitamos también permite la generación eficiente de homocigotos mutantes nulos en la generación de1 F. Aquí, se demuestra el paso del trasplante.

Resumen

La creación de líneas mutantes por la edición del genoma está acelerando el análisis genético de muchos organismos. CRISPR/Cas9 métodos han sido adaptados para su uso en la rana con garras africana, Xenopus, un organismo modelo de larga data para investigación biomédica. Esquemas tradicionales para la creación de líneas homocigóticas mutantes con mutagénesis CRISPR/Cas9-objetivo tienen varios pasos lentos y laboriosos. Para facilitar la creación de embriones mutantes, particularmente para superar los obstáculos asociados a la anulación de los genes que son esenciales para la embriogénesis, se desarrolló un nuevo método llamado leapfrogging. Esta técnica aprovecha la solidez de Xenopus embriones para "cortar y pegar" métodos embriológicos. Leapfrogging utiliza a la transferencia de células de germen primordiales (PGCs) de embriones de donante mutagenized eficientemente en ablación de PGC wildtype hermanos. Este método permite la eficiente mutación de genes esenciales creando animales quiméricos con células somáticas de tipo salvaje que llevan un mutante del germline. Cuando dos animales de0 F portadores de "saltarse los trasplantes" (es decir, células de germen mutante) se cruzan, producen homocigóticos o compuestos heterozigóticos, nulos F1 embriones, ahorrando así un tiempo de toda una generación para obtener datos fenotípicos. Evitamos también proporciona un nuevo enfoque para el análisis de genes de efecto materno, que son refractarios a F0 fenotípica análisis CRISPR/Cas9 mutagénesis. Este manuscrito detalla el método de leapfrogging, con especial énfasis en cómo realizar con éxito trasplantes de PGC.

Introducción

Genotipo codifica el fenotipo ha sido una cuestión importante en la biología desde el redescubrimiento de las leyes de Mendel. Una comprensión de las funciones de los genes, su Reglamento y las interacciones en las redes de genes y las funciones de las promesas de productos codificados para proporcionar herramientas para descubrir nueva biología y mejorando Estados de enfermedad. Para más de la mitad del siglo1, la rana africana con garras, Xenopus, ha sido un líder modelo para estudios sobre una amplia variedad de temas en biología fundamental y biomedicina, incluyendo el control genético del desarrollo. Históricamente, la investigación en Xenopus ha utilizado la rana tetraploide, X. laevis, pero más recientemente, debido a su Diploidia, X. tropicalis ha sido desarrollado como un modelo genético de anfibios. Se han reunido las secuencias completas del genoma de ambas especies de Xenopus 2,3. La "comunidad de rana" está ahora en un punto de inflexión donde tecnología de la modificación básica del genoma permite el estudio de la función del gene, prácticamente a voluntad. Endonucleasas CRISPR/Cas9 programables han hecho que la mutagénesis de genes altamente eficientes, con mutación de biallelic posible en la mayoría de las células de los animales4,5,6,7, 8,9,10,11. Estos estudios, puesto de relieve por Bhattacharya et al. 12 y Shigeta et al. 13, han demostrado que la función de muchos genes puede estudiarse mediante mutagénesis en animales de mosaico F0 . Este enfoque tiene muchas ventajas; sin embargo, los embriones microinyectados Cas9-sgRNA a menudo Mostrar fenotipos variables debido a la incompleta pérdida de la función (LOF). Más significativamente, la generación de líneas mutantes es altamente ventajosa para algunas aplicaciones, en particular, al estudiar los genes que tienen una contribución materna del mRNA. Materna mRNAs y proteínas y sus influencias en la epigenética, persisten durante un período prolongado en embriogénesis14,15,16, haciendo las aportaciones del desarrollo tempranas de muchos genes refractario a los análisis de0 F. Por lo tanto, se necesitan otros enfoques LOF.

A la hora crear líneas mutantes, el camino a la obtención de embriones homocigóticos de LOF tiene varios obstáculos. Mutagénesis en primer lugar, eficiente para producir mutaciones biallelic puede ser una desventaja debido a pérdida de las funciones del gen esencial en el fracaso para sobrevivir hasta la madurez sexual, interfiriendo con la producción de una línea viable. Una solución común es la valoración cuidadosa de la cantidad de Cas9-sgRNA entregado. Aquí, el objetivo es lograr un equilibrio entre la reducción de la mortalidad mientras que también maximiza la eficiencia de mutagénesis del germline. Un segundo problema surge a partir del esquema de cría estándar, donde análisis fenotípicos se difieren hasta la generación de2 F. Utilizando el enfoque estándar, maduran sexualmente animales de0 F que transmiten a mutante alleles a través de la línea germinal son cruzadas para producir F1 heterocigoto "portadores", que luego crecen hasta la madurez sexual. Dos heterocigotos1 de F entonces se entrecruzan para producir embriones mutantes de F2 a una frecuencia mendeliana esperada del 25%. Así, dos generaciones de cría son necesarias para el análisis de los fenotipos mutantes. Animales mutantes podrían ser homocigotos o heterocigotos compuestos (es decir, progenie que contiene dos diferentes alelos del mutante, que depende de los genotipos de los padres animales utilizados en los intercross de1 F).

Estos obstáculos pueden superarse por confinamiento programable mutagénesis mediada por la nucleasa a las células de germen, que es la base de un nuevo método llamado saltar17. Leapfrogging tiene dos componentes principales: (1) la microinyección de mRNA Cas junto con sgRNA o nucleasa-sgRNA complejos (o de las nucleasas de dedos de principio, TALENs o zinc) en la etapa unicelular a eficientemente mutagenize genoma embrionario, seguido por (2) el trasplante de PGCs en embriones de tipo salvaje hermano, donde se eliminaron las PGCs endógenas. Puede obtenerse cuando ambos pasos son reemplazo del germline eficiente, completo con las células de germen mutantes. Blackler demostró en la década de 1960 que Xenopus PGCs podrían trasplantarse entre embriones con la neurula tarde y temprano tailbud etapas18,19. Para leapfrogging, enfoque de Blackler fue modificada mediante la realización de los trasplantes en el blastula etapa17, cuando PGCs se localizan en el polo vegetal del embrión20,21. Trasplante antes de la gastrulación tiene dos ventajas principales. En primer lugar, el engraftment de trasplantes y el posterior desarrollo normal fue encontrado para ser más eficiente cuando el trasplante se realiza en la fase de blástula (observaciones no publicadas). En segundo lugar, realizando trasplantes de blastula etapa poco después transcripción cigóticos ha comenzado, uno puede evitar la letalidad resultantes del desarrollo gene mutaciones que afecten la gastrulación u originar malformaciones neurulae finales. PGC trasplante-cojinete ("saltaba") embriones son cultivados a la madurez sexual, y intercrosses entre estos F0 de animales han demostrado que, en muchos casos, 100% de la progenie de1 F muestran el fenotipo LOF (la mayoría siendo compuesto los heterocigotos), indicando la sustitución completa del germline con mutaciones específicas.

Se espera que evitamos acelerará enfoques genéticos en Xenopus. Evitamos también proporciona una alternativa al método de "transferencia de acogida"22 para el análisis de genes de efecto materno (observaciones no publicadas) de LOF. En la publicación actual, se presenta una descripción detallada del método, centrándose especialmente en el trasplante del PGC, en X. tropicalis (con pequeñas modificaciones para X. laevis). El trasplante de PGCs se demuestra aquí para facilitar a una transferencia más rápida de esta tecnología a otros laboratorios que trabajan con Xenopus. Los principios de este método deben ser exitosos en otros anfibios (e.g., tritones), y específicas del organismo modificaciones en la metodología deben permitir para el uso de muchos otros animales en el que se puede lograr eficiente mutagénesis y PGCs son fácilmente transplantables.

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Protocolo

Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el cuidado de Animal institucional y Comité de uso de la Universidad de California, Irvine.

1. preparación para el trasplante del PGC

  1. Prepara con antelación, herramientas de disección como se describió anteriormente23.
    Nota: Cuchillos de pelo de la ceja se utilizan para hacer incisiones con la ayuda de un lazo del pelo para estabilizar el embrión mientras se realizan las cirugías. Pelos de la ceja y bucles de cabello pegados en el vidrio de borosilicate Pipetas Pasteur primero dibujadas en una llama y rotos en la porción adelgazada (vea la figura 1A, punta de flecha) para crear una punta más corta y más estrecha (figura 1B) para una mayor destreza Cuando se realizan cirugías.
  2. Generar sgRNAs con procedimientos previamente descritos24 .
    Nota: Brevemente, corta plantillas de la DNA que codifica para sgRNAs se crean utilizando deoxyoligonucleotides superpuestos que contienen 5' promotores de bacteriófago T7, que se recuecen y "rellena" por una ADN polimerasa termoestable, libre de errores. Se incuban in vitro reacciones síntesis sgRNA durante varias horas hasta toda la noche (según el kit utilizado). Las reacciones son tratados con DNasa para quitar la plantilla. Los sgRNAs son purificados por métodos estándar de fenol/cloroformo extracción y amonio acetato/isopropanol precipitación, según instrucciones24 del fabricante kit.
  3. Poco antes de la realización de microinyecciones, preparar Cas9 sgRNA complejos por primera desnaturalización ~ 250 ng de sgRNA en un volumen total de 3 μl de Rnasa-libre (Tratado diethylpyrocarbonate) H2O a 60-65 ° C por 5 min, seguido de un enfriamiento rápido con hielo durante 5 minutos. Centrifugue el sgRNA durante unos segundos, añadir 1 μl de proteína de Cas9 de 1 μg/μl e incubar 10 min a 37 ° C para promover la formación de complejos.
    Nota: Después de la incubación, el tubo puede conservarse en hielo mientras se preparan los embriones para microinyección.
  4. Obtener X. tropicalis de embriones por fertilización in vitro usando métodos estándar, como se describió anteriormente25. La jalea25,26 los embriones en fertilización después de 10 minutos.
    Nota: El tiempo de fertilización se considera el tiempo después de la suspensión de esperma se agrega a los huevos y el plato se inunda de 1/9thX modificado timbres (MMR)26 de Marc. Para X. tropicalis25, a diferencia de X. laevis, realizar la-jellying en 1/9 x MMR que contiene 3% cisteína libre base (no la sal del ácido clorhídrico), pH ajustado a 7,8-8,0, seguida de múltiples lavados en 1/9 x MMR. Transfiera los embriones a una agarosa (1%)-plato recubierto que contiene 1/9 x MMR a temperatura ambiente.
  5. Inmediatamente transferir los embriones que se inyecta a un plato cubierto de agarosa 1%, que contiene 1 x MMR con una pipeta Pasteur.
  6. Inyectar en la etapa de 1 célula. Ver referencias26,27 para descripciones detalladas de los métodos de microinyección de Xenopus .
    1. Inyectar cada embrión en un solo lugar en el polo animal, con 4 nL Cas9 sgRNA complejo (cantidad final = 1 ng de Cas9 y ~ 250 pg de sgRNA; véase la discusión)24. Después de 10-20 min de la curación de sitio de inyección, transferir los embriones a un plato cubierto de agarosa que contiene 1/9 x MMR e incubar a 25 ° C. También crear un plato de uninjected hermano embriones que servirán como receptoras de injerto.
  7. Preparar placas de Petri (60 mm) que contienen un ~ 5 mm-capa de agarosa al 1% en 0.3 x MMR, si haciendo trasplantes en X. tropicaliso 1 x MMR para X. laevis.
    1. Crear depresiones ~ 3-4 mm profundidad insertando un 3-x 4-well molde (creado por cortar una placa de PCR de 96 pocillos) en la agarosa fundida al verter a las placas (ver figura 1 y D). Sujete el molde varios milímetros por encima de la parte inferior de la caja Petri con una pinza unida a un soporte de anillo hasta que la agarosa se ha endurecido.
    2. Además, hacer una placa de 24 pocillos a los embriones individuales casa cubriendo los pozos con una fina capa de agarosa al 1% en 1/9 x MMR.
      Nota: El medio de cultivo a estos pozos es de 1/9 x que MMR suplementado con 50 μg de sulfato de gentamicina/mL.

2. trasplante de PGCs

  1. Cuando los embriones alcanzan sólo Nieuwkoop y Faber28 blastula etapa 9 (figura 2A), ~4.5 h después fertilización (hpf) de X. tropicalis, quite de la incubadora de 25 ° C y permite que se equilibren a temperatura ambiente durante 0.5 h.
  2. Para comenzar el trasplante en 5 hpf (figura 2B), utilice una pipeta Pasteur transferir un embrión de donante PGC (inyectado con Cas9 sgRNA) al plato de agarosa de 60 mm que contiene depresiones (creadas en el paso 1.7) en 0.3 x MMR (o 1 x MMR si utiliza X. laevis). También transferir un embrión de uninjected hermano, el receptor del injerto, para este plato.
    Nota: Es crítico que las identidades de cada uno de esos embriones no se confunden.
  3. Manualmente quitar el vitelinas sobres de cada embrión con unas pinzas y girar ambos embriones de forma que su polo vegetal esté en la vista y accesible para la cirugía.
    Nota: Una descripción de manual de-vitellination de embriones ha sido previamente descrito26.
  4. Con la punta afilada de un cuchillo de pelo de la ceja, hacer cuatro incisiones poco profundas en la forma de un cuadrado en el polo vegetal del embrión receptor, dentro de la zona donde se forman células botella futuro que marcan el blastopore. Hacer las incisiones insertando la punta de la cuchilla de pelo de la ceja en el embrión, justo debajo de la superficie y hacer cortar hacia arriba los movimientos mientras se estabiliza el embrión con el lazo del pelo.
    Nota: La figura 2 muestra un embrión vegetales vistas en intervalos de media hora de 4.5-7.0 hpf para mostrar el tamaño de celda y proporcionar una guía para estimar donde las células de botellas que forman (círculo blanco discontinua). El objetivo es hacer incisiones donde se indica la caja negra punteada.
  5. Una vez que los cuatro lados de la Plaza están delineados por incisiones, profundizar cada incisión con el cuchillo de pelo de cejas usando movimientos de corte similar para llegar a una profundidad de aproximadamente 1/3 a 1/2 de la distancia al suelo del blastocoel.
  6. Libre de los explantes de tejido vegetal del embrión receptor (Figura 3A y B) haciendo una horizontal (paralela a la superficie vegetal) cut(s) en la región vegetal profundo.
    Nota: El tamaño de explante vegetal que contiene el PGC es aproximadamente 0.4 0.45 mm por lado y 0.25-0.3 mm de profundidad. Este explante vegetal del embrión receptor ya no es necesario y por lo tanto debe ser apartar a ser desechada.
  7. Trabajando rápidamente, repita este procedimiento (pasos 2.4-2.6) en el embrión de donante PGC para crear un fragmento de tejido vegetal de tamaño similar para el trasplante.
    Nota: Es importante llevar a cabo esta segunda disección con poco retraso para minimizar el tiempo para el embrión receptor sanar su herida abierta.
  8. Una vez que se extirpa el tejido que contiene PGCs del embrión donante, utilice el lazo de cuchillo y pelo de ceja pelo para mover este explante en posición en la abertura que se crea en el embrión de la receptora.
    Nota: La superficie interior del injerto donante debe estar hacia el interior del embrión receptor. No es necesario para que coincida con las orientaciones de los ejes del injerto con el embrión receptor dorsal-ventral y de izquierda a derecha.
  9. Utilice el borde largo del eje de la cuchilla de cejas cabello, cabo paralelo a la superficie del injerto, para presionar suavemente el injerto en la abertura de la superficie vegetal del embrión receptor.
  10. Una vez que se ha colocado el injerto, use un hairloop o el mango de un cuchillo de pelo de la ceja se deslice suavemente el "cadáver" del embrión donante a través de la superficie de agarosa y en una depresión de agarosa. Asegúrese de que la herida abierta de la carcasa encuentra en el líquido a granel. Si no es así, utilice el cuchillo de pelo de la ceja para girar el embrión para conseguir esta orientación.
  11. Deslice el embrión receptor, con el injerto de curación en el lugar, en una depresión adyacente y además Asegúrese de que el tejido injertado poste vegetal encuentra en el líquido a granel.
  12. Repita este procedimiento (pasos 2.1-2.11) con otro par de donantes y receptores embriones para crear otro par de trasplante/canal; la transferencia de éstos a las depresiones vacías.
    Nota: Es crítico que se hacen anotaciones para el seguimiento de los pares coincidentes de canales y rodamiento de trasplante de embriones. Los cadáveres de donantes se utilizará como un proxy para la eficiencia de mutagénesis inducida por sgRNA Cas9 en las PGCs trasplantadas, que no pueden ensayarse fácilmente hasta los animales del cojinete de trasplante alcanzan la madurez sexual (vea el paso 3.3, a continuación y la discusión ).
  13. Seguir haciendo trasplantes hasta que los embriones alcancen la etapa de gástrula temprana aproximadamente 10, que es aproximadamente 6.5 hpf en X. tropicalis (ver Figura 2E).

3. la cura cuidado de embriones

Nota: Injertos de sanan en su lugar dentro de ~ 30 min, y es normal observar algunos restos yolky de lisis celular lleno del embrión (figura 3).

  1. Una vez curado, utilice una pipeta Pasteur a los embriones de transferencia muy suavemente de las depresiones en los pocillos de una placa de 24 pocillos recubiertos de agarosa. El exudado sea eliminado (Figura 3D) por el líquido de mezcla durante la transferencia.
    1. Gire los embriones que se encuentran vegetales poste hacia arriba, hacia la solución a granel. Otra vez, coloque los cadáveres donantes e injerto destinatarios en pozos adyacentes para ayudar a mantener un registro de parejas de embrión; registrar esta información.
  2. La transferencia de la placa de 24 pocillos que contienen embriones en una incubadora de 25 ° C para la cultura durante la noche.
    Nota: Al día siguiente, los embriones habrán alcanzado las etapas tailbud.
  3. Mueva los recipientes del injerto para limpiar placas de 6 pozos recubiertos de agarosa que contiene 1/9 x que MMR suplementado con 50 μg de sulfato de gentamicina/mL, con 1 embrión por pozo. Mantener un registro claro de cadáveres donantes que coincidan con estos receptores de injerto.
  4. Evaluar la eficiencia de mutagénesis por secuenciación PCR amplicones5,17,24 o mediante otros métodos que dependen de amplicones de PCR (ver discusión), hacia canales individuales tubos de tira PCR de 0,2 mL. Eliminar la mayor parte del medio y homogeneizar en 100 μl de buffer de lisis24 con proteinasa K (PK) por repetidos altibajos el pipeteo con una pipeta de P200.
  5. Realizar el embrión lisis24 a 56 ° C por 6 horas hasta toda la noche para permitir la digestión de PK. PK de inactivar por calentamiento a 90-95 ° C durante 10 min, seguido de un enfriamiento rápido a 4 º C. Utilizar lisados sin más pasos de limpieza para las reacciones de PCR para obtener amplicones corto directo ADN Sanger secuenciación24la semilla. Tienda los lisados a-20 ° C.
    Nota: Dentro de varios días, los renacuajos alcanzarán alimentación etapas (etapa aproximadamente de 45-46) y se pueden alimentar una suspensión de polvo planctónico (sera Micron).
  6. Después de ~ 1 semana, con cambios diarios del medio de cultivo para mantener la limpieza y minimizar la proliferación microbiana, hacia los renacuajos pequeños tanques en un sistema acuático circulando con flujo de goteo. Utilizar los datos de secuenciación para segregar los renacuajos con altamente eficiente mutagenized PGCs de renacuajos con más baja eficiencia de mutagénesis. Una vez completada la metamorfosis, hacia las ranitas del sistema acuático adultos en el laboratorio.
    Nota: Los regímenes desarrollados por el recurso nacional de Xenopus (Marine Biology Laboratory, Woods Hole, MA) proporcionan a una guía de alimentación29 y rana adulto mantenimiento30de renacuajos.

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Resultados

Después del trasplante, la determinación cualitativa de la eficacia de la mutagénesis CRISPR/Cas9 debe realizarse antes de gastar el esfuerzo en la cría de animales para crecer y mantener los animales a la madurez sexual. Porque animales portadores de trasplantes de leapfrog son somáticamente wildtype y la línea germinal es de difícil acceso para la medición directa, guardar los cadáveres de embriones de donante se convierte en importante. Análisis de ADN de los cadáveres actúa como un pr...

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Discusión

Este informe proporciona un protocolo detallado para el trasplante de tejido vegetal que contiene PGCs. trasplante de PGCs se utiliza en conjunción con las tecnologías de la edición del genoma (por ejemplo, CRISPR/Cas9) para modificar la línea germinal de un animal mientras mantenimiento de casi todos los tejidos somáticos como genéticamente tipo salvaje. Para evitamos para tener éxito, hay una serie de factores críticos a tener en cuenta antes de realizar realizar trasplantes.

Para g...

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Divulgaciones

El autor no tiene nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue realizado con el apoyo de una beca, 5R21HD080684-02, del Instituto Nacional de salud infantil y desarrollo humano. El autor desea dar las gracias a Ken Cho por su constante entusiasmo y apoyo. El autor agradece también a Bruce Blumberg para uso de su cámara, Rebeca Charney, para la lectura crítica del manuscrito y Sean McNamara y Marcin Wlizla en el recurso nacional de Xenopus (RRID:SCR_013731), por la valiosa conversaciones sobre X. tropicalis de alimentación y los regímenes de cuidado de los animales.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Pinzas Dumont #5Fine Science Tools11252-20 o 11252-30
el pelo para cejas
para el cabello Pipetas
Pasteur caseras, vidrio de borosilicatoFisher Scientific13-678-20A
Krazy Glue (a base de cianoacrilato)Elmer's Products, Inc.KG581Para fijar el pelo de las cejas y los bucles en las pipetas Pasteur, se pueden utilizar otros pegamentos similares.
Oligodesoxinucleótidos, ordenados a medidaTecnologías de ADN integradasde plantilla ordenados a medidapara la síntesis de sgRNA, consulte Nakayama et al., 2014 para obtener detalles de diseño.
Kit Megascript T7Ambion/ThermoFisherAM1334O utilice el kit Megashortscript T7 (AM1354)
Fenol, Tris tamponadoFenol destilado de alta calidad de cualquier proveedor comercial
CloroformoCloroformo de alta calidad de cualquier proveedor comercial
EtanolEtanol de alta calidad de cualquier proveedor comercial
Dietilpirocarbonato (DEPC)Sigma Chemical Co.Proteína Cas9 D5758-50ML
con señal de localización nuclearPNA Bio, Inc.CP01Reconstituido con agua tratada con DEPC según las recomendaciones del fabricante
Solución 10X Marc's Modified RingersCasera. La receta (ref 26) para 1X MMR (sin EDTA) es 100 mM de NaCl, 2 mM de KCl, 1 mM de MgSO4, 2 mM de CaCl2, 5 mM de HEPES. La solución tiene un pH ajustado a 7,4.
AgarosaCualquier grado de Biología Molecular la agarosa es suficiente
60 X15 mm Placas de PetriFalcon351007
Placas de 24 pocillosFalcon3047
L-CisteínaSigma Chemical Co.C7352-100GBase libre, no sal de HCl
Proteinasa KRoche03 115 828 001Por lo general, ~ 20 mg / ml de
Roche SERA MicronSERATadpole food. Volver a suspender en medio de crecimiento. Se puede comprar en una variedad de minoristas en línea
Cuchillo para Lazo casero Oligonucleótidos ,

Referencias

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