Trasplante de células de germen primordiales para basada en CRISPR/Cas9 Leapfrogging en Xenopus

Resumen

Genes esenciales para la supervivencia de plantean obstáculos técnicos para la creación de líneas mutantes. Leapfrogging evita mortalidad combinando genoma corrige con el trasplante de células de germen primordiales para crear tipo de salvaje animales portadores de mutaciones del germline. Evitamos también permite la generación eficiente de homocigotos mutantes nulos en la generación de₁ F. Aquí, se demuestra el paso del trasplante.

Resumen

La creación de líneas mutantes por la edición del genoma está acelerando el análisis genético de muchos organismos. CRISPR/Cas9 métodos han sido adaptados para su uso en la rana con garras africana, Xenopus, un organismo modelo de larga data para investigación biomédica. Esquemas tradicionales para la creación de líneas homocigóticas mutantes con mutagénesis CRISPR/Cas9-objetivo tienen varios pasos lentos y laboriosos. Para facilitar la creación de embriones mutantes, particularmente para superar los obstáculos asociados a la anulación de los genes que son esenciales para la embriogénesis, se desarrolló un nuevo método llamado leapfrogging. Esta técnica aprovecha la solidez de Xenopus embriones para "cortar y pegar" métodos embriológicos. Leapfrogging utiliza a la transferencia de células de germen primordiales (PGCs) de embriones de donante mutagenized eficientemente en ablación de PGC wildtype hermanos. Este método permite la eficiente mutación de genes esenciales creando animales quiméricos con células somáticas de tipo salvaje que llevan un mutante del germline. Cuando dos animales de₀ F portadores de "saltarse los trasplantes" (es decir, células de germen mutante) se cruzan, producen homocigóticos o compuestos heterozigóticos, nulos F₁ embriones, ahorrando así un tiempo de toda una generación para obtener datos fenotípicos. Evitamos también proporciona un nuevo enfoque para el análisis de genes de efecto materno, que son refractarios a F₀ fenotípica análisis CRISPR/Cas9 mutagénesis. Este manuscrito detalla el método de leapfrogging, con especial énfasis en cómo realizar con éxito trasplantes de PGC.

Introducción

Genotipo codifica el fenotipo ha sido una cuestión importante en la biología desde el redescubrimiento de las leyes de Mendel. Una comprensión de las funciones de los genes, su Reglamento y las interacciones en las redes de genes y las funciones de las promesas de productos codificados para proporcionar herramientas para descubrir nueva biología y mejorando Estados de enfermedad. Para más de la mitad del siglo¹, la rana africana con garras, Xenopus, ha sido un líder modelo para estudios sobre una amplia variedad de temas en biología fundamental y biomedicina, incluyendo el control genético del desarrollo. Históricamente, la investigaci....

Protocolo

Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el cuidado de Animal institucional y Comité de uso de la Universidad de California, Irvine.

1. preparación para el trasplante del PGC

1. Prepara con antelación, herramientas de disección como se describió anteriormente²³.
   Nota: Cuchillos de pelo de la ceja se utilizan para hacer incisiones con la ayuda de un lazo del pelo para estabilizar el embrión mientras se realizan las cirugías. Pelos de la ceja y bucles de cabello pegados en el vidrio de borosilicate Pipetas Pasteur primero dibujadas en una llama y rotos en la porción adelgazada (vea la

Resultados

Después del trasplante, la determinación cualitativa de la eficacia de la mutagénesis CRISPR/Cas9 debe realizarse antes de gastar el esfuerzo en la cría de animales para crecer y mantener los animales a la madurez sexual. Porque animales portadores de trasplantes de leapfrog son somáticamente wildtype y la línea germinal es de difícil acceso para la medición directa, guardar los cadáveres de embriones de donante se convierte en importante. Análisis de ADN de los cadáveres actúa como un pr.......

Discusión

Este informe proporciona un protocolo detallado para el trasplante de tejido vegetal que contiene PGCs. trasplante de PGCs se utiliza en conjunción con las tecnologías de la edición del genoma (por ejemplo, CRISPR/Cas9) para modificar la línea germinal de un animal mientras mantenimiento de casi todos los tejidos somáticos como genéticamente tipo salvaje. Para evitamos para tener éxito, hay una serie de factores críticos a tener en cuenta antes de realizar realizar trasplantes.

Para g.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Pinzas Dumont #5	Fine Science Tools	11252-20 o 11252-30
		el pelo para cejas
		para el cabello Pipetas
Pasteur caseras, vidrio de borosilicato	Fisher Scientific	13-678-20A
Krazy Glue (a base de cianoacrilato)	Elmer's Products, Inc.	KG581	Para fijar el pelo de las cejas y los bucles en las pipetas Pasteur, se pueden utilizar otros pegamentos similares.
Oligodesoxinucleótidos, ordenados a medida	Tecnologías de ADN integradas	de plantilla ordenados a medida	para la síntesis de sgRNA, consulte Nakayama et al., 2014 para obtener detalles de diseño.
Kit Megascript T7	Ambion/ThermoFisher	AM1334	O utilice el kit Megashortscript T7 (AM1354)
Fenol, Tris tamponado			Fenol destilado de alta calidad de cualquier proveedor comercial
Cloroformo			Cloroformo de alta calidad de cualquier proveedor comercial
Etanol			Etanol de alta calidad de cualquier proveedor comercial
Dietilpirocarbonato (DEPC)	Sigma Chemical Co.	Proteína Cas9 D5758-50ML
con señal de localización nuclear	PNA Bio, Inc.	CP01	Reconstituido con agua tratada con DEPC según las recomendaciones del fabricante
Solución 10X Marc's Modified Ringers			Casera. La receta (ref 26) para 1X MMR (sin EDTA) es 100 mM de NaCl, 2 mM de KCl, 1 mM de MgSO4, 2 mM de CaCl2, 5 mM de HEPES. La solución tiene un pH ajustado a 7,4.
Agarosa			Cualquier grado de Biología Molecular la agarosa es suficiente
60 X15 mm Placas de Petri	Falcon	351007
Placas de 24 pocillos	Falcon	3047
L-Cisteína	Sigma Chemical Co.	C7352-100G	Base libre, no sal de HCl
Proteinasa K	Roche	03 115 828 001	Por lo general, ~ 20 mg / ml de
Roche SERA Micron	SERA		Tadpole food. Volver a suspender en medio de crecimiento. Se puede comprar en una variedad de minoristas en línea

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