Nitrógeno cavitación y centrifugación diferencial permite el monitoreo de la distribución periférica de proteínas de membrana en células cultivadas

Resumen

Aquí presentamos los protocolos para la homogeneización de detergente libre de células de mamíferos cultivadas basado en nitrógeno cavitación y posterior separación de las proteínas citosólicas y membrana-limitan por ultracentrifugación. Este método es ideal para el monitoreo de la partición de proteínas periféricas de membrana entre soluble y fracciones de la membrana.

Resumen

Las células cultivadas son útiles para estudiar la distribución subcelular de proteínas, incluyendo proteínas de membrana periférica. Codificada genéticamente fluorescente etiquetadas proteínas han revolucionado el estudio de la distribución subcelular de la proteína. Sin embargo, es difícil cuantificar la distribución con microscopia fluorescente, especialmente cuando las proteínas son parcialmente citosólicas. Por otra parte, a menudo es importante para el estudio de proteínas endógenas. Bioquímicos de ensayos como immunoblots siguen siendo el estándar de oro para la cuantificación de la distribución de la proteína después de fraccionamiento subcelular. Aunque existen kits comerciales que tienen como objetivo aislar citosólica o ciertas fracciones de la membrana, la mayoría de estos kits se basa en la extracción con detergentes, que puede ser inadecuado para el estudio de proteínas de membrana periférica que se extraen fácilmente las membranas. Aquí presentamos un protocolo libre de detergente para celular homogeneización por nitrógeno cavitación y posterior separación de las proteínas citosólicas y membrana-limitan por ultracentrifugación. Confirman la separación de orgánulos subcelulares en soluble y fracciones de pellets a través de diferentes tipos de células y comparar la extracción de proteínas entre varios métodos de homogeneización mecánica no-base de detergente común. Entre varias ventajas de nitrógeno la cavitación es la superior eficacia de disrupción celular con daño mínimo de físico y químico delicada organelos. Combinado con ultracentrifugación, nitrógeno la cavitación es un método excelente para examinar el cambio de las proteínas periféricas de membrana entre citosólica y fracciones de la membrana.

Introducción

Proteínas celulares se pueden dividir en dos clases: los que están asociados a membranas y aquellos que no son. No-membrana las proteínas asociadas se encuentran en el citosol, nucleoplasia y lumina de orgánulos como el retículo endoplásmico (ER). Hay dos clases de proteínas asociadas a membrana, integrales y periféricas. Proteínas integrales de membrana también son conocidas como proteínas transmembranales porque uno o más segmentos de la cadena polipeptídica atraviesa la membrana, por lo general como una α-hélice compuesta de aminoácidos hidrofóbicos. Proteínas transmembranales co-translationally se insertan en las membranas en el curso de su biosíntesis y permanece....

Protocolo

1. buffer y preparaciones de equipo

1. enfriar 45 mL celular interrupción bombas, tubos de 15 mL y tubos de ultracentrifugación a 4 ° C.
2. Preparación y 25 mL de buffer de homogenización por 2 x 10 ⁷ células a 4 ° C. agregar una proteasa inhibidor tableta antes de uso.
   Nota: Reservas de homogeneización normalmente contienen KCl en vez de NaCl para mejor reflejar la composición sal intracelular. Buffer de homogeneización utilizado en este protocolo se compone de 10 mM HEPES, pH 7.4, 10 mM KCl y 1,5 mM de MgCl ₂ (en lo sucesivo como buffer de homogeneización hipotónica). Almacenadores intermediarios la mayoría pueden ser adap....

Resultados

La figura 2 muestra la partición de proteínas celulares del PNS en la fracción citosólica soluble (S) o fracción de la pelotilla de membrana (P). Examinamos tres líneas de células representativas de diferentes tipos de células: HEK-293 (epiteliales), NIH-3T3 (fibroblastos) y Jurkat (linfocito). Inhibidores de disociación de guanina de Rho (RhoGDI) y receptor de manosa-6-fosfato catión independiente (CIMPR) fueron utilizados como controles positivos para citos.......

Discusión

Son múltiples las ventajas de la cavitación de nitrógeno sobre otros métodos de alteración mecánica. Quizás el beneficio más significativo es su capacidad para suavemente y eficientemente homogeneizar a muestras. Los principios físicos de descompresión enfría muestras en lugar de generar daño de calentamiento local como ultrasonidos y fricción/cizallamiento basado en técnicas. La cavitación también es extremadamente eficaz en alterar la membrana plasmática. Porque el nitrógeno de las burbujas se generan dentro de cada cé.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Recipiente de disrupción celular (45 mL)	Parr Instrument	4639	Bomba de cavitación de nitrógeno
Homogeneizador Dounce (2 mL)	Kontes	885300-0002	Mortero y tubo Dounce
Jeringa de insulina U-100 28G½	Becton Dickinson	329461	Needle Anticuerpo
Atg12	Santa Cruz	271688	Anticuerpo de ratón, uso con dilución 1:1000
β-anticuerpo de actina	Santa Cruz	47778	Anticuerpo de ratón, uso con dilución 1:1000
β-anticuerpo de tubulina	DSHB	E7-s	Anticuerpo de ratón, uso con una dilución de 1:5000
Anticuerpo de calnexina	Santa Cruz	23954	Anticuerpo de ratón, uso con una dilución de 1:1000
Anticuerpo contra la calregulina	373863 Santa Cruz		Anticuerpo de ratón, uso con una dilución de 1:1000
Anticuerpo contra la catalasa	271803 de Santa Cruz		Anticuerpo de ratón, uso con una dilución de 1:1000
Anticuerpo CIMPR	Abcam	124767	Anticuerpo de conejo, uso con una dilución de 1:1000
Anticuerpo EEA1	Santa Cruz	137130	Anticuerpo de ratón, uso con dilución 1:1000
Anticuerpo EGFR	Santa Cruz	373746	Anticuerpo de ratón, uso con dilución 1:1000
Anticuerpo F0-ATPasa	Santa Cruz	514419	Anticuerpo anticuerpo de ratón, uso con dilución 1:1000
Anticuerpo F1-ATPasa	Santa Cruz	55597	Anticuerpo de ratón, uso con dilución 1:1000
Anticuerpo	fibrilarinaSanta Cruz	374022	Anticuerpo de ratón, uso con una dilución de 1:200
Anticuerpo contra Golgin 97	Anticuerpo de ratón Santa Cruz	59820	uso con dilución de 1:1000
Anticuerpo HDAC1	Santa Cruz	81598	Anticuerpo de ratón, uso con una dilución de 1:1000
Anticuerpo contra la hexoquinasa 1	Tecnología de señalización celular	2024S	Anticuerpo de conejo, uso con dilución 1:1000
Anticuerpo	Lamin A/CSanta Cruz	376248	Anticuerpo de ratón, uso con una dilución de 1:1000
Anticuerpo LAMP1	DSHB	H4A3-c	Anticuerpo de ratón, uso con una dilución de 1:1000
Na+/K+ Anticuerpo ATPasa	Santa Cruz	48345	Anticuerpo de ratón, uso con dilución 1:1000
Anticuerpo Rab7	Abcam	137029	Anticuerpo de conejo, uso con una dilución de 1:1000
Rab9 anticuerpo	Thermo	MA3-067	Anticuerpo de ratón, uso con una dilución de 1:1000
Anticuerpo RCAS1	398052 Santa Cruz		Anticuerpo de ratón, uso con dilución de 1:1000
Anticuerpo RhoGDI	Santa Cruz	360	Anticuerpo de conejo, uso con una dilución de 1:3000
Anticuerpo S6 de proteína ribosómica	Santa Cruz	74459	Anticuerpo de ratón, uso con dilución de 1:1000
Anticuerpo Sec61a	Santa Cruz	12322	Anticuerpo de cabra, uso en dilución 1:1000
Tubo de ultracentrífuga de policarbonato de pared gruesa	Beckman Coulter	349622	Tubo de muestra para ultracentrifugación
Rotor TLK-100.3	Rotor Beckman Coulter	349481	para ultracentrifugación
Optima MAX Ultracentrífuga personal de alta capacidad	Ultracentrífuga	Beckman Coulter	364300
cOmplete inhibidor de la proteasa comprimidos cóctel Roche		11697498001	inhibidores de la proteasa
Raspadores celulares con mango de 25 cm y cuchilla de 3,0 cm	Corning	353089	raspador de células grandes
Barra de agitación magnética	Fisher Scientific	14-513-57SIX	micro barra de agitación
Agitador magnético de cerámica	Fisher Scientific	S504501AS

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