Artículo de método

Nanotubos de ADN como una herramienta versátil para el estudio de polímeros Semiflexible

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DOI:

10.3791/56056

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25 de octubre de 2017

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1Fraunhofer Institute for Cell Therapy and Immunology, 2Institute of Experimental Physics I, Universität Leipzig

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Polímeros semiflexible mostrar propiedades mecánicas únicas que se aplican extensivamente por los sistemas de vida. Sin embargo, estudios sistemáticos sobre biopolímeros son limitados puesto que propiedades como la rigidez del polímero son inaccesibles. Este manuscrito describe cómo esta limitación es burlada por nanotubos de ADN programables, permitiendo estudios experimentales sobre los efectos de la rigidez del filamento.

Resumen

Propiedades mecánicas de la materia suave complejo, basados en polímeros, tales como células o redes de biopolímero, pueden entenderse en ninguno de los dos el marco clásico de polímeros flexibles ni de varillas rígidas. Filamentos subyacentes permanecen extendidos debido a su rigidez de columna vertebral no desaparece, que es cuantificada a través de la longitud de persistencia (lp), pero también están sujetos a fuertes fluctuaciones térmicas. Su rigidez de flexión finita conduce a la mecánica colectiva única, no trivial de redes a granel, lo que permite la formación de andamios estables en fracciones de volumen bajo mientras que proporciona los tamaños de malla grande. Este principio subyacente es frecuente en la naturaleza (por ejemplo, en células o tejidos), minimizando el alto contenido molecular y facilitando la difusión o transporte activo. Debido a sus implicaciones biológicas y potenciales aplicaciones tecnológicas en hidrogeles biocompatibles, semiflexible polímeros han sido objeto de considerable estudio. Sin embargo, investigaciones comprensibles seguía siendo difíciles desde que los polímeros naturales, tales como filamentos de actina, que no son libremente ajustables. A pesar de estas limitaciones y debido a la falta de polímeros sintéticos, mecánicamente ajustables y semiflexible, filamentos de actina se establecieron como el sistema de modelo común. Una limitación importante es que la cantidad central lp no puede ajustarse libremente para estudiar su impacto en las estructuras macroscópicas a granel. Esta limitación fue resuelto mediante el empleo de nanotubos de ADN estructuralmente programables, permitiendo la alteración controlada de la rigidez del filamento. Se forman a través de diseños de azulejos, donde un discreto conjunto de filamentos parcialmente complementarios hibridar en una estructura de anillo con una circunferencia de discreta. Estos anillos presentan extremos pegajosos, lo que permite la polimerización efectiva en filamentos de varias micras de longitud y mostrar la cinética de polimerización similar como biopolímeros naturales. Debido a su mecánica programable, estos tubos son herramientas versátiles, novela para estudiar el impacto de lp de la solo-molécula así como la escala mayor. En contraste con los filamentos de actina, permanecen estables durante semanas, sin notable degeneración, y su manejo es sencillo comparable.

Introducción

Debido a los comportamientos complejos habilitados por sus propiedades mecánicas únicas, polímeros semiflexible son bloques de construcción fundamentales de la materia viva. En contraste con los polímeros flexibles, semiflexible polímeros adoptan una configuración extendida debido a su rigidez de la columna vertebral no desapareciendo mientras que aún permanecen sujetos a fuertes fluctuaciones térmicas1. Por lo tanto, modelos puramente estocásticos no pueden aplicarse a sus comportamientos, al igual que con los extremos de los polímeros rígidos o totalmente flexibles. El supuesto gusano-como cadena modelo2,3,4 fue desarrollado para cuantificar esta rigidez por medio del lp, que es la constante de decaimiento de la correlación de tangente-tangente a lo largo de los filamentos4. Si lp es comparable a la longitud del contorno (lc) del filamento, el polímero se considera semiflexible1. Análogo a los polos de una tienda de campaña, sus arreglos en redes o en haces se estabiliza el sistema colectivo en fracciones de bajo volumen, a viscoelástica inusuales propiedades5,6,7, 8,9. Estas estructuras proporcionan tamaños10, manteniendo la integridad mecánica sigue facilitando la difusión y procesos de transporte activo de malla de alta elasticidad en general. Esta propiedad es especialmente conveniente para los sistemas biológicos como el citoesqueleto con la matriz extracelular, pero es también ampliamente utilizado en alimentos ingeniería1,11,12.

Va más allá de su importancia a la materia viva, es crucial examinar exhaustivamente las propiedades físicas de estas estructuras para poder tener las herramientas para desarrollar materiales biomiméticos o hidrogeles novela. En términos de polímeros semiflexible, esto implica la determinación sistemática de las propiedades colectivas de las redes resultantes de propiedades solo filamento como lp y el desarrollo de un marco teórico descriptivo. En estudios pioneros, la actina celular biopolímero se estableció como un sistema modelo para polímeros semiflexible y todavía es considerada como el estándar de oro5,13,14,15 , 16 , 17. sin embargo, estudios exhaustivos se limitan con este sistema ya que están limitados a las propiedades inherentes de esta proteína. Varios enfoques teóricos han destinado a la construcción de una descripción de los comportamientos mecánicos no triviales en el nivel del solo filamento y han provocado especialmente diferentes escala las predicciones para la dependencia del módulo del esquileo meseta elástico lineal, G 0 (es decir, la "elasticidad" de la red), con respecto a la concentración (c) y lp6,7,13,14, 15,18,19,20,21,22,23. Mientras que la escala de concentración es fácilmente accesible en experimentos con actinia-basado o en otros sistemas modelo y mientras que las predicciones teóricas han sido rigurosamente verificado13,16,24, 25, la escala con respecto a lp ha permanecido inaccesible experimentalmente. Esto, sin embargo, es una limitación importante, ya que lp es también una variable independiente que es la definición cantidad de polímeros semiflexible.

Esta limitación natural, central impuesta por fijo lp de la actina o de otros polímeros biológicamente derivados tales como colágeno ha sido recientemente resuelto mediante el empleo de tubos de ADN basada en azulejos, que son ajustables en sus propiedades mecánicas 9 , 26 , 27 , 28. ligeras variaciones en las arquitecturas de los tubos (por ejemplo, diferentes cantidades de ADN constituyen filamentos dentro del anillo de la unidad) producen distintos valores para lp, que puede evaluarse mediante microscopía de fluorescencia, analizando un tubo fluctuante o mediante la evaluación de las configuraciones de curvas de varios tubos adheridos, como se ha descrito anteriormente9,28. Estos análisis revelaron que lp valores de las poblaciones de tubo diferentes varían en más de un orden de magnitud y que técnicas de evaluación diferentes dan resultados consistentes9,28.

Sorprendentemente, la escala total de la meseta elástico lineal cortante módulo G0 con respecto a la concentración y lp se ha divulgado para ser incompatibles con los anteriores planteamientos teóricos 9, demostrando en particular mucho más fuerte que prevista dependencia lp. Estos resultados enfatizan el valor de un nuevo sistema modelo para estudiar las propiedades centrales de polímeros semiflexible. Empleando n-tubos de ADN hélice dramáticamente amplía el alcance de estas investigaciones. No sólo puede lp libremente variar sin cambiar la materia prima, sino la propia naturaleza programable del ADN permite el examen sistemático de elementos adicionales, tales como reticulaciones o procesos cinéticos de conmutación. Además, estos tubos son solubles en agua y, en contraste con la mayoría de las proteínas, estables en pH adecuado y condiciones iónicas durante varias semanas, sin degradación perceptible9.

A estos tubos, se utiliza un conjunto discreto de oligonucleótidos de ADN, que contiene dos dominios que comparten secuencias complementarias de base a los dos filamentos vecinos (debido a las secuencias específicas, un solo filamento no puede formar estructuras como horquillas para el cabello). Las secuencias complementarias hibridan de forma cíclica, formando anillos cerrados, superposición de mitad de segmentos helicoidales doble n interconectadas (figura 1A y B). Éstos forman anillos discretos de diámetro (figura 1), y su configuración de medio traslapo expone axiales extremos pegajosos complementarios a los extremos pegajosos de otro anillo. Esta adición selectiva de emparejar oligonucleótidos desencadena un apilamiento de los anillos, conduciendo a la polimerización efectiva de filamentosos tubos de hélice de ADN de tamaño n (nHT). Sus longitudes contornos miden típicamente varias micras de longitud, y su distribución de la longitud es comparable a la de actina filamentos9,26,27,28. Se ha demostrado para nanotubos de ADN similares que de hecho presentan cinética de polimerización similar a las de los microtúbulos y filamentos de actinaclase p = "xref" > 29. Según el número n de los filamentos de la DNA que componen la estructura básica del anillo, la arquitectura nHT, así como su circunferencia y diámetro, pueden controllably variar. Usando más hebras de ADN aumenta la circunferencia de los tubos de anillos, y el correspondiente cambio arquitectónico cambia las propiedades mecánicas a valores más altos dep l(figura 1), correspondiente a una rigidez más alta. En la escala mesoscópica, estos valores dep mayores de ltraducen en conformaciones menos doblados debido a la tiesura más alta (figura 1 y E).

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Protocolo

1. preparación de n HTs

Nota: aquí n denota el número de diferentes solos filamentos de ADN implicados en la formación de los tubos de la hélice de un cierto tamaño. Para n = 8, ocho diferentes cadenas simples de ADN conforman un anillo unidad.

  1. Secuencias de ADN de compra (grado de pureza HPLC o superior) de una adecuada síntesis de ADN del servicio o realizar síntesis de alta calidad y purificación (secuencias ejemplares dadas en la tabla 1).
  2. Oligonucleótidos liofilizado de resuspender en agua purificada y seguir la resuspensión más pasos dados en el manual correspondiente de la empresa. Ajustar la cantidad de agua para obtener una concentración final de 200 μm.
  3. Determinar las concentraciones de la sola DNA filamentos para verificar los valores indicados por el distribuidor (por ejemplo, mediante espectroscopía UV-Vis en 260 nanómetro) puesto que la estequiometría exacta es crucial para el proceso de montaje. Calcular la concentración de los oligonucleótidos, teniendo en cuenta el peso específico molar y el coeficiente de extinción para cada oligonucleótido de ADN monocatenario.
    Nota: Los valores del coeficiente de extinción inherentemente varían para las diferentes secuencias y figuran en la documentación de ADN adquirido comercialmente. También puede calcularse según el modelo de vecino más cercano con un número de herramientas libremente disponibles en línea. Para cumplir con la gama linear del espectrómetro, considerar la dilución de la muestra utilizada para la determinación de la concentración.
  4. Usando una micropipeta, mezcla de la DNA filamentos, cada uno en la misma concentración en un contenedor adecuado para el termociclador (por ejemplo, un tubo PCR de 200 μL) formar el deseado n HTs (condiciones de buffer final: 1xTE (10 mM Tris y 1 mM EDTA, pH 8) y 12.5 mM MgCl 2).
    Nota: Las muestras de ADN Final n HT consisten en n - 1 filamentos, U 1 − U n − 1 y una cadena de T n. La concentración por strand puede variar desde sub-micromolar a más de 10 μm, dependiendo de las necesidades del usuario (por ejemplo, < 1 μm por filamento para la dilución subsecuente observar filamentos individuales o concentraciones más altas para el examen de mecánicos de la red).
  5. Hibridar n HTs en un termociclador (desnaturalización durante 10 minutos a 90 ° C, con una posterior caída rápida a 65 ° C; temperatura lenta disminución de 65 ° C a 55 ° C, con base que se aparea complementarios en 20 pasos de la temperatura de-0,50 K por 30 min cada uno; y una rápida caída de 55 ° C a 20 ° C); Ver figura 2A.
    Nota: Los pasos del lento descenso de 65 ° C pueden ser alargados para aumentar la longitud del tubo promedio; sin embargo, la posterior caída rápida a 20 ° C es crucial para evitar la agregación de polimerizado tubos.
  6. Tienda la hibridizada n HTs hasta por 3 semanas a 4 ° C sin degradación perceptible.
    Nota: Para fluorescencia microscopía, etiquetado n HTs son hibridadas sustituyendo (en parte) U1 con el U1-Cy3 modificada (tabla 1). Por más tiempo de observación, es recomendable la adición de agentes anti blanqueo establecidos.
  7. Cuidadosamente diluir la muestra a la concentración final deseada (por ejemplo, 4 μm para redes o 20 nM para observaciones solo filamento) usando el tampón de muestra, si es necesario. Para minimizar las fuentes posibles de error, montar las muestras en la concentración final.

2. Reología del esquileo

  1. elegir una adecuada geometría (placa-placa o placa de cono) para el Reómetro de corte dinámico. Para volúmenes pequeños (es decir, por debajo de 200 μL), utilice la geometría cono-placa.
  2. Carga la muestra en el Reómetro de corte dinámico.
  3. Apaciguar la interfaz aire agua de la muestra y el medio ambiente mediante los siguientes pasos para prevenir posibles efectos de evaporación.
    1. Rodean la muestra con 2,5 mL del baño de tampón de muestra de.
    2. Añadir un surfactante justo debajo de la concentración micelar.
    3. Utilizar una jeringa Hamilton para rodear la muestra con un lípido para evitar el contacto directo de la muestra con aire a.
  4. Sellar la cámara de muestras con tapa equipada con esponjas mojadas y, si es posible, con un baño de agua (no en contacto con la muestra) a otros suprimir evaporación.
  5. Iniciar la medición utilizando el software específico de reómetro a temperatura ambiente, o bien, realizar la medición a diferentes temperaturas, como 37 ° C (si se necesitan condiciones fisiológicas).
    Nota: Refrigeración de la muestra es acompañada a menudo por la condensación del vapor de agua del aire circundante, mientras que la calefacción conduce a mayor evaporación. Ambos efectos incontrolable pueden cambiar la concentración de la muestra, así que todas las medidas en una serie deben realizarse a una temperatura constante.
  6. Permitir que la muestra se equilibren por 2 h a temperatura ambiente. El tiempo de evolución puede controlarse con un barrido de tiempo (datos de un punto por minuto; tensión γ = 5%; de frecuencia f = 1 Hz).
  7. Medir las propiedades mecánicas con los protocolos de prueba deseado. Comenzar con una serie de barridos de frecuencia (f-barre) porque deja la muestra intacta y permiten mediciones más.
    Nota: Adicionalmente, corta f-barridos deben ser realizada antes y después de las mediciones más larga (como largo f-barridos con una resolución mucho mayor) para verificar que la muestra permaneció sin cambios en el protocolo de medición completo.
    1. Realizar un corto f-barrido (por ejemplo, γ = 5%; f = 0,01 Hz a 30 Hz; 5 puntos por década).
    2. Realizar un largo f-barrido (por ejemplo, γ = 5%; f = 0,001 Hz a 30 Hz; 21 puntos de datos por década); el régimen de baja frecuencia puede omitirse si no es necesario para reducir el tiempo de medición.
    3. Realizar un corto f-barrido.
    4. Realizar un barrido de γ (e.g., f = 1 Hz; γ = 0.0125% a 100%; 20 puntos por década).
      Nota: Use el corta f - barrido en primer lugar, como es generalmente incompatible con el anterior f - barre porque redes generalmente la ruptura durante el barrido de γ o separan de las placas. Alternativamente, use γ-rampa (por ejemplo, = 0.025 s -1, t = 60 s); sin embargo, las rampas generalmente requieren cambiar el modo de motor, tan posterior corto f-barridos falsificó.
  8. Bin o liso los datos en bruto con un kernel gaussiano.

3. fluorescencia asistida por análisis de ADN del recocido

  1. 8 preparar alícuotas de 12 μl de cada muestra utilizando 1-4 μm manchas de ADN por filamento y 12.5 mM de MgCl 2 en 1 x buffer TE 1 x gel de ácido nucleico de un DMSO 10.000 x stock. Hacer un control negativo sin ADN, pero incluyen la mancha de gel de ácido nucleico.
  2. Transferencia de las alícuotas a una placa PCR en tiempo real y sellar con la película adhesiva (por ejemplo, una placa de 96 pocillos de reacción).
    Nota: Las temperaturas utilizadas en el térmico recocido protocolos evaporarán las muestras. Por lo tanto, asegúrese de que los pozos están sellados firmemente con la película adhesiva para evitar que el agua aumento de evaporación y concentración, especialmente en experimentos a largo plazo.
  3. Centrifugar la placa a 100 x g durante 1 min a temperatura ambiente para eliminar las burbujas de gas; si expandan las burbujas de gas, los pozos no pueden ser analizados.
  4. Cargar la placa de sellado en un sistema PCR cuantitativo en tiempo real.
  5. Ejecutar un programa de recocido. Desnaturalizar el ADN a 90 ° C durante 10 minutos colocar la temperatura rápidamente a 72 ° C. Luego, disminuir la temperatura lentamente de 0,5 ° C cada 30 minutos. Después de que la señal ha decaído, acelerar la rampa de temperatura.
    Nota: 72 ° C es lo suficientemente superior a la temperatura de hibridación real; así, la señal se registra en un rango de temperatura amplio adecuado para determinar el rango de temperatura necesario.
  6. Asegúrese de que la tapa de la cycler calienta a menos de 100 ° C para evitar la condensación de la muestra evaporada en la película adhesiva del.
  7. Durante el montaje, excitar las muestras con un láser de ion argón 488 nm y detectar la fluorescencia a 550 nm cuando se utiliza una tinción del gel de ácido nucleico (o espectralmente similares). Para los otros tintes, elegir una combinación adecuada de excitación/emisión. Medir la señal de fluorescencia tan a menudo como sea posible para aumentar el total utilizando la cámara integrada de la calidad de señal.
    Nota: Aquí, las mediciones se realizaron cada 9 s.
  8. Si se aplican la fusión preestablecida y recocido programas, utilice el software suministrado para analizar los datos. Si no, resta el anterior valor medio desde el valor medio para cada paso de la temperatura obtener el cambio relativo de la señal fluorescente.

4. Imágenes de AFM

  1. Cleave mica (por ejemplo, mica " V1 ") colocando cinta adhesiva disponible comercialmente y estafando; se debe retirar la capa superior de la mica.
  2. Usando una micropipeta, depósito forma n HT en Mg 2 + que contiene tampón plegable en la mica recién descamada y déjelo reposar 10 min.
  3. Girar las muestras en intervalos cortos 3-s a 2.000 x g en una centrífuga de mesa para quitar el líquido restante. Varios n HTs todavía debe fijarse a la superficie de la mica.
  4. Utilizar la punta de un voladizo con una alta rigidez (por ejemplo, 54 Nm -1) y determinar su frecuencia de resonancia con el software interno del AFM.
  5. Registro del perfil de altura con la AFM en el aire en modo tasas bajo análisis (por ejemplo, 1 línea/s) para evitar dañar o desplazar n HTS.

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Resultados

El montaje de nanotubos de ADN a través de una rampa de temperatura (figura 2) es un método muy confiable para formar estos polímeros artificiales semiflexible. Estos polímeros tienen características comparables a sus pares que ocurren naturalmente, como filamentos de actina, sino proporcionan un marco experimental mucho más amplio ya que sus propiedades mecánicas puede controllably alterado9,27 . Com...

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Discusión

Para obtener correctamente formadas redes, montaje de los nanotubos de ADN es un paso crucial. Errores durante el proceso de síntesis un impacto negativo en la calidad del tubo; por lo tanto, se recomienda usar HPLC o un proceso más riguroso para purificar los oligonucleótidos. Puesto que la formación de discretos en lugar de agregados nanotubos de ADN, así como su distribución de longitud, depende de la estequiometría equimolar de los oligonucleótidos constituyentes n dentro del conjunto, es necesario que vuelv...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Reconocemos financiación por DFG (1116/17-1) y la Facultad de Ciencias naturales de Leipzig "BuildMoNa" (SGC 185). Este trabajo ha sido apoyado a través del proyecto de Fraunhofer atraer 601 683. T. H. reconoce la financiación del Fondo Social Europeo (FSE-100077106).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
AFM voladizo ACTAAppNano
AFM - NanoWizard 3JPK Instruments
Cámara CCDAndoriXon DV887
DMSOSigma-AldrichD2650
Oligonucleótidos de ADNBiomers.netPara las secuencias, consulte la Tabla 1
ADN Oligonucleótidos marcados con Cy3Biomers.netPara la secuencia, consulte la tabla 1
EDTASigma-AldrichE-9884
Microscopio de epifluorescenciaLeicaDM-IRB
MgCl2Sigma-AldrichM-8266
Mica "V1", 12 mm redondoPlano GmbH50-12
MicroAmp® Placa de reacción óptica rápida de 96 pocillosThermo Fisher Scientific Inc.
MicroAmp® Película adhesiva ópticaThermo Fisher Scientific Inc.
Espectrofotómetro NanoDrop 1000Thermo Fisher Scientific Inc.
Objetivo 100xLeica5506168
Agua purificadaMerk Millipore - Milli-Q & Tubos
SapphireGreiner Bio-One683271
Termociclador de PCR estándar profesionalCore Life Sciences Inc.070- Estándar
7900HT Sistema de PCR rápido en tiempo realde 4351405Biosystems Applied Biosystems
TA InstrumentsARES
SYBR® Tinción de gel de ácido nucleico Green IThermo Fisher Scientific Inc.S7567
TrisSigma-AldrichT4661
Triton X-100Sigma-Aldrich Co.X-100Suprime la evaporación de la muestra en la interfaz aire-agua
43469074306311 de PCR Elix Reómetro de

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