Polímeros semiflexible mostrar propiedades mecánicas únicas que se aplican extensivamente por los sistemas de vida. Sin embargo, estudios sistemáticos sobre biopolímeros son limitados puesto que propiedades como la rigidez del polímero son inaccesibles. Este manuscrito describe cómo esta limitación es burlada por nanotubos de ADN programables, permitiendo estudios experimentales sobre los efectos de la rigidez del filamento.
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Artículo de método
Nanotubos de ADN como una herramienta versátil para el estudio de polímeros Semiflexible
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Resumen
Resumen
Propiedades mecánicas de la materia suave complejo, basados en polímeros, tales como células o redes de biopolímero, pueden entenderse en ninguno de los dos el marco clásico de polímeros flexibles ni de varillas rígidas. Filamentos subyacentes permanecen extendidos debido a su rigidez de columna vertebral no desaparece, que es cuantificada a través de la longitud de persistencia (lp), pero también están sujetos a fuertes fluctuaciones térmicas. Su rigidez de flexión finita conduce a la mecánica colectiva única, no trivial de redes a granel, lo que permite la formación de andamios estables en fracciones de volumen bajo mientras que proporciona los tamaños de malla grande. Este principio subyacente es frecuente en la naturaleza (por ejemplo, en células o tejidos), minimizando el alto contenido molecular y facilitando la difusión o transporte activo. Debido a sus implicaciones biológicas y potenciales aplicaciones tecnológicas en hidrogeles biocompatibles, semiflexible polímeros han sido objeto de considerable estudio. Sin embargo, investigaciones comprensibles seguía siendo difíciles desde que los polímeros naturales, tales como filamentos de actina, que no son libremente ajustables. A pesar de estas limitaciones y debido a la falta de polímeros sintéticos, mecánicamente ajustables y semiflexible, filamentos de actina se establecieron como el sistema de modelo común. Una limitación importante es que la cantidad central lp no puede ajustarse libremente para estudiar su impacto en las estructuras macroscópicas a granel. Esta limitación fue resuelto mediante el empleo de nanotubos de ADN estructuralmente programables, permitiendo la alteración controlada de la rigidez del filamento. Se forman a través de diseños de azulejos, donde un discreto conjunto de filamentos parcialmente complementarios hibridar en una estructura de anillo con una circunferencia de discreta. Estos anillos presentan extremos pegajosos, lo que permite la polimerización efectiva en filamentos de varias micras de longitud y mostrar la cinética de polimerización similar como biopolímeros naturales. Debido a su mecánica programable, estos tubos son herramientas versátiles, novela para estudiar el impacto de lp de la solo-molécula así como la escala mayor. En contraste con los filamentos de actina, permanecen estables durante semanas, sin notable degeneración, y su manejo es sencillo comparable.
Introducción
Debido a los comportamientos complejos habilitados por sus propiedades mecánicas únicas, polímeros semiflexible son bloques de construcción fundamentales de la materia viva. En contraste con los polímeros flexibles, semiflexible polímeros adoptan una configuración extendida debido a su rigidez de la columna vertebral no desapareciendo mientras que aún permanecen sujetos a fuertes fluctuaciones térmicas1. Por lo tanto, modelos puramente estocásticos no pueden aplicarse a sus comportamientos, al igual que con los extremos de los polímeros rígidos o totalmente flexibles. El supuesto gusano-como cadena modelo2,
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Protocolo
1. preparación de n HTs
Nota: aquí n denota el número de diferentes solos filamentos de ADN implicados en la formación de los tubos de la hélice de un cierto tamaño. Para n = 8, ocho diferentes cadenas simples de ADN conforman un anillo unidad.
- Secuencias de ADN de compra (grado de pureza HPLC o superior) de una adecuada síntesis de ADN del servicio o realizar síntesis de alta calidad y purificación (secuencias ejemplares dadas en la tabla 1).
- Oligonucleótidos liofilizado de resuspender en agua purificada y seguir la resuspensión más pasos dados en el manual correspondiente d....
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Resultados
El montaje de nanotubos de ADN a través de una rampa de temperatura (figura 2) es un método muy confiable para formar estos polímeros artificiales semiflexible. Estos polímeros tienen características comparables a sus pares que ocurren naturalmente, como filamentos de actina, sino proporcionan un marco experimental mucho más amplio ya que sus propiedades mecánicas puede controllably alterado9,27 . Com.......
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Discusión
Para obtener correctamente formadas redes, montaje de los nanotubos de ADN es un paso crucial. Errores durante el proceso de síntesis un impacto negativo en la calidad del tubo; por lo tanto, se recomienda usar HPLC o un proceso más riguroso para purificar los oligonucleótidos. Puesto que la formación de discretos en lugar de agregados nanotubos de ADN, así como su distribución de longitud, depende de la estequiometría equimolar de los oligonucleótidos constituyentes n dentro del conjunto, es necesario que vuelv.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Reconocemos financiación por DFG (1116/17-1) y la Facultad de Ciencias naturales de Leipzig "BuildMoNa" (SGC 185). Este trabajo ha sido apoyado a través del proyecto de Fraunhofer atraer 601 683. T. H. reconoce la financiación del Fondo Social Europeo (FSE-100077106).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| AFM voladizo ACTA | AppNano | ||
| AFM - NanoWizard 3 | JPK Instruments | ||
| Cámara CCD | Andor | iXon DV887 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Oligonucleótidos de ADN | Biomers.net | Para las secuencias, consulte la Tabla 1 | |
| ADN Oligonucleótidos marcados con Cy3 | Biomers.net | Para la secuencia, consulte la tabla 1 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E-9884 | |
| Microscopio de epifluorescencia | Leica | DM-IRB | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M-8266 | |
| Mica "V1", 12 mm redondo | Plano GmbH | 50-12 | |
| MicroAmp® Placa de reacción óptica rápida de 96 pocillos | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| MicroAmp® Película adhesiva óptica | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Espectrofotómetro NanoDrop 1000 | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Objetivo 100x | Leica5 | 506168 | |
| Agua purificada | Merk Millipore - Milli-Q & Tubos | ||
| Sapphire | Greiner Bio-One | 683271 | |
| Termociclador de PCR estándar profesional | Core Life Sciences Inc. | 070- Estándar | |
| 7900HT Sistema de PCR rápido en tiempo real | de 4351405 | Biosystems Applied Biosystems | |
| TA Instruments | ARES | ||
| SYBR® Tinción de gel de ácido nucleico Green I | Thermo Fisher Scientific Inc. | S7567 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | T4661 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich Co. | X-100 | Suprime la evaporación de la muestra en la interfaz aire-agua |
Referencias
- Huber, F., et al. Emergent complexity of the cytoskeleton: from single filaments to tissue. Adv Phys. 62 (1), 1-112 (2013).
- Kratky, O., Porod, G. Röntgenuntersuchung gelöster Fadenmoleküle. Recl Trav Chim Pays-Bas. 68 (12), 1106-1122 (1949).
- Saitô, N., Takahashi, K., Yunoki, Y.
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Reimpresiones y permisos
