Determinación del contenido de glucógeno en las cianobacterias

Resumen

Aquí, presentamos un ensayo fiable y fácil para medir el contenido de glucógeno en células de cianobacterias. El procedimiento implica precipitación, despolimerización seleccionable y la detección de residuos de glucosa. Este método es adecuado para cepas de tipo salvaje y genéticamente modificadas y puede facilitar la ingeniería metabólica de las cianobacterias.

Resumen

Las cianobacterias acumulan glucógeno como almacenamiento intracelular de carbono y energía durante la fotosíntesis. Los recientes avances en la investigación han puesto de relieve los complejos mecanismos del metabolismo del glucógeno, incluyendo el ciclo diel de biosíntesis y catabolismo, la regulación redox, y la participación de ARN no codificante. Al mismo tiempo, se están haciendo esfuerzos para redirigir el carbono del glicógeno a productos deseables en cianobacterias modificadas genéticamente para mejorar los rendimientos del producto. Se utilizan varios métodos para determinar los contenidos de glucógeno en las cianobacterias, con precisión variable y complejidades técnicas. Aquí, proporcionamos un protocolo detallado para la determinación fiable del contenido de glucógeno en cianobacterias que se puede realizar en un laboratorio estándar de ciencias de la vida. El protocolo implica la precipitación selectiva de glicógeno a partir del lisado celular y la despolimerización enzimática de glucógeno para generar monómeros de glucosa, que son detectados por un buey de glucosaIdase-peroxidasa (GOD-POD). El método se ha aplicado a Synechocystis sp. PCC 6803 y Synechococcus sp. PCC 7002, dos especies de cianobacterias modelo que se utilizan ampliamente en la ingeniería metabólica. Además, el método mostró con éxito diferencias en los contenidos de glucógeno entre el tipo salvaje y mutantes defectuosos en elementos reguladores o genes biosintéticos de glicógeno.

Introducción

Las cianobacterias se acumulan glucógeno como el principal almacén de carbohidratos de carbono de CO ₂ fijado a la luz a través de la fotosíntesis. El glucógeno es un glicano que consiste en glucano enlazado con α-1,4 lineal con ramificaciones creadas por enlaces glucosilo unidos por α-1,6. La biosíntesis de glicógeno en cianobacterias comienza con la conversión de glucosa-6-fosfato en ADP-glucosa a través de la acción secuencial de fosfoglucomutasa y ADP-glucosa pirofosforilasa. El resto de glucosa en ADP-glucosa se transfiere al extremo no reductor del esqueleto de α-1,4-glucano de glucógeno por una o más glucógeno sintasas (GlgA). Posteriormente, las en....

Protocolo

1. Preparación

1. Cultivos de cianobacterias
   1. Cultivar Synechocystis sp. PCC 6803 a 30 ° C en medio BG11 líquido ⁸ , con un suministro constante de aire suplementado con CO _{2 al} 1% (v / v). Iluminar los cultivos continuamente con luz a una densidad de flujo de fotones fotosintéticos de 50 μmol fotón / m ² / s.
   2. Cultivar Synechococcus sp. PCC 7002 en medio A + líquido ²³ (se puede utilizar también medio BG11), con un suministro constante de aire suplementado con CO _{2 al} 1% (v / v). La temperatura debe ser de 37 ° C. Iluminar los ....

Resultados

Se añadieron 10 ml de Synechocystis sp. Se cultivaron PCC 6803 en condiciones fotoautótrofas hasta que el valor de DO _730nm alcanzó aproximadamente 0,8. Las células se recogieron y se resuspendieron en Tris-HCl 50 mM, pH 8. El valor de DO _730nm se ajustó a 2-3. El contenido de glucógeno se analizó siguiendo el protocolo descrito anteriormente. El contenido de glucógeno por la OD _730nm fue de 13 ± 1,8 μg / mL / OD _730nm ( N = 1.......

Discusión

Los pasos críticos dentro del protocolo son la precipitación del glucógeno y la resuspensión. Después de la centrifugación después de la precipitación con etanol, el glucógeno forma una pastilla translúcida que se adhiere flojamente a las paredes de los tubos de microcentrífuga. Por lo tanto, cuando se retira el sobrenadante, se debe prestar especial atención para no quitar el gránulo. El gránulo de glucógeno es pegajoso, y la solubilización puede ser difícil si se seca. Obsérvese que la solubilización completa del grán.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
QSonica Sonicators Q700	Qsonica, LLC	NA	QSonica
SpectraMax 190 Lector de microplacas	Molecular Devices	NA	Eliza
Bullet Blender Storm Next	Advance	BBY24M-CE	Batidor de perlas
Ultrospec 3100 pro Espectrofotómetro UV/Visible	Amersham Biosciences	NA	Espectrofotómetro
Tris	Sigma-Aldrich	T1503	Tampón
HCl	Merck	1-00317	Adecuación de
pH Acetato de sodio	Sigma-Aldrich	32319	Tampón
Amicoglicosidasa (Rhizopus sp.)	Megazyme	E-AMGPU	Enzima para la despolimerización de glucógeno
&alfa;-amilasa, termoestable (Bacillus licheniformis)	Sigma-Aldrich	A3176	Enzima para la despolimerización de glucógeno
D-Glucosa	Merch	8337	Estándar para el ensayo de glucosa
Pierce BCA Protein kit de ensayo	Thermo Fisher scientific	23225	Para la determinación de concentraciones de proteínas
Bandejas de secado de aluminio, desechables	VWR	611-1362	Para la determinación del peso seco de las células Kit de
ensayo D-Glucosa (formato GODPOD)	Megazyme	K-GLUC	Para la determinación de las concentraciones de glucosa
Panes de óxido de circonio, 0,15 mm	Siguiente Advance	ZrOB015	Perlas para la lisis celular en un Tubos Bullet Blendar Storm
RINO Next	Advance	NA	Tubos para lisis celular en un Bullet Blendar Storm

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