Nanosponge afinabilidad de tamaño y densidad de entrecruzamiento

Resumen

Este artículo describe un proceso para ajustar la densidad tamaño y reticulación de covalente reticulado nanopartículas de poliésteres lineales que contienen funcionalidad colgante. Por adaptación de parámetros de síntesis (peso molecular de polímero, incorporación de funcionalidad colgante y crosslinker equivalentes), se logra una densidad de tamaño y reticulación deseado nanopartículas para solicitudes de entrega de medicamentos.

Resumen

Se describe un protocolo para la síntesis de poliésteres lineales que contienen funcionalidad epóxido de colgante y su incorporación a un nanosponge con dimensiones controladas. Este enfoque comienza con la síntesis de una lactona funcionalizada que es clave para la funcionalización del colgante del polímero resultante. Valerolactone (VL) y alílico-valerolactone (AVL) son copolymerized entonces mediante la polimerización de la anillo-abertura. Modificación después de la polimerización entonces se utiliza para instalar un grupo epóxido en algunos o todos los grupos alilo de colgante. Química de epoxy-amina se emplea en forma de nanopartículas en una solución diluida de polímeros y pequeñas moléculas diamina crosslinker basado en la densidad deseada de nanosponge tamaño y reticulación. Tamaños de Nanosponge se caracteriza por la transmisión imágenes de microscopía electrónica (TEM) para determinar la dimensión y distribución. Este método proporciona un camino por el cual poliéster altamente armonioso puede crear nanopartículas sintonizables, que pueden ser utilizadas para la encapsulación de fármacos de molécula pequeña. Debido a la naturaleza de la columna vertebral, estas partículas son hidrolítico y enzimáticamente degradables para una liberación controlada de una amplia gama de pequeñas moléculas hidrofóbicas.

Introducción

Precisamente, ajuste la densidad tamaño y reticulación de nanopartículas basadas en la reticulación intermolecular es de gran importancia para influir y orientar el perfil de liberación de fármaco de estos nanosistemas¹. Diseño afinabilidad de nanosponge, es decir, preparación de partículas de densidad de red diferente, es dependiente sobre la funcionalidad del colgante del polímero precursor y los equivalentes del crosslinker hidrofílico incorporado. En este enfoque, la concentración de los precursores y el crosslinker en el solvente es importante forma de nanopartículas de un tamaño discreto, en lugar de un gel a granel. Utilizando espectroscopia cuantitativa de resonancia magnética nuclear (RMN) como una técnica de caracterización permite la determinación precisa de funcionalidad incorporado colgante y peso molecular de polímero. Una vez que las nanopartículas se forman, pueden ser concentrados y solubilizados en materia orgánica sin tener el carácter de un nanogel.

Trabajo reciente en el suministro de medicamentos nanopartículas se ha centrado en el uso de poli (láctico-co-ácido glicólico) (PLGA) montado por nanopartículas^2,3,4,5,6. EGLP tiene vínculos éster degradable que hacen conveniente para aplicaciones de suministro de drogas y se combina a menudo con poly(ethylene glycol) (PEG) debido a sus propiedades stealth⁷. Sin embargo, debido a la naturaleza uno mismo-montada de la formación de partículas PLGA, las partículas no solubilizadas en materia orgánica para otros funcionalización. En contraste con nanopartículas PLGA, el método propuesto proporciona reticulación covalente formando una nanopartícula con tamaños definidos y morfología, que son estables en materia orgánica y degradan en soluciones acuosas¹. Ventajas de este enfoque son la capacidad más funcionalizar químicamente la superficie de la nanosponge⁸, y su estabilidad en solventes orgánicos puede ser utilizado para la posterior carga de las partículas con compuestos farmacéuticos^1,9. Con este método, encapsulación de pequeñas moléculas hidrofóbicas se logra por precipitación en medios acuosos. La hidrofobicidad de la columna vertebral poliéster junto con el crosslinker corto hidrofílico le da a estas partículas un carácter amorfo a la temperatura corporal. Además, después del cargamento de droga, las partículas pueden formar suspensiones finas en medios acuosos para ser fácilmente inyectados en vivo. Es nuestro objetivo en este trabajo para evaluar los parámetros de la síntesis de estos nanosponges poliéster y determinarlos que son de vital importancia para el diseño y control de tamaño y morfología.

Protocolo

1. Síntesis y caracterización de AVL

1. Coloque una barra agitadora magnética dentro de un matraz de fondo redondo de 500 mL de 2 cuellos (matraz 1) y selle con un tabique de goma del tamaño adecuado y alambre de acero. Seque el matraz con llama para eliminar la humedad mediante la purga con gas nitrógeno conectado a través de una aguja de entrada y una aguja de salida abierta en el tabique, mientras usa un soplete de llama de butano para calentar suavemente el exterior del matraz moviendo la llama a lo largo de la superficie.
   1. Continúe calentando todo el matraz pasando la llama por la superficie hasta que no se vea la humedad que enturbia el interior del matraz. Retire la llama y deje que el matraz se enfríe a temperatura ambiente mientras continúa el flujo de nitrógeno durante toda la reacción.
2. Añada 156,25 mL de tetrahidrofurano anhidro (THF) a través de una jeringa de 30 mL al matraz 1. Enfriar el matraz de 1 a -78 °C con un baño de hielo seco/acetona. Controle la temperatura con un termómetro durante toda la reacción y agregue hielo seco según sea necesario para mantener -78 °C. Comience a agitar la barra de agitación magnética usando una placa de agitación magnética para crear un vórtice suave.
3. Añadir N,N-diisopropiletilamina (DIPA) (3,30 mL, 2,3 x ^10-2 mol) a través de una jeringa de 5 mL, seguido de la adición gota a gota de 2,5 M de n-butilitio (9,34 mL, 2,3 x ^10-2 mol) a través de una jeringa de vidrio de 10 mL equipada con un mecanismo de bloqueo de la aguja y una aguja metálica al matraz 1. Continúe agitando con una placa de agitación magnética durante 15 minutos a -78 °C.
4. Secar a la llama (como se describe en el paso 1.1) y purgar con gas argón (como se describe en el paso 1.1 con gas nitrógeno) un matraz de fondo redondo de 100 mL (matraz 2). Retire la entrada y salida de gas argón al mismo tiempo una vez que el matraz esté lo suficientemente frío como para tocarlo. Añadir 56 mL de THF anhidro a través de una jeringa de 30 mL y δ-valerolactona (VL) (1,97 mL, 2,1 x ^10-2 mol) a través de una jeringa de 5 mL.
5. Agregue la solución en el matraz 2 al matraz 1 a través de una cánula pequeña gota a gota durante 45 minutos mientras agita continuamente a través de una barra de agitación magnética. Una vez que el matraz 2 esté vacío, retire la cánula y deje que el matraz 1 continúe agitando durante 15 minutos a -78 °C.
6. Secar a la llama (como se describe en el paso 1.1) y purgar con gas argón (como se describe en el paso 1.1 con gas nitrógeno) un matraz de fondo redondo de 25 mL (matraz 3). Retire la entrada y salida de gas argón al mismo tiempo una vez que el matraz esté lo suficientemente frío como para tocarlo, para mantener una presión positiva dentro del matraz. Añada bromuro aliado (2,02 mL, 2,3 x ^10-2 mol) y hexametimosferamida (HMPA) (4,43 mL, 2,5 x ^10-2 mol) cada uno a través de una jeringa de 5 mL.
7. Agregue el matraz 3 al matraz 1 a través de una cánula pequeña gota a gota. Una vez que el matraz 3 esté vacío, retire la cánula.
   1. Retire la mayor cantidad posible de hielo seco y acetona fría del baño de hielo seco/acetona en el que se sumerge el matraz 1 con una cuchara y un vaso de plástico. Reemplácelo con acetona a temperatura ambiente para elevar el baño a -40 °C y deje que el matraz 1 continúe revolviendo durante 2 h mientras controla la temperatura. Si la temperatura aumenta por encima de -40 °C, agregue unos trozos de hielo seco para enfriar la acetona.
   2. Calentar a -10 °C eliminando la acetona fría y el hielo seco y sustituirlo por acetona a temperatura ambiente.
8. Retire el tabique del matraz 1 y apague la reacción con una solución de cloruro de amonio saturada de 150 ml mientras agita a través de una barra de agitación magnética. Coloque el matraz 1 en un congelador a -20 °C durante la noche para su almacenamiento.
9. Retire el matraz 1 del congelador y deje que se caliente a temperatura ambiente. Vierta la solución del matraz 1 en un embudo separador de 500 ml.
10. Agregue 50 ml de diclorometano (DCM), tape el embudo separador y balancee suavemente para mezclar el DCM y la mezcla acuosa / THF para extraer el producto en la capa orgánica. Recoja la capa orgánica en un vaso de precipitados de 500 ml que contenga una barra de agitación magnética del tamaño adecuado abriendo la llave de paso del embudo separador y reserve. Repita dos veces.
11. Recoja todos los compuestos orgánicos en el mismo vaso de precipitados y revuelva sobre el sulfato de magnesio (para eliminar el agua residual) con una placa de agitación magnética hasta que el sulfato de magnesio ya no se aglomere cuando se agregue a la solución. Deseche los residuos acuosos.
12. Retire el sólido de sulfato de magnesio de la solución del producto orgánico utilizando un papel de filtro dentro de un embudo de vidrio y recoja los orgánicos en un matraz de fondo redondo de 250 mL. Enjuague el papel de filtro y el sulfato de magnesio sólido con el exceso de DCM para asegurarse de que se recoja todo el producto.
13. Eliminar el disolvente del producto por evaporación rotativa mientras se calienta a 30 °C y utiliza un aspirador de agua como fuente de vacío.
14. Purificar el producto crudo por cromatografía en columna¹⁰ utilizando un gel de sílice como fase estacionaria y eluyendo comenzando con un 3% de acetato de etilo/hexanos para un volumen de 1 columna (CV), aumentando el gradiente a un 29% de acetato de etilo/hexanos en 5 CVs. Recoger las fracciones en tubos de vidrio de borosilicato^{de 16} x 150 mm.
15. Realice la cromatografía en capa fina utilizando acetato de etilo/hexanos al 20% como eluyente para determinar las fracciones del producto.
16. Combine todas las fracciones del producto en un matraz de fondo redondo de tamaño adecuado y elimine el disolvente mediante evaporación rotativa a 40 °C. Transfiera a un vial de producto prepesado y colóquelo bajo un alto vacío a 0,05 torr para obtener AVL puro. Caracterice el producto por ¹H NMR¹¹ (CDCl₃, 400 MHz): δ 5.75 (m, 1H), 5.06 (m, 2H), 4.26 (m, 2H), 2.54 (m, 3H), 2.28 (m, 1H), 2.03 (m, 1H), 1.87 (m, 1H), 1.54 (m, 1H). Rendimiento: 2,07 g (70,56%).

2. Síntesis y caracterización de VL- co- AVL

1. Secar a la llama y purgar con gas nitrógeno un matraz de fondo redondo de 25 mL equipado con una barra de agitación magnética y tabique.
   1. Seque el matraz con llama para eliminar la humedad mediante la purga con gas nitrógeno conectado a través de una aguja de entrada y una aguja de salida abierta en el tabique, mientras usa un soplete de llama de butano para calentar suavemente el exterior del matraz moviendo la llama a lo largo de la superficie.
   2. Continúe calentando todo el matraz pasando la llama por la superficie hasta que no se vea la humedad que enturbia el interior del matraz. Retire la llama y deje que el matraz se enfríe a temperatura ambiente mientras continúa el flujo de nitrógeno durante toda la reacción.
2. Retire rápidamente el tabique del fondo redondo y agregue triflato de estaño (II) (2,5 mg, 5,9 x ^10-6 mol) al fondo del matraz con una espátula. Reemplace el tabique.
3. Añadir 3-metil-1-butanol (72,6 μL, 6,6 x ^10-3 mol) a través de una microjeringa de 100 μL y 1,33 mL de DCM anhidro a través de una jeringa de 2 mL secuencialmente. Revuelva a través de una placa de agitación magnética durante 10 minutos.
4. Añada AVL (0,48 mL, 3,7 x ^10-3 mol) y VL (1,37 mL, 1,4 x ^10-2 mol) secuencialmente a través de una jeringa. Deje que continúe revolviendo durante 18 - 20 h.
   NOTA: El porcentaje de AVL y VL en el copolímero final puede modificarse mediante estequiometría en este paso.
5. Apague la reacción agregando ~ 5 mL de metanol (MeOH). Agregue ~ 100 mg de eliminador de estaño de soporte sólido y revuelva durante 2 h. Filtrado por filtración por gravedad para eliminar el sólido.
6. Elimine el disolvente bajo evaporación rotativa con un aspirador de agua como fuente de vacío mientras se calienta a 30 °C hasta que la solución sea viscosa. Precipite la solución gota a gota en 500 mL de MeOH frío (enfriado con hielo seco durante al menos 1 h) para producir escamas de sólido blanco. Filtre la solución por filtración al vacío en un embudo que contenga un disco de vidrio fritado con papel de filtro para recoger el sólido.
   NOTA: Si la precipitación produce un sobrenadante turbio o un polvo fino que atraviesa el papel de filtro, entonces la solución del producto está demasiado diluida. Todo el disolvente sobrenadante debe eliminarse por evaporación rotativa con un aspirador de agua como fuente de vacío mientras se calienta a 30 °C hasta que la solución sea viscosa y luego se debe realizar la precipitación nuevamente.
7. Transfiera el producto sólido a un vial previamente pesado a través de una espátula y seque durante la noche a alta presión de vacío de 0,05 torr para recoger el sólido blanco y escamoso.
8. Caracterice el polímero por ¹H NMR¹¹ (CDCl₃, 400 MHz): δ 5.71 (m, 1H), 5.03 (t, 2H), 4.08 (m, 4H), 3.65 (t, 2H), 2.15 - 2.50 (m, 5H), 1.47-1.78 (m, 9H), 0.91 (d, 6H). 81,42% VL, 18,58% AVL, 2.940 g/mol, 578 g/mol unidad de repetición de AVL. Rendimiento: 1,43 g, (73,43%).

3. Epoxidación post-polimerización para producir unidades de copolímero epoxi-valerolactona (EVL)

1. Agregue el copolímero VL-co-AVL (500 mg, 1,7 x ^10-4 mol, 2.940 g/mol) a un vial de 6 dram con una barra agitadora magnética. Agregue 6,15 mL de DCM anhidro al vial y al vórtice para solubilizar el polímero.
2. Agregue ácido metaclorooperoxibenzoico (mCPBA) (74,53 mg, 4,3 x ^10-4 mol) a un segundo vial de 6 dram. Agregue 6.15 mL de DCM anhidro y vórtice hasta que el mCPBA esté completamente solubilizado.
   NOTA: La relación de conversión de alilos a epóxidos se puede variar alterando la estequiometría en este paso. La concentración final de alilo en el disolvente debe ser de 0,065 M.
3. Transfiera la solución mCPBA a la solución VL-AVL. Tape la reacción y cúbrala con una película plástica de parafina. Dejar remover durante 48 h.
4. Transfiera la mezcla de reacción a un embudo separador de 50 mL. Agregue 15 ml de bicarbonato de sodio saturado, tape el embudo separador y mueva suavemente para mezclar. Recoja la capa orgánica que contiene el producto en un matraz Erlenmeyer de 50 ml con una barra agitadora magnética (matraz de producto) de tamaño adecuado.
   1. Agregue 5 mL de DCM a la capa acuosa que aún está en el embudo de separación, tapone y luego balancee suavemente. Recoja los productos orgánicos en el matraz de producto. Deseche los residuos acuosos. Transfiera la capa orgánica nuevamente a un embudo separador. Repita este lavado acuoso dos veces.
5. Agregue sulfato de magnesio (para eliminar el agua residual) al matraz del producto mientras revuelve sobre una placa de agitación magnética. Continúe agregando cucharadas pequeñas de sulfato de magnesio hasta que ya no se aglomere al agregarlo. Utilice un embudo de vidrio equipado con un papel de filtro para eliminar el sulfato de magnesio sólido mientras transfiere la mezcla a un matraz de fondo redondo de 50 ml.
6. Eliminar el disolvente por evaporación rotativa con un aspirador de agua como fuente de vacío y calentar a 25 °C. Transfiera el contenido del matraz de fondo redondo a un vial de producto previamente pesado y elimine el disolvente por evaporación rotativa. Coloque en alto vacío a 0.05 torr durante la noche para producir un sólido blanco y ceroso.
7. Caracterizado por ¹H RMN¹¹ (CDCl₃, 400 MHz): δ 5.71 (m, 1H), 5.03 (t, 2H), 4.08 (m, 4H), 3.65 (t, 2H), 2.94 (d, 1H), 2.90 (s, 1H), 2.74 (s, 1H), 2.15-2.50 (m, 5H), 1.47-1.78 (m, 9H), 0.92 (d, 6H). 84,53% VL, 9,65% AVL, 5,82% EVL, 2,855 g/mol, 1,841 g/mol unidad de repetición de EVL. Rendimiento: 417,3 mg, (83,46%).

4. Síntesis y caracterización de nanoesponjas

1. Disuelva el polímero VL-co-AVL-co-EVL (200 mg, 7,0 x ^10-5 mol, 2.855 g/mol) en 20,01 mL de DCM anhidro para una concentración de epóxido de 0,0054 M. Transfiera a un matraz de fondo redondo de 100 mL con un cuello de 14/20.
   NOTA: Para catalizar la reacción, se pueden agregar 100 μL de bicarbonato de sodio saturado acuoso en este paso.
2. Colocar el matraz de reacción en un baño de aceite a 50 °C. Agitar la solución con un vórtice rápido y añadir 2,2'-(etilendioxi)bis(etilamina) (21,45 μL, 2,9 ^10-4 mol) a través de una microjeringa gota a gota. Coloque el cuello del matraz con un condensador encamisado de agua con agua fría que fluya a través de él, equipado con un adaptador de cuello 14/20, y reflujo la solución durante 12 h. Asegúrese de que haya un sellado muy hermético entre el cuello del matraz y el condensador para evitar la evaporación del disolvente.
3. Eliminar el exceso de disolvente del matraz de reacción por evaporación rotativa a 25 °C hasta obtener una solución viscosa.
4. Coloque una barra magnética grande en un vaso de precipitados de 2 L. Corte una sección de aproximadamente seis pulgadas de tubo de diálisis de corte de peso molecular (MWCO) de 10 K y doble un extremo y luego ciérrelo con un clip de diálisis.
   1. Transfiera el producto a un tubo de diálisis MWCO de 10 K. Enjuague el matraz con el exceso de DCM y transfiéralo al tubo. Doble la parte superior del tubo y ciérrelo con un clip de diálisis que tenga un alambre para colgarlo. Cuelgue el tubo de diálisis en el costado del vaso de precipitados con el alambre y llene el vaso de precipitados con DCM hasta que el tubo de diálisis esté completamente sumergido.
   2. Coloque en una placa magnética para remover y revuelva suavemente. Cubra el vaso de precipitados con papel de aluminio para evitar la evaporación del disolvente. Retire el disolvente vertiéndolo en un contenedor de residuos y sustitúyalo por DCM nuevo tres veces al día durante 48 h para eliminar el polímero y el reticulante sin reaccionar
   .
5. Retire todo el disolvente del vaso de precipitados y transfiera el contenido del tubo de diálisis a una jeringa de 10 ml provista de un filtro de jeringa de politetrafluoroetileno (PTFE) de 0,45 μm. Empuje la solución a través del filtro directamente a un vial de producto previamente pesado para eliminar las impurezas restantes. Retire el disolvente por evaporación rotativa a 25 °C, luego colóquelo en alto vacío a 0,05 torr durante la noche para recoger el sólido ceroso de color amarillo claro.
6. Caracterizado por ¹H RMN¹¹ (CDCl₃, 400 MHz): δ 5,71 (m, 1H), 5,03 (t, 2H), 4,08 (m, 4H), 3,60-3,67 (t, 14H), 2,94 (d, 1H), 2,90 (s, 1H), 2,74 (s, 1H), 2,15-2,50 (m, 5H), 1,47-1,78 (m, 9H), 0,92 (d, 6H). Rendimiento: 176,9 mg (88,45%).

5. Imágenes TEM de la morfología y el tamaño de la nanoesponja

1. Filtre 5 mL de agua de cultivo celular a través de un filtro de jeringa de PTFE de 0,2 μm.
2. Coloque nanoesponjas de 0,5 mg en un tubo de centrífuga de 1,5 ml. Agregue 1 mL de agua de cultivo celular filtrada. Utilice un sonicador de sonda (20 kHz, 40 a) para sonicar la solución con ráfagas de 2 s 4 a 5 veces a temperatura ambiente hasta que las partículas hayan desarrollado una suspensión fina. No utilice la sonicación prolongada ni deje que la solución se caliente, ya que esto provocará la agregación.
3. Añadir 30 mg de hidrato de ácido fosfotúngstico (PTA) a 1 mL de agua de cultivo celular filtrada en un tubo de centrífuga de 1,5 mL. Vórtice en la configuración más alta durante 10 s o hasta que el PTA esté completamente solubilizado para producir una solución de PTA al 3%.
4. Utilice una jeringa de 1 mL con aguja de 22 G para extraer 0,5 mL de solución de PTA al 3%. Agregue 4 gotas de la solución de PTA al 3% a las partículas y al vórtice en la configuración más alta durante 10 s. Use un par de pinzas de cierre automático para recoger una rejilla TEM y luego sumérjala en la solución de partículas rápidamente, tres veces. Deje que la rejilla se seque durante 5 h bajo una cubierta para reducir la acumulación de polvo en la rejilla.
5. Realice imágenes TEM¹² de la muestra utilizando alto contraste y un objetivo de 40 μm.

Resultados

Para evaluar la relación entre los parámetros de síntesis de la nanosponge y su tamaño resultante, es importante la concentración y colgante de funcionalidad de cada precursor de polímero. En la figura 1, se lleva a cabo un esquema de successfulsynthetic de nanosponges bajo condiciones de reflujo tras incorporar ambos crosslinker de diamina y el polímero precursor en DCM de 12 h. La concentración de epóxidos en la solución también es fundamental a la formació...

Discusión

Obtener medidas reproducibles nanosponge es vital en aplicaciones de suministro de drogas. Varios parámetros en la síntesis de polimerización y nanosponge afectan el tamaño y reticulación de la densidad de la partícula resultante. Tres parámetros importantes fueron identificados en nuestro análisis: peso molecular de polímero, epóxido colgante funcionalidad y crosslinker equivalentes. Para producir una gama de pesos moleculares y funciones epóxido para síntesis de nanosponge, debe modificarse la estequiometría de la VL -...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
2,2'-(etilendioxi)bis(etilamina)	Sigma-Aldrich	385506-100ML
3-metil-1-butanol	Sigma-Aldrich	309435-100ML	anhidro, ≥ 99%
Acetona	Sigma-Aldrich	179124-4L
Bromuro de alilo	Sigma-Aldrich	A29585-5G	≥
Cloruro de amonio	Fisher Scientific	A661-500	solución saturada en agua desionizada
Agua de cultivo celular	Sigma-Aldrich	W3500-500ML	Filtrada a través de 0,45 μ m filtro de jeringa
Diclorometano (DCM)	Sigma-Aldrich	270997-100ML	anhidro, ≥ 99%, contiene 40 - 150 ppm de amileno como estabilizador
Acetato de etilo	Fisher Scientific	E145SK-4
EZFlow 0.2 μ m Filtro de jeringa	Foxx Life Sciences	386-2116-OEM	PTFE hidrófilo, 13 mm
EZFlow 0.45 μ m Filtro de jeringa	Foxx Life Sciences	386-3126-OEM	PTFE hidrófilo, 25 mm
Tubos de ensayo de vidrio de borosilicato desechables Fisherbrand con extremo liso	Fisher Scientific	14-961-31
Tubos de microcentrífuga Fisherbrand	Fisher Scientific	14-666-318	1,5 mL
Jeringa de microlitro Hamilton, 100 μ L	Hamilton Company	80600	Modelo 710 N SYR, NDL cementado, calibre 22s, 2 pulgadas, estilo punta 2
Hexametilfosforamida	Sigma-Aldrich	H11602-100G	≥ 99%, contiene ≤ 1.000 ppm de óxido de propileno como estabilizador
Hexanes	Fisher Scientific	H292-4
Sulfato de magnesio anhidro	Fisher Scientific	M65-500
Ácido meta-clorooperoxibenzoico	Sigma-Aldrich	273031-100G	Purificado a ≥ 99% por lavado tampón
Metanol (MeOH)	Sigma-Aldrich	322415-100ML	anhidro, ≥ Solución
N-butillitio	Sigma-Aldrich	230707-100ML	2.5 M en hexanos
N,N-diisopropiletilamina	Sigma-Aldrich	550043-500ML	≥ 99%
Parafilm M	Sigma-Aldrich	P7793-1EA
Pinzas PELCO Pro Reverse (Autocierre)	Ted Pella, Inc.	5375-NM
Hidrato de ácido fosfotúngstico	Alfa Aesar	40116
Q55 Sonicator	Qsonica	Q55-110	55 vatios, 20 kHz
SiliaMetS Cysteine	Silicycle	R80530B-10g
Clips de diálisis SnakeSkin Thermo	Scientific	68011
Tubo de diálisis SnakeSkin, 10K MWCO	Thermo Scientific	68100
Bicarbonato de sodio	Fisher Scientific	5233-500	solución saturada en agua desionizada
Rejilla TEM Ted	Pella, Inc.	01822-F	Carbono ultrafino tipo A, malla 400, cobre, tamaño aproximado del orificio de la rejilla: 42 y micro; m
Tetrahidrofurano (THF)	Sigma-Aldrich	401757-1L	Anhidro, ≥ 99,9%, sin inhibidores
Trifluorometanosulfonato de estaño (II)	Sigma-Aldrich	388122-1G
Vortex-Genie 2	Scientific Industries	SI-0236
Whatman Papel de filtro, Grado 1	Fisher Scientific	09-805H	Círculos, 185 mm
δ-valerolactona	Sigma-Aldrich	389579-100ML	Purificado por destilación al vacío