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Artículo de método

El ensayo de co-cultivo del anillo aórtico: Una herramienta conveniente para evaluar el potencial angiogénico de las células mesenquimales estromales In Vitro

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DOI:

10.3791/56083

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18 de septiembre de 2017

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1Create Fertility Centre, 2Department of Physiology, University of Toronto, 3Department of Obstetrics and Gynecology, University of Toronto, 4Department of Medical Sciences, University of Toronto, 5Department of Obstetrics and Gynecology, Women's College Hospital

En este artículo

Resumen

Aquí, presentamos un uso nuevo del ensayo de anillo aórtico donde prelabelled las células mesenquimales son cultivadas conjuntamente con redes endotelial derivado de aorta de rata. Este novedoso método permite la visualización de autoguiado hacia el blanco las células estromales mesenquimales (MSCs) y la integración con redes endoteliales, cuantificación de propiedades de red y la evaluación del MSC immunophenotypes y expresión genética.

Resumen

La angiogénesis es un proceso complejo y altamente regulado responsable de proveer y mantener la perfusión adecuada del tejido. Mantenimiento insuficiente de la vasculatura y malformaciones patológicas pueden resultar en graves enfermedades isquémicas, mientras que demasiado abundante desarrollo vascular está asociado con cáncer y enfermedades inflamatorias. Una forma prometedora de la terapia pro-angiogénica es el uso de fuentes de células angiogénicas, que puede proporcionar factores reguladores, así como soporte físico para el desarrollo de nueva vasculatura.

Células estromales mesenquimales (MSCs) son candidatos extensivamente investigados para la regeneración vascular debido a sus efectos paracrinos y su capacidad para detectar y hogar de los tejidos isquémicos o inflamados. En particular, primer trimestre células perivascularias de cordón umbilical humano (FTM HUCPVCs) están un candidato muy prometedor debido a su propiedades pericyte-como, alto potencial proliferativo y del multilineage, propiedades inmunes privilegiados y paracrina robusto Perfil. Evaluar con eficacia potencialmente células regenerativas angiogénica, es un requisito para probar en confiable y ensayos preclínicos "traducible". El ensayo del anillo aórtico es un modelo ex vivo angiogénesis que permite fácil cuantificación de estructuras endoteliales tubulares, ofrece accesorios apoyo células y matriz extracelular (ECM) del anfitrión, excluye componentes inflamatorios y es rápido y barato configurar. Esto es ventajoso en comparación con modelos en vivo (p. ej., análisis de córnea, Matrigel enchufe de ensayo); el ensayo de anillo aórtico puede seguir las células administradas y observar las interacciones intercelulares evitando xeno inmune rechazo.

Presentamos un protocolo para un uso nuevo de la prueba del anillo aórtico, que incluye MSCs humanos en co-cultivos con redes endotelial aórtica de la rata en desarrollo. Este análisis permite el análisis de la contribución de MSC para formación y desarrollo a través de interacciones físicas pericyte-como del tubo y de su potencia para activamente migrar a sitios de la angiogénesis y para evaluar su capacidad para realizar y mediar Procesamiento de ECM. Este protocolo proporciona más información sobre cambios en MSC fenotipo y expresión genética después de co-cultivo.

Introducción

El complejo proceso de la angiogénesis mejora y mantiene la perfusión del tejido de sangre nueva buque promoción de las preexistentes vasculatura1. Es un proceso estrechamente regulado y equilibrado por factores pro-angiogénicos y antiangiogénicos. Cualquier deficiencia en este sistema puede llevar a buque insuficiente mantenimiento o crecimiento, causando graves enfermedades isquémicas, incluyendo enfermedad miocardio, accidente cerebrovascular y trastornos neurodegenerativos. Sin embargo, el exagerado desarrollo vascular es característica para condiciones como cáncer y trastornos inflamatorios2.

Desarrollo de terapias que tienen como objetivo controlar la angiogénesis para lograr regeneración tisular favorable es de importancia clave. A pesar de extensas investigaciones preclínicas y clínicas, intentos para estimular la angiogénesis mediante microRNAs y factores pro-angiogénicos han fracasado para lograr los resultados deseados3,4,5. Posibles razones de los efectos transitorios incluyen: longevidad limitada de proteínas angiogénicas y ácidos nucleicos y el finito número de objetivo de6,de factores de crecimiento7. Aunque factores angiogénicos solubles son esenciales para iniciar la angiogénesis, el mantenimiento y la funcionalidad de vasculatura dependen de apoyo tipos de células incluyendo células de pericitos y músculo liso8. El campo de la favorable-angiogenic terapias ahora está explorando fuentes potenciales de células madre y progenitoras celulares que pueden proporcionar factores angiogénicos localmente, mientras que apoyar físicamente recién desarrollado vasculatura, uno mismo-renovar o incluso diferenciarse en las células endoteliales como9,10. Encontrar la óptima angiogénicos tipos celulares con la capacidad para cumplir con estos requisitos funcionales sostiene una gran promesa para la regeneración de tejido isquémico.

Con el fin de traducir con éxito terapias basadas en células potenciales en ensayos clínicos, los estudios preclínicos necesitan demostrar su eficacia y resaltar los mecanismos angiogénicos subyacentes. A pesar del alto número de ensayos de angiogénesis establecida, el campo carece de un análisis de "estándar de oro" en vitro que confiablemente podría evaluar la eficacia del potencial candidato célula tipos11,12, 13. mayoría en vitro angiogénesis ensayos (incluyendo los ensayos de formación endoteliales de proliferación, migración y tubo) por lo general evaluación los efectos de las células o compuestos en cambio fenotípico o diferenciación en células endoteliales tubulares y estructuras de red14,15. Mientras que estas características son esenciales para la angiogénesis, también debe de evaluar un ensayo "traducible": 1) el aumento o reemplazo de los tipos celulares soporte incluyendo pericitos o células musculares lisas, 2) el proceso del ECM o la membrana del sótano, y 3). la eficiencia para promover la formación de microvascularización funcional. En vivo modelos de angiogénesis, incluyendo la córnea ensayo y ensayo de tapón de Matrigel, recapitulan el microambiente único en vivo pero se enfrentan con la dificultad de seguimiento administrado células para observar interacciones físicas. Además, en modelos en vivo , xeno inmune rechazo puede ocurrir durante la prueba de potencial de candidatos de terapia allogeneic de la célula16. Ex vivo modelos de angiogénesis, particularmente el ensayo del anillo aórtico puede proporcionar: 1) la fácil observación y cuantificación de estructuras tubulares, células de apoyo 2) accesorias, 3) ECM de acogida y de fuentes artificiales, 4) exclusión de inflamatoria componentes y 5) configuración rápida y barata17,18. Por lo general, el ensayo de anillo aórtico puede probar el potencial angiogénico de pequeñas proteínas secretoras, agentes farmacológicos y modelos de roedores transgénicos19,20,21.

MSCs son candidatos prometedores para la regeneración vascular principalmente a través de sus efectos paracrina mediada22,23,24. MSCs se ha demostrado que secretar factores angiogénicos clave como Factor de crecimiento endotelial Vascular (VEGF), Factor de crecimiento de hepatocito (HGF), Factor de crecimiento insulínico-1 (IGF-1), Factor de crecimiento fibroblástico (bFGF) básicos y angiopoeitin-1 (Ang-1)25 ,26. MSCs pueden también detectar y tejidos hogar de isquémico o inflamada, sin embargo, los mecanismos exactos son todavía objeto de investigación. Cada vez más, la literatura apoya la hipótesis de que MSCs mayoría surgen de células perivasculares, co expresan pericyte marcadores, pueden comportarse como del pericitos27. HUCPVCs son una fuente joven de MSCs derivada de la región perivascular del cordón umbilical humano. Representan una población de MSCs con pericyte-como las características y se han caracterizado de cordón umbilical FTM y término. HUCPVCs FTM demuestran una alta expresión de marcadores pericyte incluyendo propiedades de privilegio inmunitario CD146 y NG2, alto potencial proliferativo y del multilineage y mostrar un perfil robusto paracrina del28. HUCPVCs FTM son un tipo de célula del candidato ideal para promover la regeneración del tejido lesionado mediante la promoción de nueva vasculatura a través de sus propiedades pericyte-como.

Para probar el potencial angiogénico y pericyte-como propiedades de MSCs humanas, un número muy limitado de ensayos de angiogénesis es migración de angiotropic disponible donde positivo (en lo sucesivo denominado el "homing"), ECM procesamiento y desarrollo de la física interacciones entre tipos de células pueden investigarse, mientras que la obtención de datos cuantitativos en el desarrollo de la microvascularización.

Por este medio presentamos un protocolo que describe un uso nuevo del ensayo de anillo aórtico. MSCs humanos fueron cultivadas conjuntamente con redes endoteliales aórticas derivados de rata en desarrollo para evaluar su contribución a la formación, maduración y homeostasis del tubo. Esta versión del ensayo de anillo aórtico evalúa la capacidad y la potencia de los candidatos de terapia celular inicio a sitios de la angiogénesis, realizar median el procesamiento de ECM y contribuir al desarrollo tubular endotelial mediante el establecimiento de pericyte-como física interacciones. Además de cuantificar el efecto neto de MSCs en vitro formación red endotelial y la observación de las interacciones intercelulares, nosotros también optimizado un protocolo para aislar MSCs de co-cultivos. Mediante qPCR y citometría de flujo, es posible caracterizar cambios en MSC fenotipo y expresión genética después de co-cultivo. Como tipos de la célula del modelo, se compararon ontogeneticamente temprano (prenatal) y últimas fuentes (adultas) de MSCs humanos: mAh HUCPVCs y humanas derivadas de la médula ósea MSCs (CMMo), respectivamente, en el análisis del anillo aórtico. Proponemos que el ensayo de anillo aórtico puede utilizarse para estudiar el potencial angiogénico de cualquier tipo de célula física apoyo cuando bajo investigación para aplicaciones regenerativas angiogénicos.

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Protocolo

todos los estudios que involucran animales fueron realizados e informados según llegar directrices 29. Todos los estudios fueron realizados con la aprobación de la Junta de investigación institucional ética (número de REB 4276). Animales todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité de cuidado Animal de la red de salud de la Universidad (Toronto, Canadá), y todos los animales recibieron atención humanitaria conforme a la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio, 8 th edición ( Institutos nacionales de salud 2011).

1. instalación de ensayo de anillo aórtico

  1. aislante de la aorta de rata.
    1. Euthanize 8 - 10 semanas de edad ratas Sprague-Dawley con CO 2 asfixia: conjunto CO 2 cámaras al 20% de reemplazo de gas (caudal = 0.2 x cámara volumen/min). Confirmar la ausencia de sujetador reflejo y corazón latidos palpando pecho.
    2. Mojar la piel en el área del pecho con una gasa esterilizada con etanol al 70%. Utilizar pinzas esterilizadas y tijeras para hacer una incisión en la línea media del tórax y cortar a través de capas de piel y músculo.
    3. Una vez que está expuesta la caja torácica, corte las costillas en cada lado y dobla hacia arriba unos 5 mm desde el esternón a cada lado. Algún sangrado se espera de arterias intercostales en cadáveres frescos.
    4. Empuje el tejido pulmonar y el corazón a la derecha anatómica para exponer la aorta. La aorta es el blanco color recipiente situado junto a la columna vertebral.
    5. Uso pinzas para pinzar la aorta (después del arco aórtico) y tijeras quirúrgicas para hacer la primera incisión mientras sostiene la aorta con fórceps. Al cortar la aorta, la cavidad torácica se llenará rápidamente de sangre, por lo tanto, es fundamental para trabajar con rapidez para obtener la aorta antes de la coagulación de sangre.
    6. Pinzas uso pelar suavemente la aorta hacia abajo, lejos de la columna vertebral y la aorta. El tirón será cortar las arterias intercostales sin más incisiones. Obtener aproximadamente 10 cm de tejido o antes de que la aorta se divide en dos ramas en la cavidad abdominal y corta la aorta de la canal. Empuje el diafragma si es necesario a la dirección caudal para tener acceso para bajar las secciones de la aorta.
      Nota: Pelar la aorta suavemente porque fuerza intensa puede hacer que se rasgue. Si las lágrimas de la aorta, permite la coagulación de la sangre durante unos segundos y utilice una toalla de papel para remover la sangre coagulada, lo que permite visibilidad de la aorta remanente.
    7. Coloque la aorta en un tubo de 15 mL con 10 mL de helado Hank ' s solución sal balanceada (HBSS) suplementado con 1% de penicilina/estreptomicina (P/S). Mantener los tubos en hielo.
      Nota: El tejido aórtico puede durar 1-2 h en el hielo pero es mejor procesar lo antes posible.
  2. Preparar los medios de cultivo de ensayo de anillo aórtico en un estéril gabinete de bioseguridad (BSC).
    1. Preparar el medio de crecimiento endotelial (EGM) utilizando una unidad de filtración para filtrar 500 mL de medio Basal endotelial (EBM) suplementado con 2% de suero bovino Fetal (FBS), gentamicina 1% y factores de crecimiento (véase Tabla de materiales). Coloque 50 mL de los medios de filtrado en un baño de agua o grano a 37 ° C.
    2. Utilizar otra unidad de filtración para filtrar 100 mL de EBM suplementado con 2% de SBF y el 1% P/S a preparado el EBM 2% FBS (EBM-FBS) y almacenar a 4 ° C.
  3. Capa de placas de cultivo de tejidos 12-bien con extracto de membrana Basal (BME) mientras trabajaba en el hielo.
    1. Lugar una placa de 12 pozos sobre una superficie fría (paquete de hielo grande o bandeja). Agregar 200 μL/pocillo de recién descongelados usando BME refrigerados puntas de pipeta y remolino BME para asegurar incluso la capa. Trabajo rápidamente para evitar la polimerización desigual de la BME.
      Nota: La supresión de una aorta típica rinde 20 anillos aórticos. Para tener en cuenta la variabilidad entre los ensayos del anillo aórtico, configurar al menos tres ensayos de anillo aórtico por grupo de tratamiento e incluyen un control. Si la fuente lo permite, se recomienda 6 anillos por grupo de tratamiento.
    2. Colocar las placas recubiertas en incubadoras humidificados (37 ° C, humedad relativa de 95%, 5% CO 2, estas condiciones se aplican a todos los pasos incubadora humidificada en adelante) para 30 minutos lugar 1.000 puntas de pipeta μl nuevamente dentro de-20 ° C para paso 1.5.3.
      Nota: Mientras que el extracto de la membrana basal se usa en la concentración de acciones, su consistencia y rigidez está estrictamente controlado por el tiempo de polimerización. Asegúrese de mantener los tiempos de polimerización mismo exactos para todos los paralelos y experimentos independientes.
  4. Sección de la aorta en uniforme anillos.
    1. Tomar la aorta desde el tubo de 15 mL y colóquelo en un plato de 10 cm con 10 mL de HBSS dulce suplementado con 1% P/S.
    2. Utilizar dos juegos de pinzas para separar cuidadosamente el exceso de tejido conectivo, tejido adiposo y utilice un bisturí para las restantes ramas de las arterias intercostales conectado a la aorta. Esto reduce la variabilidad entre las unidades del anillo basado en diferentes niveles del tejido residual. Quite cualquier residuo coagulado la sangre del interior de la aorta.
    3. Coloque una regla o cuadrícula bajo el plato de 10 cm para cortar precisamente 1-2 mm de amplios sectores de la aorta mediante pinzas y bisturí estéril. Corte las secciones tan exacto como sea posible para reducir la variabilidad entre las unidades.
  5. Incrustar los anillos aórticos en BME.
    Nota: Si el seccionamiento de anillos aórticos no se completa antes de la incubación de polimerización de BME, retire las placas cubiertas de incubadoras humidificados y añadir 100 μl de EBM a cada bien para terminar la polimerización. Sincronización exacta es crítica como excesiva polimerización de BME puede interferir con la red endotelial desarrollo y migración celular. Una vez preparados los anillos aórticos, quitar el EBM de los pozos y continuar desde el paso 1.5.2.
    1. Quitar los pozos BME revestido de las incubadoras humidificadas y volver a la BSC.
    2. Cuidadosamente recoger anillos aórticos individuales con pinzas y coloque uno en el centro de cada pozo revestido de BME. Repetición de los restantes anillos aórticos.
      Nota: Medios trasladados junto con el anillo aórtico se deben tener un mínimo para evitar las irregularidades de la polimerización.
    3. Uso refrigerado (-20 ° C) 1.000 μl puntas de pipeta añadir 300 μL de BME en la cima de cada anillo aórtico y distribuir uniformemente el BME alrededor del pozo.
    4. Devolver los anillos aórticos incrustados a las incubadoras humidificados durante 30 minutos
    5. Quitar las placas con el anillo aórtico embebido de las incubadoras humidificadas y lentamente agregue 1 000 μl de EGM (preparada y calentada a paso 1.2.1) mediante la colocación de la pipeta de punta contra la pared de la cultura bien.
      Nota: Pipetear directamente los medios de comunicación sobre BME puede interrumpir la BME polimerizado y frenan desarrollo continuo red endotelial. Use una pipeta multicanal correspondiente si está disponible.
    6. Después de 24 h, retirar 1.000 μl de EGM y cambiarlo por 1 000 μl de EBM-FBS preparado en el paso 1.2.2, otra vez transfiriendo lentamente contra el lado de la cultura bien.
  6. Mantener el ensayo del anillo aórtico mediante la sustitución de 500 μl de EBM-FBS con 500 μl de fresco EBM-FBS (37 ° C) cada 48 h.
    Nota: Véase sección 2 para iniciar la expansión de la cultura MSC en el mismo día como establecimiento de ensayo del anillo aórtico. Esto se asegurará de que MSCs están listos para el cocultivo cuando las redes endoteliales.
  7. Utilizar la microscopía de campo brillante para seguir desarrollo de red endotelial de ensayo de anillo aórtico (vea la figura 1 como referencia para el desarrollo óptimo de la red). Una vez el aspecto endotelial redes como se muestra en la figura 2, proceder con la configuración de los co-cultivos de ensayo MSC anillo aórtico (sección 3). Consulte el paso 4.1 para más detalles de la proyección de las redes endoteliales de.

2. Cultivo de tejidos

  1. preparar las soluciones madre de medios de cultivo de tejidos.
    1. HUCPVCs de cultura FTM (previamente establecidas, n ≥ 3 líneas independientes para cada uno) 30 y BMSCs comercialmente disponibles en alfa-MEM suplementado con 10% FBS y 1% P/S.
    2. Esterilizar los medios de comunicación utilizando un botellas de filtro de tamaño de poro de 0,2 de μm.
    3. Almacenar las soluciones de medios preparados a 4 ° C hasta por 3 semanas.
  2. HUCPVC FTM mantener y CMMo culturas en incubadoras humidificados y paso en el 70-80% de confluencia determinado por microscopía de contraste de fase. Uso adecuados volúmenes de medios de comunicación para el tamaño del plato de cultivo de tejidos utilizan (es decir, 10 mL en un plato de 10 cm). Utilice estas condiciones de cultivo para el mantenimiento y pases el MSCs.
  3. Disociar las monocapas MSC para pases o anillo aórtico ensayo-MSC Co culturas usando una solución de enzima de disociación (plato de 4 mL/10 cm) e incuban en los incubadores humidificados para asegurar la separación de las células mediante microscopía de campo brillante de 3 minutos; Incube para un adicional 1-2 min si es necesario.
  4. Transferir las células disociadas a un tubo de 15 mL y centrifugar a 400 x g por 5 min
  5. Aspire el sobrenadante sin perturbar el sedimento celulares y resuspender las células en 1 mL de un medio de cultivo apropiado (alfa-MEM completo los medios de comunicación para pases de células o EBM-FBS para anillo aórtico co-cultivos de ensayo/MSC) para contar con un contador celular.

3. Preparación de co-cultivos de ensayo/MSC anillo aórtico

  1. semilla 10 4 MSCs en cada integrado anillo aórtico (9.000 células/cm 2 / 12-pozo de la placa). Basado en el número de ensayos del anillo aórtico, la mancha MSCs con colorante fluorescente viable, intransferible. Mantener al menos tres pozos de anillos aórticos sin MSCs para un grupo de control.
    1. Mancha 10 medios 5 MSCs/mL EBM-FBS, añadir 2,5 μl de viable, medios intransferibles tinte fluorescente/mL (5 μm) en un tubo de 15 mL y colóquela en la incubadora humidificada durante 30 minutos mezclan suavemente el tubo a la mitad de la incubación.
    2. Los siguientes 30 min incubación, agregar 1 volumen de frescos EBM-FBS a las células y centrifugar a 400 x g durante 5 min.
    3. Quite el sobrenadante y Resuspenda el precipitado de células en 1 mL de medio de EBM-FBS. Confirmar la coloración exitosa de MSCs mediante microscopía de fluorescencia.
  2. Eliminar las placas que contienen el anillo aórticas de la incubadora humidificada y quitar 500 μl de EBM-FBS de cada bien.
  3. Cuidadosamente la semilla 10 4 MSCs en 500 μl de EBM-FBS en cada anillo aórtico incrustado mediante pipeteo uniformemente alrededor de las redes endoteliales. Asegurar la distribución uniforme agitando suavemente la placa de cultivo.
    1. Agregar adicional EBM-FBS para asegurarse de que el volumen total de los medios de comunicación en las culturas co del ensayo/MSC anillo aórtico es 1.000 μl.
  4. Uso de microscopía de fluorescencia para visualizar las fluorescencia con MSCs en el ensayo de anillo aórtico.

4. microscopia

  1. microscopía de campo brillante de uso a la imagen de las redes endotelial de rata antes del ensayo de anillo aórtico/MSC culturas Co para mediciones iniciales (día 0) de las propiedades de red endotelial (p. ej., red longitud, bucles de red). Imagen 4 cuadrantes por bien del anillo aórtico de la sección más alejada de la red endotelial dentro de ese cuadrante. Redes de anillo de
    1. imagen la aorta tras el anillo aórtico ensayo/MSC Co las culturas a los 3, 5 y 7 días. Utilizar estas imágenes para cuantificar el efecto MSC en el desarrollo de la red endotelial.
  2. Usar microscopía de fluorescencia para MSCs etiquetadas en el análisis del anillo aórtico de la imagen.
    1. Siguientes 24 h de ensayo de anillo aórtico/MSC co-cultivos, usar microscopía de fluorescencia para visualizar MSC autoguiado hacia el blanco, elongación e integración con las redes endoteliales. Se superponen las imágenes fluorescentes de MSCs con las imágenes de campo brillante de las células endoteliales para observar la colocalización de ambos tipos de células.
    2. Imagen MSCs localizadas dentro de las redes endoteliales desarrolladas proximales en el tejido del anillo aórtico y MSCs localizadas en nuevo desarrollo de redes distales en el tejido del anillo aórtico ( figura 2).

5. El flujo Cytometry y qPCR

  1. un día antes de disociar las redes endotelial del anillo aórtico, descongelar dispase congelado a 4 ° C O/N. sección 5.3 es idéntico para la citometría de flujo y qPCR.
  2. Calentar 50 mL de dispase y 50 mL de 0.5% de tripsina en el grano o baño de 37 ° C.
  3. Recuperar las células para el análisis de los co-cultivos de ensayo/MSC anillo aórtico.
    1. Después de 1 semana de la cultura co del ensayo/MSC del anillo aórtico, eliminar los medios de cultivo y añadir 1 mL de Phosphate-Buffered salina (PBS) lentamente a cada uno bien por 3 minutos y retire. Repita este lavado dos veces más.
    2. Añadir 800 μl de pre calentado dispase en cada pocillo e incubar en las incubadoras humidificadas durante 15 minutos
    3. Quitar las placas de las incubadoras humidificadas y suspender dispase mediante pipeteo (5-10 x) para romper para arriba el BME y transferir el contenido de cada pocillo a tubos separados 15 mL.
    4. Repetir paso 5.3.3 nuevo con dispase fresco precalentado hasta no residual BME se observa en la cultura también. Agregar 1 volumen de PBS suplementado con 3% FBS a la suspensión de células dispase para inactivar la dispase. Quite los anillos aórticos flotando en la suspensión de células usando pipetas.
    5. Girar las suspensiones celulares a 400 x g por 5 minutos Retire el sobrenadante con cuidado, dejando 3 mL de la suspensión celular en el tubo de 15 mL.
      Nota: Una pelotilla sólida, obvio no puede ser visible, pero existen células y BME.
    6. Añadir 3 mL de tripsina 0,5% precalentadas a la suspensión de la célula y vigorosamente resuspender (5-10 x mediante pipeteo) células. Incubar las soluciones tripsinizaron celular en las incubadoras humidificadas durante 10 minutos
    7. Retirar las suspensiones celulares tripsinizaron incubadoras humidificados y añadir 6 mL de PBS suplementado con 3% FBS y resuspender tim unoses. Las suspensiones celulares a 400 x g por 5 min de la vuelta
    8. Cuidadosamente retire todo el sobrenadante, dejando el precipitado de células en el tubo y resuspender las células en 1 mL de PBS suplementado con 3% FBS en cada tubo.
    9. Filtro de la suspensión de células de 1 mL utilizando un colador de célula 70 μm para eliminar las células agregadas y BME residual de la suspensión de células. Contar las células en 1 mL de la suspensión celular usando un contador celular.
  4. Preparar las células para citometría de flujo. Suspensiones
    1. incubar la célula (10 5 células en 200 de μl de PBS suplementado con 3% FBS) con anticuerpos primarios (FITC o APC) conjugados fluoróforo (TRA-1 - 85 - CD146, CD31) concentración = 1:40) a 4 ° C por 30 min, protegidos de la luz.
      Nota: Citometría de flujo para MSCs se ha optimizado por Hong et al., 2013 28. Se requiere para una lectura precisa un mínimo de 10.000 células.
    2. Después de la incubación de 30 min, resuspender las células en 2 mL de PBS suplementado con 3% FBS y centrífuga (400 x g, 5 min).
    3. Mantener las células a 4 ° C protegido de la luz hasta el análisis por citometría de flujo (eventos de al menos 1 x 10 4) en 1 h. Para la bloquea, véase figura 1 complementaria. Ordenar MSCs humanos utilizando anti-TRA-1-85 (APC) (concentración: 1:40 y en 0.5% FBS/PBS) y clasificar las células en 350 μl de tampón de lisis de la célula para el análisis de qPCR.
      Nota: Células sometidas a lisis pueden conservarse a-80 ° C hasta 3 meses para análisis de qPCR futuro.
  5. Preparar las células para el análisis de qPCR.
    1. Aislar el ARN de las células sometidas a lisis mediante kits de aislamiento de RNA base de columna y determinar la concentración de RNA y la calidad.
    2. Prepare cDNA de hasta 5 μg de ARN por 100 μl reacción reversa del transcriptase. Realizar una etapa de pre-amplificacion si la producción de RNA es baja (< 10 ng/μL). Uso de menos de 100 ng de ARN resultará en una alta tasa de falsos negativos.
      Nota: Las plantillas de cDNA pueden conservarse a-20 ° C para su posterior análisis hasta 4 meses.
    3. Realizar la qPCR utilizando angiogénesis expresión profiler para detectar cambios en la expresión génica. Uso 5 ng de cDNA por reacción (ciclos de 40, 60 ° C temperatura de recocido/extensión). Express doble cambio de expresión frente a muestras de cDNA MSC derivada indiferenciadas. Ejecutar los correspondientes controles negativos (anillo aórtico sin MSCs humanas).

6. Red de cuantificación aórtica anillo ensayo/MSC Co culturas siguientes

  1. Descargar software tratamiento de imágenes como el ImageJ junto con angiogénesis Analyzer plugin 31.
  2. Importar imágenes de red endotelial y abrir usando el software.
  3. Convertir las escalas de imagen basadas en las especificaciones del microscopio utilizado.
  4. Utilizar una herramienta de línea recta para medir el crecimiento radial de la red.
  5. Contar los bucles de red endotelial utilizando la herramienta del contador de célula (lazos con al menos 4 lados deben ser cuantificadas).
  6. Para cuantificación adicional de propiedades de red, utilice el plugin del analizador de la angiogénesis u otros plugins similares para analizar segmentos de maestro, total longitud de segmentos, áreas de red total y el número de uniones. Utilice la herramienta de máscara borrosa para blur tejido del anillo aórtico y espacios vacíos para evitar falsos positivos cálculos.
  7. Transferir los valores a una estadística programa gráfico red endotelial propiedades y siguiendo los co-cultivos de anillo aórtico ensayo/MSC.

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Resultados

El mismo flujo de trabajo para establecer el ensayo de co-cultivo anillo aórtico/MSC se demuestra en la figura 1. Los pasos principales son: la rata aorta aislamiento, seccionamiento y fijación de los anillos aórticos, monitoreo de brotes endoteliales y desarrollo de la red y finalmente etiquetado y administrar las MSCs. La línea de tiempo del análisis de red endotelial describe la ventana para el análisis factible para cada período de co-cultivo: día 1, 5 &#...

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Discusión

Hay varias etapas críticas en la creación de un ensayo de anillo aórtico exitoso experimento de cocultivo MSC. En primer lugar, los pasos más importantes cuando aislar y seccionar la aorta son: 1) obtener exclusivamente el segmento torácico de la aorta; 2) con cuidado quitar la ramificación de los vasos sanguíneos, conjuntivo y tejido adiposo y; 3) cortar hasta secciones de la aorta (~ 1 mm) para limitar la variabilidad entre cada ensayo. En segundo lugar, la incorporación exitosa de anillos aórticos en BME es fundamenta...

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Divulgaciones

El Dr. Clifford L. Librach es común titular de la patente: métodos de aislamiento y uso de células derivadas de tejido de cordón umbilical de primer trimestre. Concedido en Canadá y Australia.

Agradecimientos

Los autores agradecemos a los siguientes funcionarios y personal de investigación: Andrée Gauthier-Fisher, Matthew Librach, Tanya Barretto, Tharsan Velauthapillai y Sarah Laronde.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Alpha-MEMGibco12571071para medios de cultivo FTM, HUCPVC y BMSC.
TRA-1-85 R& antihumano conjugado con APC D SystemsFAB3195AMarcador celular específico para humanos para citometría de flujo y clasificación celular Extracto
membrana basal (BME) (Matrigel)Corning354234para la inclusión de aorta
Bullet-kitLonzaCC-3162Incluye: Gentamicina/Anfotericina-B
(GA)Factor de crecimiento epidérmico
humano (hEGF); factor de crecimiento endotelial vascular
(VEGF); R3-
factor de crecimiento similar a la insulina-1 (R3-IGF-1);
ácido ascórbico; Hidrocortisona;
factor de crecimiento de fibroblastos humanos-beta (hFGF-β); Heparina; Suero Fetal Bovino
(FBS). Necesario para preparar EGM
CellTracker Green CMFDA DyeThermo-fisherC2925Para la tinción de MSCs, el verde es recogido de forma óptima por las MSCs
Microscopio de cultivo CKX53OlympusPara la obtención de imágenes de campo claro del desarrollo de redes endoteliales
Contador de células automatizado CountessInvitrogenC10227Recuento de células para cultivo de MSC, citometría de flujo y qPCR
DispasaTecnologías StemCell7923Para la disociación de cocultivos de anillo aórtico-MSC (precalentamiento a 37 °C; C)
Bisturíes estériles desechablesVWR21909-654Para el corte de la aorta
Solución salina tamponada con fosfato de DulbeccoSigma-AldrichD8537PBS. 1X, sin cloruro de calcio y cloruro de magnesio
Medios basales endoteliales (EBM)LonzaCC-3156Medios basales necesarios para el cultivo de cocultivos con anillo aórtico-MSC (tibios a 37 ° C antes de usar). Requerido para EGM y EBM-FBS
Etanol, 70%, grado biotecnológicoVWR97064-768Para esterilizar superficies
EVOSLife TechnologiesMicroscopio fluorescente interno para rastrear la migración e integración de MSC
Suero fetal bovino (FBS) (Hyclone)GE HealthcareSH3039603Componente sérico del medio de cultivo celular
Anticuerpo anti-CD31 conjugado con FITCBD558068Marcador endotelial humano para citometría de flujo
anti-CD146 conjugado con FITCBD560846Marcador de pericitos humanos para citometría
de flujo PinzasAlmedic7727-A10-704Para la manipulación de tejido de rata. Puede utilizar cualquier pinza similar
Solución salina equilibrada de Hank (HBSS)Life Technologies14175-0941X Sin cloruro de calcio y cloruro de magnesio
HERAcell 150i CO2 IncubadoraThermo Fisher Scientific51026410Para incubar células
Perfilador de angiogénesis humana RT2 Matriz de PCRQiagenPAHS-024ZEspecífico para humanos e incluye cebadores para 84 genes implicados en la angiogénesis. Cada pocillo es 1 reacción de cebador
ImageJSoftware de procesamiento de imágenes de código abierto. Requiere el complemento del analizador de angiogénesis
LSR IIBDUHN SickKids FC Facility. Para citometría de flujo.
Instalaciones de MoFlo AstriosBeckman CoulterUHN SickKids FC. Para la clasificación de celdas.
Penicilina/estreptomicinaGibco15140122Componente antibiótico para tampones y medio de cultivo celular
RNeasy Mini KitQiagen74104Para la purificación de ARN. Incluye tampón de lisis celular
RT2Easy First Strand KitQiagen330421Para la preparación de ADNc para qPCR
RT2PreAMP Kit de síntesis de ADNcQiagen330451Preamplificación de ADNc si ARN de bajo rendimiento
Tijeras quirúrgicasFine Science Tools14059-11Para cortar piel, músculo y aorta
Gasa estérilVWR3084Para humedecer y esterilizar el pelaje del pecho
TrypleEThermo Fisher Scientific12605036MSC enzima de disociación precalentada a 37 &°; C
0,2 y mu; m unidad de filtración de porosThermo Fisher Scientific566-0020Para esterilizar medios de cultivo de tejidos
0,25% Tripsina/EDTAGibco25200056Para la disociación celular, precalentar a 37 &° C
Placas de cultivo de tejidos de 10 cmCorning25382-428Para la limpieza y el corte de cultivos celulares de aorta y MSC
12 placas de cultivo de pocillosCorning-Sigma Aldrich CLS3513Para la configuración de ensayos de anillo aórtico-Cocultivos MSC
Tubo de 15 mLBD Falcon352096Para procedimientos generales de cultivo de tejidos
70 μ Fisherbrand22363548Para garantizar una suspensión de una sola célula antes de la citometría de flujo o la clasificación
de

Referencias

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