De neuropéptido Y-pHluorin de la proyección de imagen confocal: una técnica para visualizar la exocitosis de gránulos de insulina en islotes humanos y murinos intactos

Resumen

Se describe un protocolo para la visualización de exocitosis de la insulina en los islotes intactos usando pHluorin, una proteína verde fluorescente sensible al pH. Islotes aislados están infectados con adenovirus codificación pHluorin acoplado al carga vesícula del neuropéptido Y. Esto permite la detección de eventos de fusión de gránulos de insulina mediante microscopía confocal.

Resumen

La secreción de insulina juega un papel central en la homeostasis de la glucosa bajo condiciones fisiológicas normales, así como en la enfermedad. Enfoques actuales para el estudio de exocitosis de gránulos de insulina utilice electrofisiología o microscopía juntada a la expresión de reporteros fluorescentes. Sin embargo la mayoría de estas técnicas se han optimizado para líneas celulares clonales o requiere disociar islotes pancreáticos. En contraste, el método presentado aquí permite la visualización en tiempo real de la exocitosis de gránulos de insulina en los islotes pancreáticos intactos. En este protocolo se describe primero la infección viral de los islotes pancreáticos aislados con adenovirus que codifica una pH-sensible a la proteína verde fluorescente (GFP), pHluorin, acoplada al neuropéptido Y (NPY). En segundo lugar, describimos el confocal de imágenes de islotes cinco días después de la infección viral y cómo controlar la secreción de gránulos de insulina. Brevemente, los islotes infectados se colocan sobre un cubreobjetos sobre una cámara de proyección de imagen y reflejados en un microscopio confocal vertical escaneo láser mientras que continuamente siendo perfundidos con solución extracelular que contiene varios estímulos. Se adquieren imágenes confocales, que abarca 50 μm del islote como grabaciones time-lapse utilizando un escáner rápido resonante. La fusión de gránulos de insulina con la membrana plasmática puede ser seguida en el tiempo. Este procedimiento también permite probar una batería de estímulos en un solo experimento es compatible con ratón e islotes humanos y puede ser combinado con diversos colorantes para proyección de imagen funcional (por ejemplo, tintes de calcio citosólico o potencial de membrana).

Introducción

Insulina es producida por las células beta del islote pancreático y es un regulador clave del metabolismo de glucosa¹. Muerte o disfunción de las células beta perturba la homeostasis de la glucosa y conduce a la diabetes². Insulina está lleno de gránulos de núcleo denso que se liberan en un Ca^{2 +}-dependiente de la forma³. Dilucidar cómo se regulación la exocitosis de gránulos de insulina es esencial para comprender plenamente lo que determina la secreción de insulina y abre nuevas vías para la identificación de nuevas dianas terapéuticas para el tratamiento de la diabetes.

Protocolo

el Comité de ética animal de la Universidad de Miami ha aprobado todos los experimentos.

1. viral infección intacto aislados humanos o islotes pancreáticos de ratón

1. cultura del islote: preparar los medios de cultivo de islotes pancreáticos: Connaught Medical Research Laboratories (CMRL) 1066, 10% FBS (v/v) y 2 mM L-glutamina. Islotes pancreáticos
   1. humanos se obtienen del programa integrado de distribución de islote (NIDDK, NIH). A su llegada, transferencia de los islotes (~ 500 equivalentes del islote) para 35 mm no-cultivo de tejidos tratados Petri con medios de cultivo CMRL de 2 mL a 37 ° C, 5% / 95% CO 2/o....

Resultados

El flujo de trabajo de la técnica se muestra en la figura 1. Brevemente, ratón o islotes humanos pueden ser infectados con adenovirus codificación NPY-pHluorin y reflejadas, después de pocos días en la cultura, bajo el microscopio confocal. Como gránulos se fusionan con la membrana plasmática y abierto, un aumento en fluorescencia se observa y se puede cuantificar (figura 1). Para determinar si NPY-pHluorin es una herramienta ade.......

Discusión

Este manuscrito describe una técnica que puede utilizarse para visualizar la exocitosis de gránulos de insulina en las células beta en islotes pancreáticos intactos por microscopia confocal. Utiliza el NPY-pHluorin como el reportero fluorescente clonado en adenovirus para asegurar una eficacia de transfección alta.

Aunque el método era muy eficiente en nuestras manos, pueden requerir algunas modificaciones que dependen fundamentalmente de dos parámetros: 1) la calidad de la preparación del isl.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Microscopio confocal de barrido láser vertical	Leica Microsystems, Wetzlar, Alemania	TCS-SP5	incluye LAS AF, el software de adquisición de imágenes
Cámara de imagen	Warner instruments	RC-26
Plataforma de cámara de imagen	Warner instruments	PH-1
22 x 40 cubreobjetos de vidrio	Daiggerbrand
Vacuum grasa de silicona	Sigma	Z273554-1EA
Sistema de perfusión multicanal	Warner instruments	VC-8
Calentador de solución en línea simple	Warner instruments	SH-27B
Controlador de temperatura	Warner instruments	TC-324C
Bomba de succión peristáltica	Pharmacia	P-1
Placa de Petri de 35 mm, tratamiento sin cultivo de tejidos	VWR	10861-586
CMRL Medio, sin glutamina	ThermoFisher	11530037
FBS, inactivado por calor	ThermoFisher	16140071
L-Glutamina 200 mM	ThermoFisher	25030081
solución de NaCl de 5 M	Sigma	S5150
Solución de KCl de 3 M	Sigma	60135
1 M de CaCl2	Sigma	21115
1 M >MgCl2 solución	Sigma	M1028
Albúmina sérica bovina	Sigma	A2153
1 M solución HEPES	Sigma	H0887
Filtro de vacío	VWR	431098
D-Glucose	Sigma	G8270
Hidrobromuro de poli-D-lisina	Sigma-aldrich	P6407
Di-8-ANNEP	ThermoFisher	D3167
3-isobutil-1-metilxantina (IBMX)	Sigma	I5879
Forskolin	Sigma	F3917

G15972H