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Artículo de método

Cultivo In Vivo-como astrocitos murinos mediante el protocolo AWESAM rápido, sencillo y barato

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DOI:

10.3791/56092

⸱

10 de enero de 2018

 , 
1Chemical Biology, Chemistry Research Laboratory, University of Oxford, 2Department of Physiology, Anatomy, and Genetics, University of Oxford, 3Trans-synaptic signaling, European Neuroscience Institute

En este artículo

Resumen

El protocolo AWESAM descrito aquí es óptimo para el cultivo de astrocitos murinos en aislamiento de otras células del cerebro de una manera rápida, sencilla y de bajo costo. Los astrocitos AWESAM exhibición espontáneo Ca2 + señalización, morfología y gene expresión perfiles similares a los astrocitos en vivo.

Resumen

El AWESAM (una low-costo easy stellate unstrocyte mmétodo) protocolo supone una forma rápida, sencilla y barata para generar grandes cantidades de en vivo-como los monocultivos de astrositos de ratón y rata : Las células cerebrales pueden ser aisladas de regiones diferentes del cerebro, y después de una semana de la cultura de célula, las células no astrocíticos son sacudidas colocando los platos de la cultura en un agitador por 6 horas en la incubadora. Los astrocitos restantes son entonces pasados en nuevas placas con un medio específico de astrositos (llamado NB + H). NB + H contiene bajas concentraciones de heparina EGF-como factor de crecimiento (HBEGF), que se utiliza en lugar de suero en el medio. Después de crecer en NB + H, los astrocitos AWESAM tienen una morfología radiada y procesos fina característica. Por otra parte, los astrocitos tienen más en vivo-como la expresión del gen de astrocitos generados por métodos previamente publicados. CA2 + la proyección de imagen, dinámica de la vesícula y otros eventos cerca de la membrana se pueden estudiar así en los procesos astrocytic bien en vitro, por ejemplo, usando células vivas confocal o microscopía TIRF. En particular, los astrocitos AWESAM también exhiben espontánea Ca2 + señalización similares a los astrocitos en vivo.

Introducción

Los astrocitos influyen en función cerebral a través de soporte trófico, flujo sanguíneo, señalización sináptica y plasticidad y comunicación intercelular - todos los cuales son mecanismos que se centran en los procesos astrocytic finos. El protocolo AWESAM se describe aquí permite el estudio de estos procesos sin la interferencia de las neuronas y otros glía, que es útil por ejemplo, porque la expresión de muchas proteínas y Ca2 + señalización incluso se superponen en células cerebrales diferentes tipos. Además, este método supera limitaciones de las técnicas previamente disponibles. En particular, nuestro protocolo proporciona en vivo-como morfología (astrocitos estrellados con procesos finos) y expresión génica en un quick, easy y manera barata.

Morfología celular, expresión génica y muchos otros procesos normativos están directamente influenciadas por el medio ambiente. En una placa de cultivo, esto se refiere a factores liberados por las células circundantes, sino también el medio en que crecen las células. Por astrocitos, HBEGF fue divulgado previamente para inducir una morfología radiada1 pero también fue encontrado para diferenciar de astrocitos2. Sin embargo, concentraciones más bajas de HBEGF fueron utilizadas más adelante para generar más en vivo-como astrocitos identificados a través de la secuencia de RNA en dos protocolos diferentes de3,4. Por otra parte, cambios de morfología de astrositos con la composición del medio, sin importar el protocolo4: Neurobasal medio con una concentración baja de HBEGF es óptimo para el cultivo de astrocitos estrellados, mientras que otras composiciones medianas (p. ej., suero que contienen DMEM) producen las células poligonales (incluso en los astrocitos recién aislados por immunopanning).

El protocolo AWESAM supera los inconvenientes de las técnicas anteriores para el crecimiento de los monocultivos de astrositos4. Las técnicas anteriores para el crecimiento de los monocultivos de astrositos tienen las siguientes desventajas: morfología poligonal, que es poco característica de astrocitos estrellados en vivo (método de MD)5; la longitud y el costo del Protocolo (preparación de astrocitos de células madre pluripotentes inducidas se lleva tres meses y requiere de muchos reactivos, incluyendo costosos factores de crecimiento)6; las bajas cantidades de material (método immunopanning)3; y la la diferenciación de astrocitos y el requisito de una matriz 3D (Puschmann et al.) 1 , 2. en contraste, el protocolo AWESAM proporciona: en vivo-como morfología (astrocitos estrellados con procesos finos); una rápida, fácil y barato método; grandes cantidades de material; y más en vivo-como la expresión del gen en comparación con immunopanned y astrocitos MD. Además, cultura 2D permite el estudio de Ca2 + señalización y reciclaje en los procesos de finos y en eventos cerca de la membrana de la vesícula (por ejemplo, microscopía TIRF no es posible en las culturas 3D).

El método de MD se ha utilizado extensivamente desde su publicación en 19805, ofreciendo una técnica simple y rápida para monocultivos de astrositos poligonal. En Resumen, el método MD exige creciente neuronas mezclado en el suero fetal de ternero (FCS)-que contienen DMEM, siguió agitando pasos que enriquecen de astrocitos (como todas las otras células cerebrales tipos separan del plato) y más de la cultura en el mismo medio. DMEM suplementado con FCS se utiliza para muchos otros tipos de células, que van desde fibroblastos y adipocitos a líneas celulares de cáncer diferentes, todos los cuales comparten la morfología poligonal exhibida por astrocitos MD en la cultura. Hasta el temprano 2000s7, poco pensamiento había sido dado a los medios de comunicación a la medida de los astrocitos, específicamente a favor de su típica morfología radiada encontrado en vivo. Un protocolo publicado en 2011 alcanzar tal morfología radiada: llama al método immunopanning, emplea medio libre de suero optimizado para el cultivo de astrocitos3. Usando este método, las células cerebrales recién aislados están expuestas a una serie de platos recubiertos con anticuerpos que atacan células específicas del tipo celular proteínas de la superficie, para enriquecer por astrocitos. A pesar de más en vivo-como perfil morfología y expresión de immunopanned astrocitos, la mayoría de los estudios en vitro todavía dependen del método de astrositos MD. El método de la MD es sencillo y rápido, mientras que el método immunopanning compone de pasos más complejo y desperdiciador de tiempo en el primer día de la cultura (como períodos de digestión enzimática, y cuidado de soluciones de diferentes densidades, immunopanning, y varios centrifugación pasos - todo antes de placas). Sin embargo, utilizando el medio más especializado, el método AWESAM ofrece tanto la velocidad del método de la MD y la en vivo-como morfología del protocolo immunopanning.

En general, el protocolo AWESAM es útil para estudiar más en vivo-como astrocytes en 2D monocultivos aislados de neuronas y glia de otros (como previamente caracterizados4 immunostainings, immunoblots y secuenciación del RNA). Permite el estudio de los procesos astrocytic finos y proporciona gran accesibilidad para la visualización de eventos cerca de la membrana (e.g., reflejada por microscopía TIRF) y Ca2 + señalización espontánea.

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Protocolo

Todos los experimentos con animales descritos aquí fueron realizados siguiendo las directrices para el bienestar animal alemán.

Nota: El cronograma y pasos principales del Protocolo se ilustran en la figura 1.

1. preparaciones

  1. Preparar las siguientes soluciones.
    1. Preparar DMEM + cultivo poligonales astrocitos MD: DMEM con 10% FCS, 100 de U de penicilina y 100 de μg/mL estreptomicina.
    2. Preparar NB + H para el cultivo de astrocitos estrellados: neurobasal medio con 5 ng/mL HBEGF, 1 x suplemento B-27, suplemento de glutamina x 1, 100 de U de penicilina y estreptomicina μg/mL 100.
      Nota: Alícuotas de concentraciones más altas de HBEGF pueden ser preparados y almacenados a-20 ° C en el medio cuando sea necesario.
    3. Preparar el medio de la disección (10 mM HEPES en HBSS).
    4. Preparar alícuotas de 6-7 mL de tripsina-EDTA 0.05% y 0.25% tripsina-EDTA de 6-7 mL en tubos de 15 mL. Estos pueden ser almacenados a-20 ° C y descongelan en un baño de agua de 37 ° C.
  2. El día antes de iniciar el protocolo de capa de platos tratados con cultivo de tejidos de 10 cm con 5 mL de 0.04% polietilenimina (PEI).
  3. Al día siguiente, quitar el PEI y lavar los platos con agua destilada desionizada dos veces. Añadir 12 mL de DMEM + a cada placa y equilibrar previamente en la incubadora a 37 ° C y 5% CO2 durante al menos 30 minutos antes de las células de la galjanoplastia.
  4. Preparar la zona de disección: en campana de flujo laminar la disección, coloque dos platos de Petri de 10 cm llenos de medio de disección en el hielo. Para cada área del cerebro que aislado (por ejemplo, corteza, hipocampo), preparar un tubo de 15 llenado medio de disección de 14 mL y conservar en hielo. Herramientas de disección (tijeras finas, Dumont #3 y #5 pinzas) del aerosol con etanol al 70% y el lugar al lado del microscopio de disección en la campana.

2. rata o disección de cerebro de ratón

Nota: Ambos ratones y ratas se pueden utilizar. Animales mayores de P8 también puede ser usada (probamos hasta P12), pero quitar las meninges se hará cada vez más difícil. Además, la producción de células y la salud disminuirá, ya que las células del cerebro de los animales más viejos habrán formado procesos intrincados y conexiones que pueden romperse durante la disociación del tejido, llevando a la muerte celular mayor. Preparación cortical se describe aquí, pero también pueden utilizarse otras regiones cerebrales.

  1. Coloque 0.05% tripsina-EDTA en un baño de agua de 37 ° C.
  2. Eutanasia de animales (ratas embarazadas E19 cachorros o animales P0 P8) levantando lentamente la concentración de CO2 y aislar el cerebro. Los pasos siguientes requieren una técnica estéril.
  3. Si trabaja con tejido embrionario, primero retire los embriones del útero y los sacos embrionarios, después inmediatamente a cortar las cabezas con las tijeras. Cuando se cortan las cabezas, transferencia en medio de disección previamente enfriado.
    1. Una vez que las cabezas estén sumergidas en el medio, abrir la piel y el cráneo (ambos son muy suaves en animales jóvenes) con pinzas y pizca de cerebelo. Palanca con cuidado el resto del cerebro y se salga del cráneo.
      Nota: Dos a cuatro embriones de E19 rendimiento suficiente tejido para por lo menos ocho platos de 10 cm de astrocitos corticales plateados a 500.000 células por plato el día de la disección.
  4. Para cachorros recién nacidos o más viejo, a cortar las cabezas con las tijeras y aislar el cerebro por intermedio de corte la piel en línea recta desde la parte posterior de la cabeza hasta la punta de la nariz. Tire de la piel a un lado y con cuidado cortar la calavera izquierda y derecha, luego levantar el cráneo del hueso hacia arriba. Corte el cerebelo, y el resto del cerebro y se salga de la Calavera de la palanca.
    Nota: Dos a tres cachorros de P0 P8 rendimiento suficiente tejido para por lo menos ocho platos de 10 cm de astrocitos corticales plateados a 500.000 células por plato el día de la disección.
  5. Separar la corteza de la estructura subyacente del midbrain. Coloque las pinzas dentro de la fisura longitudinal entre los hemisferios, luego hacia la pinza entre las corteza y midbrain estructuras de un hemisferio (perpendicular a la fisura longitudinal) Apriete cada hemisferio libre.
  6. Usando las pinzas, quitar los meninges de cada hemisferio (y su hipocampo), luego separar los hipocampos. Si se requieren astrocitos de hipocampales, mueva cada hipocampo en un tubo de 15 mL con medio de disección de 14 mL en hielo.
  7. Eliminar aún más las zonas de corteza de cada hemisferio si regiones específicas son necesarias (por ejemplo, corteza frontal). Corte cualquier tejido cortical que se utilizará para la generación de los astrocitos en pedazos no mayores de 1 mm3. Recoger todos los pedazos de tejido cortical en un separado tubo de 15 mL con medio de disección en el hielo.

3. disociación y digestión del tejido

  1. Una vez recopilados todos los pedazos de tejido, esperar a colocar en la parte inferior del tubo, luego aspirar todo medio posible.
  2. Añadir 2-3 mL de 0.05% tripsina-EDTA utilizando una pipeta serológica e incubar los tubos en un baño de agua de 37 ° C por 20 min.
    Nota: Liberar todos tripsina-EDTA de la pipeta con rapidez para mezclar las piezas de tejido y permite colocar otra vez.
  3. Aspirar cuidadosamente el tripsina-EDTA, dejando piezas de tejido en poco líquido como sea posible, en la parte inferior del tubo.
  4. Añadir 5 mL de medio de disección previamente enfriado a lavar el restante tripsina-EDTA. Pipetear a un lado de la parte superior del tubo para lograr la mezcla de las piezas de tejido.
  5. Aspirar el medio de la disección y dejar las piezas de tejido como poco líquido como sea posible. Repita este paso de lavado con medio de disección previamente enfriado dos veces más.
  6. Después del paso del lavado final, añadir 1 mL de DMEM + (calentado a la temperatura ambiente) utilizando una pipeta de 1000 μl y triture el tejido mediante pipeteo arriba y abajo sin la introducción de burbujas.
    Nota: Es importante evitar la producción de burbujas, ya que esto puede cambiar el pH de la solución, a la que los astrocitos son muy sensibles.
  7. Coloque un filtro de la célula de 100 μm en la abertura de un tubo de 50 mL y Humedezca previamente el filtro con 4,5 mL de DMEM previamente enfriado.
  8. Pipetear 1 mL de la suspensión de tejido disociadas en el colador de la célula y añadir otros 4,5 mL previamente refrigerado por DMEM + lavar las células a través de la coladera de la célula.

4. célula galjanoplastia para enriquecimiento de astrositos por pases

  1. Cuenta las celdas, por ejemplo, diluyendo 10 μl de la suspensión celular con 10 μl trypan azul y pipetear la mezcla en un hemocitómetro.
  2. Placa de 500.000 células en 12 mL DMEM + por caja de 10 cm.
    Nota: DMEM + es útil para el crecimiento astrocytic, más que por las neuronas o microglia. Durante la agitación, las fuerzas físicas que actúan sobre cubreobjetos de vidrio dentro de pozos son mucho más fuertes que aquellos que actúan en los platos de 10 cm (sin cubreobjetos). Si las células se agitan en placas de 24 pocillos, están malsanos o moriran. Solo placa de astrocitos en placas de 24 pocillos después de agitar.
  3. Mantener cultivos celulares en la incubadora a 37 ° C y 5% CO2 durante siete días.
  4. El día 6, el día antes de la sacudida y pases las células, preparar el PEI recubiertos placas como se describe en el paso 5.

5. pases de células

  1. El día antes pases, capa de placas celulares con PEI 0,04%.
    1. Para inmunocitoquímica, transducción viral o transfección del plásmido, use placas de 24 pocillos o bien de 6 (cada uno con un 12 mm esterilizado o cubreobjetos de vidrio de 25 mm, respectivamente).
    2. Esterilizar el cubreobjetos de vidrio por la incubación en etanol al 70% durante al menos 1 hora, luego lavar tres veces con agua destilada desionizada antes de colocar el cubreobjetos en los pozos.
    3. Añadir por lo menos 70 μl PEI 0,04% por 12 mm cubreobjetos en placas de 24 pocillos y 600 μl 0.04% PEI por 25 mm cubreobjetos en placas de 6 pocillos.
    4. Por Western blot o análisis de RNA-Seq, los platos de 10 cm ya que contiene las células después de la disección pueden seguir utilizándose. Platos sólo necesitan ser sacudido, después las células se lavaron con PBS 1 x y tratadas con NB + H (no se transfieren a nuevos platos).
  2. El día en vitro (DIV) 7 después de la disección, coloque las placas de 10 cm con células en DMEM + en un agitador de laboratorio en la incubadora y sacudir los platos a 110 rpm durante 6 h.
  3. Lave el PEI de cubreobjetos recubierto con agua destilada desionizada dos veces. Añadir medio NB + H a las placas (500 μl por pozo para placas de 24 pocillos y 2 mL por pozo para placas de 6 pocillos). Pre-equilibre las placas en la incubadora a 37 ° C y 5% CO2 mientras que los platos de 10 cm están temblando, o por lo menos 30 minutos.
  4. 20-30 min antes del final de la sacudida de 6 h, Precaliente 1 x PBS, DMEM + NB + H y 0.25% tripsina-EDTA a 37 ° C en el baño de agua.
  5. Después de 6 h de agitación, sacar los platos de la cultura de la coctelera y reemplace inmediatamente el medio (que contiene sacudarido apagado neuronas, oligodendrocitos y microglia) con 10 mL previamente habían calentado 1 x PBS por plato.
    Nota: Es importante inmediatamente aspirar el viejo medio que contiene células separadas para evitar que las células no astrocíticos volviendo a instalar.
  6. Retirar el PBS y añadir 3 mL de tripsina-EDTA precalentado por plato. Incubar cada plato por 4 min en la incubadora a 37 ° C y 5% CO2.
    Nota: Si la preparación de muestras para Western blot o RNA-Seq, no añadir tripsina-EDTA. En su lugar, reemplace el PBS con 12 mL previamente calentado NB + H, después de que las culturas pueden colocarse en la incubadora.
  7. Añadir 5 mL DMEM con + a lo 3 mL de tripsina-EDTA en cada plato, pipetear las células fuera el plato con una pipeta serológica de 5 mL y recoger la suspensión de células en un tubo de 50 mL.
    Nota: Pipeta directamente en el fondo de la fuente - el piso del plato debe quedar más claro de como separar las células. Utilice únicamente el medio que contiene el suero (en lugar de DMEM +), como suero inactiva la tripsina.
  8. Centrifugue la suspensión de células a 3.220 x g a 20 ° C durante 4 minutos.
  9. Quite el sobrenadante y resuspender el precipitado de células en 1 mL previamente calentado NB + H.

6. célula galjanoplastia para culturas de astrositos Final

  1. Contar las células.
  2. Placa de 20.000 células por pocillo en placas de 6 pocillos (en medio NB + H 2 mL por pozo) o 5.000 células por pocillo, en placas de 24 pocillos (en 500 μl de medio NB + H por pozo).
  3. Mantener los cultivos celulares en la incubadora a 37 ° C y 5% de CO2 hasta análisis o tratamiento adicional.
  4. Intercambio media el medio una vez por semana.
    Nota: En ambientes bajos en nutrientes, dejar de astrocitos proliferan pero cualquier restante microglia proliferarán (aunque en nuestra experiencia, no microglia aparecieron en las culturas AWESAM). El intercambio de media la media una vez por semana evita el enriquecimiento de cualquier potencial restante de microglia8y los monocultivos permanecen saludables durante al menos tres semanas.

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Resultados

Astrocitos que son cultivados junto con las neuronas y crecidos en medio de NB + aparecen estrellados después de 2 semanas de la cultura (figura 2). Además de NB + medio, los astrocitos cultivados conjuntamente también están expuestos a factores desconocidos derivados de neurona que probablemente contribuyen a su supervivencia y su morfología. En contraste, los astrocitos MD cultivados en DMEM + como monocultivos (después de la agitación de otros tipos de cél...

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Discusión

Cuatro pasos en el protocolo son fundamentales: 1) preparar la concentración HBEGF y precisamente 5 ng/mL, ya que pequeños incrementos en la concentración pueden conducir a las culturas inmaduras, por ejemplo, 10 ng/mL HBEGF se diferenciará los astrocitos4; 2) evita burbujas en las soluciones que contienen tejido o células, que pueden cambiar el pH e impiden salud astrositos; 3) equilibrando los medios para alcanzar el pH óptimo y la temperatura para el cultivo de astrocitos sanos; 4) int...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Reconocemos que la financiación del Consejo Europeo de investigación (FP7/260916), Alexander von Humboldt-Stiftung (Sofja Kovalevskaja) y la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DE1951 y SFB889).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
0.05% tripsina-EDTAGibco25300054caliente en 37 º C baño de agua antes de usar
0,25% tripsina-EDTAGibco25200-056caliente en 37 º C baño de agua antes
de usar B-27 suplementoGibco17504-04450X
stock GlutamaxGibco35050-061100X
stock Penicilina / estreptomicinaGibco15070-06350 stock; penicilina: 5000 U/ml; estreptomicina: 5000 y micro; g/ml
Medio neurobasalGibco21103049sin L-glutamina
DMEMGibco41966029
HBEGFSigma4643
HEPESGibco15630080
HBSSGibco14170112
FCSGibco10437028
PBSGibco100100491X
100 μ m colador de celdas de nylonBD352360
Trypan BlueSigmaT8154 
Incubadora de cultivos celularesThermo Fisher ScientificHera Cell 240i incubadora
Agitador de laboratorioHeidolphRotamax 120 Uso dentro de la incubadora de cultivo celular
CentrífugaEppendorf5810 R 
de cultivos celulares

Referencias

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