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Artículo de método

En Vivo Detección y análisis de la sumoilación de la proteína Rb en células humanas

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DOI:

10.3791/56096

⸱

2 de noviembre de 2017

 ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, Eye and ENT Hospital of Fudan University, 2Shanghai Key Laboratory of Visual Impairment and Restoration, Fudan University

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Proteínas familiares pequeños modificadores relacionados con ubiquitina (SUMO) se conjugan para los residuos de lisina de las proteínas diana para regular diversos procesos celulares. Este papel describe un protocolo para la detección de la proteína retinoblastoma (Rb) la sumoilación condiciones endógenas y exógenas en células humanas.

Resumen

Las modificaciones post-traduccionales de las proteínas son esenciales para la adecuada regulación de la transducción de señales intracelulares. Entre estas modificaciones, pequeños modificadores relacionados con ubiquitina (SUMO) es una proteína ubiquitin-like que se une covalentemente a los residuos de lisina de una variedad de proteínas diana para regular procesos celulares, tales como la transcripción genética, la reparación del ADN, la proteína interacción y degradación, transporte subcelular y transducción de la señal. El enfoque más común para detectar la sumoilación de la proteína se basa en la expresión y purificación de proteínas recombinantes etiquetadas en bacterias, lo que permite una en vitro reacción bioquímica que es simple y conveniente para abordar los mecanismos preguntas. Sin embargo, debido a la complejidad del proceso de la sumoilación en vivo, es más difícil detectar y analizar proteína sumoilación en las células, especialmente bajo condiciones endógenas. Un estudio reciente realizado por los autores de este trabajo revelaron que la proteína endógena retinoblastoma (Rb), un supresor de tumor que es vital para la regulación negativa de la progresión del ciclo celular, es específicamente sumoiladas en la fase G1 temprana. Este papel describe un protocolo para la detección y análisis de la sumoilación Rb condiciones endógenas y exógenas en células humanas. Este protocolo es apropiado para la investigación fenotípica y funcional de la modificación SUMO de Rb, así como muchos otros dirigidos por el SUMO proteínas, las células humanas.

Introducción

El control preciso de la progresión del ciclo celular en células eucariotas se basa en una red reguladora apretada, que asegura que determinados eventos ocurren en una forma ordenada1,2. Uno de los principales protagonistas de esta red es la proteína del retinoblastoma (Rb), el primer clonado tumor supresor1,3. La proteína Rb se piensa para ser un regulador negativo de la progresión del ciclo celular, especialmente para el G0/G1 a la transición de la fase S y tumor crecimiento4,5. Falta de función de Rb o directamente conduce a la neoplasia intraocular más frecuente en niños, retinoblastoma, o contribuye al desarrollo de muchos otros tipos de cáncer5. Por otra parte, Rb participa en muchas vías celulares incluyendo la diferenciación celular, remodelación de la cromatina y apoptosis mediada por la mitocondria3,6,7.

Modificaciones post-traduccionales juegan un papel fundamental en la regulación de la función de RB8,9. La fosforilación es un tal modificación, y generalmente conduce a la inactivación de Rb. En células de reposo G0, Rb es activa con un nivel bajo de la fosforilación. Como células de progreso a través de la fase G0/G1, Rb es secuencialmente hyper-fosforilado por una serie de kinases de proteína cyclin-dependientes (CDKs) y ciclinas, como la ciclina E/CDK2 y ciclina D/CDK4/6, Rb de inactivar y eliminar su capacidad de reprimir el ciclo celular relacionados con la expresión de gene4,10. RB también podría ser modificado por pequeños modificadores relacionados con ubiquitina (SUMO)11,12,13.

SUMO es una ubiquitina-como la proteína que se une covalentemente a una variedad de proteínas objetivo. Es fundamental para diversos procesos celulares, incluyendo la regulación del ciclo celular, transcripción, localización celular de la proteína y la degradación, transporte y ADN reparación14,15,16, 17 , 18. vía de conjugación el SUMO consiste en la enzima activadora de SUMO E1 dimérica SAE1/UBA2, la única enzima de E2 Conjugación Ubc9, múltiples E3 ligasas y proteasas específicas de SUMO. En general, nacientes proteínas SUMO deben ser proteolytically procesadas para generar la forma madura. El SUMO maduro es activado por el heterodímero E1 y luego transferido a la enzima E2 Ubc9. Finalmente, la glicina c-terminal de SUMO se conjuga covalentemente a la lisina de destino de un substrato, y este proceso es facilitado generalmente por E3 ligasas. La proteína SUMO puede extraerse el sustrato modificado por proteasas específicas. Un estudio previo de los autores de este trabajo reveló que la sumoilación de Rb aumenta su unión a CDK2, lleva a hiper-fosforilación en la fase G1 temprana, un proceso que es necesario para el ciclo de la célula progresión13. También hemos demostrado que la pérdida de Rb sumoilación provoca una proliferación celular disminuida. Por otra parte, recientemente se demostró que la sumoilación de Rb protege la proteína Rb proteasomal facturación, aumentando así el nivel de proteína Rb en células19. Por lo tanto, la sumoilación desempeña un papel importante en la función de Rb en varios procesos celulares. Para estudio adicional la consecuencia funcional y relevancia fisiológica de la sumoilación de la Rb, es importante desarrollar un método efectivo para analizar el estado SUMO de Rb en células humanas o tejidos del paciente.

La sumoilación es un proceso reversible, altamente dinámico. Así, es generalmente difícil de detectar las proteínas SUMO modificado bajo condiciones completamente endógenas. Este artículo presenta un método para detectar endógeno la sumoilación de la Rb. Además, muestra cómo detectar exógeno sumoilación Rb Rb de tipo salvaje y su SUMO deficiente mutación11. En particular, Jacobs et al describieron un método para aumentar la modificación SUMO un sustrato determinado específicamente por Ubc9 dirigido por fusión sumoilación (UFDS)20. Basado en este método, este protocolo describe cómo analizar la sumoilación forzada de Rb y sus consecuencias funcionales. Dado que anteriormente se han descrito cientos de sustratos SUMO y más sustratos putativos de SUMO se han identificado de muchos ensayos de proteómica, este protocolo se puede aplicar para analizar la modificación SUMO de estas proteínas en las células humanas.

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Protocolo

1. detección de endógeno Rb la sumoilación en la fase G1 temprana

  1. sincronización de la cultura y el ciclo celular de la célula.
    1. Las células HEK293 mantener en un medio que contiene Dulbecco ' s Modified Eagle medio (DMEM) suplementado con 1% Pen-Strep y 10% suero bovino fetal (FBS) a 37 ° C y 5% de CO 2 en una incubadora.
    2. Sincronizar las células HEK293 en la fase G0.
      1. Cuenta las células HEK293 utilizando un hemocitómetro y semilla de ~1.5 x 10 7 células en 15 cm plato con medio de cultivo de 25 ml por 24 h antes del tratamiento. Después de alcanzar una confluencia de 70% - 80%, aspirado de la media y lavado las células dos veces con 5 mL precalentado con tampón fosfato salino (PBS).
      2. Añadir 25 mL DMEM que contenía 1% penicilina-estreptomicina e incubar las células a 37 ° C por 72 h. lavar las células de la placa con PBS helado 3 mL. Transferir las células a un nuevo tubo de 5 mL.
      3. Tema una pequeña porción de células para análisis de ciclo celular por citometría de flujo (paso 1.2), recogiendo la mayoría restante de las células por centrifugación a 200 x g durante 5 min a temperatura ambiente y almacenarlas en un congelador de ultra baja temperatura hasta su análisis de Rb sumoilación.
    3. Para obtener la fase G1 las células, al final del proceso de sincronización de G0, quitar el DMEM y agregar medio de cultivo nuevo fresco, permitiendo así que las células HEK293 volver a entrar en el ciclo celular. Luego, recogen las células en diferentes fases de G1 (G1 temprana: 30 min; G1: 2 h) para ciclo celular ensayo análisis y SUMO más.
    4. Sincronizar las células HEK293 en la fase S mediante el método de bloque doble-timidina. Células
      1. células HEK293 crecen a una confluencia de 50% y lavado con PBS precalentadas. Luego agregar medio de cultivo suplementado con timidina 2,5 mM por 18 h (primer bloque).
      2. Quitarlo del medio que contenía timidina y entonces lavan las células dos veces con PBS precalentadas. Agregar medio de cultivo fresco de 14 h a las células.
      3. Deseche el medio con una pipeta y agregar medio de cultivo suplementado con timidina de 2,5 mM para otro 18 h (segundo bloque) antes de realizar un análisis del ciclo celular y la sumoilación Rb.
    5. Sincronización para el G2/M, placa ~1.5 × 10 7 HEK293 las células a un plato de 15 cm con medio de cultivo de 25 mL por 24 h. Luego añadir nocodazole al medio hasta obtener una concentración final de 400 ng/mL. Por último, incubar las células durante 16 horas antes de realizar el análisis del ciclo celular y la sumoilación Rb.
  2. Análisis de ciclo celular por citometría de flujo.
    1. Vuelva a suspender las HEK293 sincronizado en PBS y luego fijar la suspensión de células con helada etanol al 70% durante 2 h a 4 ° C. tenga en cuenta que al minimizar el agrupamiento celular, añadir gota a gota la suspensión de células a la helada 100% etanol para obtener una concentración final de etanol al 70% mientras que suavemente Vortex.
    2. Centrifugar las células durante 5 minutos a 500 x g, luego descartar el sobrenadante cuidadosamente y lavan las células dos veces con PBS. Repita el paso centrífuga.
    3. Añadir 500 μl PBS que contenga la 50 μg/mL ácido nucleico mancha yoduro de propidio, 0,1% Tritón X-100 y 1 μg/mL Rnasa A para las células y mezclar bien. Incube las células durante 15 min a 37 ° C.
    4. Almacenar las muestras a 4 ° C hasta su análisis por citometría de flujo.
  3. Inmunoprecipitación de la proteína Rb endógena.
    1. Preparar el HEK293 lysates de la célula.
      1. Lyse las células HEK293 sincronizadas suspendiendo suavemente volver a ellos en 1 mL de tampón de lisis helada radio-inmunoprecipitación ensayo (RIPA) (tabla 1) que contiene recién agregan 20 mM N-etilmaleimida, un inhibidor de la isopeptidase que podría bloquear proteasas SUMO y SUMO conjugados se estabilizan.
      2. Además homogeneizar las células en hielo por Dounce homogeneización, sonicación o simplemente pasando por 10 veces a través de una aguja de 21 G en una jeringa de 2 mL. Luego, incubar las células en hielo por 5 min
        Nota: El dodecil sulfato de sodio detergente aniónico (SDS) en el almacenador intermediario RIPA es crucial para la posterior determinación de la Rb-SUMO, como podría eliminar la señal inespecífica de SUMO que se deriva de la interacción no covalente entre la proteína Rb y otros SUMO-especies no Rb.
    2. Centrifugue los lysates de la célula a 18.000 x g por 30 min a 4 ° C. transferir el sobrenadante a nuevos tubos de microcentrífuga de 1.5 mL.
      Nota: El protocolo se puede detener aquí. Las proteínas pueden almacenarse a-80 ° C durante al menos 6 meses.
    3. Para preparar el control de entrada de cada muestra para el posterior inmunoblot, guardar una pequeña porción del sobrenadante antes descrita en un nuevo tubo y conservar a -80 ° C.
    4. a los sobrenadantes anteriores, añadir 1 μg de inmunoglobulina G de ratón no específica (IgG) de la misma especie e isotipo como el anticuerpo monoclonal de la Rb, 20 μl de la mezcla de 50% proteína A/G-sepharose. A continuación, incubar durante 1 h a 4 ° C con rotación suave.
    5. Centrifugar las muestras a 3.000 x g durante 3 min a 4 ° C. cuidadosamente recoger el sobrenadante sin molestar a los granos y transferirlos a nuevos tubos de microcentrífuga de 1,5 mL. A cada una de las muestras, añadir 5 μl Rb primaria del anticuerpo y 40 μl de proteína 50% de la mezcla A/G-sepharose. A continuación, incubar durante una noche a 4 ° C con rotación suave.
    6. Recoger los granos por centrifugación a 3.000 x g durante 3 min a 4 ° C y retire con cuidado el sobrenadante mediante pipeteo. Tenga en cuenta que para evitar la pérdida de grano, no aspirar seco granos.
    7. Lave los granos cuatro veces con 1 mL de la solución RIPA. Cada vez, mezcle los tubos bien por rotación a 4 ° C por 15 minutos recogen los granos por centrifugación a baja velocidad a 3.000 x g durante 3 min a 4 ° C y luego descartar los sobrenadantes.
    8. Después de quitar sobrenadante del último lavado, vuelva a suspender las cuentas en 30 μL 1 x de tampón de carga de sodio dodecil sulfato-poliacrilamida gel electroforesis (SDS-PAGE) (tabla 1) y mezclar bien.
      1. Incubar los tubos a 100 ° C en un calor bloquean por 10min Centrifugue las muestras a 12.000 x g durante 1 min para que sedimenten los granos. Cuidadosamente y recoger el sobrenadante sin molestar a los granos y transferirlas a tubos de microcentrífuga de 1,5 mL.
    9. Analizar las muestras por gradiente de 4% - 20% SDS-PAGE gel y Western blot o almacenar a-20 ° C para su posterior uso.

2. Análisis de la etiqueta 6XHis exógeno Rb la sumoilación en células humanas

  1. cultura y transfección de la célula.
    1. Semilla ~ 6 × 10 6 HEK293 células en 10 cm plato e incuban durante 24 h en medio de cultivo bajo condiciones de cultivo de células normales para adquirir células confluentes 75% - 85%. Antes de la transfección, retire el medio de crecimiento y agregar 6 mL de suero reducido precalentado medio (véase Tabla de materiales) y luego coloque los platos en la incubadora.
    2. Ensayo de sumoilación constitutiva para la Rb, añadir 15 μg de etiqueta 6XHis Ubc9 WT, Rb, Rb-Ubc9-C93S, Ubc9-WT y Ubc9-C93S plásmidos en 500 μl de medio de suero reducido en tubos de microcentrífuga de 1,5 mL, respectivamente.
      1. Para analizar la conjugación de SUMO del tipo salvaje Rb y sus mutantes defectuosos de la sumoilación, mezclar 10 μg de cada plásmido WT Rb o Rb-K720R etiqueta 6XHis junto con GFP SUMO1 (10 μg) en 500 μl reduce medio suero de microcentrífuga de 1,5 mL tubos de 13.
    3. Mientras tanto, en un tubo separado, mezcle 50 μl de reactivo de transfección (véase Tabla de materiales) en 500 μl reducido medio de suero e incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos
    4. Completamente combinan los dos tubos separados que se describe anteriormente, incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos agregar el transfection complejos reactivo/plásmido a las células y continúan cultura 8 h 5% CO 2 y 37 ° C.
    5. Sustituir medio reducido suero con medio de cultivo e Incube las células bajo condiciones de cultivo normales durante 48 h después de la transfección.
  2. Níquel tire de la afinidad de la proteína Rb etiqueta 6XHis.
    1. Lyse las células HEK293 transfected y extraer las proteínas totales como descrito sección 1.3.1.
    2. Centrífuga los lysates de la célula a 18.000 x g durante 30 min a 4 ° C. cuidadosamente recoger el sobrenadante y transferir a tubos limpios.
      Nota: La proteína puede ser congelada en este momento más de 6 meses a -80 ° C.
    3. Para preparar el control de entrada de cada muestra para el posterior inmunoblot, guardar una pequeña porción de los sobrenadantes descrito anteriormente a un nuevo tubo y conservar a -80 ° C.
    4. Lavado 25 μl 50% níquel perlas de agarosa (Ni-NTA) ácidos nitrilotriacético con el almacenador intermediario RIPA dos veces en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL para cada muestra. Recoger los granos por centrifugación a 3.000 x g durante 3 min a 4 ° C.
    5. Imidazol agregue 1 M a cada muestra para obtener una concentración final de 10 mM. Luego, agregar cada muestra al tubo que contiene las perlas de agarosa preparadas de Ni-NTA.
    6. Incubar los granos y los lisados por 2 h a 4 ° C con rotación suave. Hacer girar los granos a 3.000 x g durante 3 min a 4 ° C y retire cuidadosamente los sobrenadantes mediante pipeteo. Para evitar pérdida de grano, no aspirar seco granos.
    7. Lavar los granos con 1 mL de tampón de lavado que contiene imidazol 20 mM (tabla 1). Cada vez, mezcle los tubos bien por rotación a 4 ° C durante 15 minutos recoge los granos girando a 3.000 x g durante 3 min a 4 ° C y descartar los sobrenadantes.
    8. Después del último lavado, Añadir 30 μl de elución Tampón Imidazol que contiene de 250 mM (tabla 1) a cada muestra y película para mezclar. A continuación, incubar durante 20 min a 4 ° C para eluir las proteínas.
    9. Mezclar cada muestra con el tampón de carga de 6 × SDS-PAGE (tabla 1). Luego, incubar los tubos a 100 ° C en un bloque de calor durante 10 minutos
    10. Centrifugar a 12.000 x g durante 1 min para que sedimenten los granos. Cuidadosamente y recoger el sobrenadante sin molestar a los granos y transferir las muestras a tubos de microcentrífuga de 1,5 ml. Las muestras pueden ser analizadas por Western blot o almacenadas a-20 ° C para su posterior uso.

3. Western Blot

  1. cargar la inmunoprecipitación o tire hacia abajo de las muestras obtenidas de los pasos anteriores en gradiente geles de SDS-PAGE 4-20%. Realizar la electroforesis a 120 V durante 90 minutos separar las proteínas.
  2. Transferir las proteínas desde el gel a una membrana (PVDF) de difluoruro de polivinilideno electroblotting a 300 mA durante 90 minutos a 4 ° C utilizando el método de transferencia del tanque. Bloquear la membrana PVDF en tampón de bloque que contiene 5% de leche descremada (tabla 1) por 1 h a temperatura ambiente.
  3. Incubar la membrana con el anticuerpo primario en tampón de dilución del anticuerpo que contiene 3% albúmina de suero bovino (BSA) (tabla 1) durante la noche a 4 ° C. Para anticuerpos primarios, utilizar una concentración de trabajo de 0,5 μg/mL (anticuerpo anti-SUMO1), o una dilución de 1: 2000 (anticuerpos anti-Rb y anti-Tubulino) y 1:5,000 (anti-GFP y anticuerpo anti-su).
  4. Lavar la membrana 3 x 10 min cada tiempo con 1 x solución salina tamponada con tris buffer de interpolación (TBST) (tabla 1). Incubar la membrana con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa HRP específicos de especies 1:5,000 diluido en tampón de bloque que contiene 5% de leche descremada (tabla 1). Lavar la membrana 3 x 10 min cada vez usando buffer de x TBST 1.
  5. Incubar la membrana con solución de la quimioluminescencia realzada (ECL). Cubrir la membrana con envoltura de plástico y exponer a la película de rayos x dependiendo de la fuerza de la señal.

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Resultados

Para detectar la sumoilación Rb endógena durante la progresión del ciclo celular, este estudio sincronizado primero las células HEK293 en cinco diferentes etapas del ciclo celular (G0, temprana G1, G1, S y G2/M) como se describe en la sección de protocolo de este trabajo. La calidad de la sincronización fue confirmada mediante el uso de la tinción de ácido nucleico con yoduro de propidio seguido por análisis de citometría de flujo (figura 1). A continuación, ...

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Discusión

Este papel describe un protocolo para detectar y analizar la sumoilación endógena de Rb en células humanas. Como este método se centra específicamente en la proteína endógena de la Rb sin cualquier alternancia de señal relacionadas con SUMO mundial, es una herramienta importante para la investigación de modificación de la Rb-SUMO bajo circunstancias fisiológicas totalmente naturales.

Para lograr este objetivo, es importante tener en cuenta que: 1) aunque SUMO comprende cuatro isoformas (SUMO1-...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este estudio fue apoyado por subvenciones de la ciencia y tecnología Comisión de Shangai (Grant no. 14411961800) y la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (Grant no. 81300805).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM)Thermo Fisher Scientific11995065
Opti-MEM Thermo Fisher Scientific 31985070
Suero fetal bovino (FBS)Thermo Fisher Scientific26140079
Penicilina-estreptomicinaThermo Fisher Scientific15140122
solución salina tamponada con fosfato (PBS)Thermo Fisher Scientific10010023
Tripsina-EDTAThermo Fisher Scientific25200056
TimidinaSigmaT9250
NocodazolSigmaM1404
yoduro de propidioThermo Fisher ScientificP3566
Triton X-100 AMRESCO694
RNasa A Thermo Fisher ScientificEN0531
N-etilmaleimidaSigmaE3876 
Sulfato de dodecilo de sodio (SDS)AMRESCOM107
Nonidet P-40 Sustituto (NP-40)AMRESCOM158
inhibidor de la proteasa5892970001
ratón Inmunoglobulina G (IgG)Santa Cruz Biotechnologysc-2025
Rb anticuerpode señalización celular#9309
Proteína A/G-Sepharose BeadsSanta Cruz Biotechnologysc-2003
Lipofectamine-2000 Thermo Fisher Scientific11668019
Ácido nitrilotriacético de níquel (Ni-NTA) Perlas de agarosaQiagen30230
ImidazolSigmaI0250
4%-20% Gradiente SDS-PAGE GelBIO-RAD4561096
Difluoruro de polivinilideno (PVDF) MembranaMilliporeIPVH00010
Tween-20AMRESCOM147
Anticuerpo de tubulinaAbmartM30109
Anticuerpo SUMO1Thermo Fisher Scientific33-2044
Anticuerpo GFPAbmartM20004
Anticuerpo secundario de peroxidasa de rábano picante (HRP)Jackson ImmunoResearch Laboratories715-035-150
Kit de quimioluminiscencia mejorada (ECL)Thermo Fisher Científico32106
Roche Tecnología

Referencias

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