Este trabajo presenta un protocolo paso a paso para la estimación imparcial estereológicos del número de células neuronales dopaminérgicas en la sustancia negra de ratón utilizando equipo de microscopía estándar (es decir, un microscopio de luz, una tabla de objeto motorizado (x, y, z plano) y software de dominio público para el análisis de imagen digital.
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Artículo de método
Estereológicos estimación de número de la neurona dopaminérgica en el Nigra del Substantia de ratón usando el fraccionador óptico y equipo de microscopía estándar
En este artículo
Resumen
Resumen
En la investigación de la enfermedad de Parkinson preclínica, el análisis del tracto nigroestriatal, incluyendo la cuantificación de la pérdida de neuronas dopaminérgicas en el nigra del substantia, es esencial. Para estimar el número de neuronas dopaminérgicas total, estereología imparcial usando el método de fraccionamiento óptico es considerado el estándar de oro. Porque la teoría detrás del método óptico fraccionador es complejo y porque estereología es difícil de lograr sin equipos especializados, existen varios sistemas de estereología completa disponible en el mercado que incluyen el software necesario, puramente para celular con razones. Desde adquirir una configuración de estereología especializados no siempre es factible, por muchas razones, este informe describe un método para la estimación Estereológicas de células neuronales dopaminérgicas cuenta con equipo de microscopia estándar, incluyendo un microscopio de luz, un motorizado de tabla de objeto (x, y, z plano) con software tratamiento de imágenes y una computadora para el análisis. Se da una explicación paso a paso sobre cómo realizar Estereológicas cuantificación mediante el método de fraccionamiento óptico, y se proporcionan archivos preprogramados para el cálculo del estimado del recuento. Para evaluar la exactitud de este método, se realizó una comparación con datos obtenidos de un aparato de estereología comercialmente disponibles. Un número similar de células fueron encontrado usando este protocolo y el dispositivo de la estereología, demostrando así la precisión de este protocolo de estereología imparcial.
Introducción
La cuantificación del número de célula neuronal es fundamental en la investigación de la enfermedad de Parkinson preclínica para determinar el nivel de la neurodegeneración en la substantia nigra (SN)1,2. La estimación imparcial Estereológicas del número de células en una región de interés se considera el estándar de oro3,4,5.
Antes del advenimiento de estereología imparcial, se evaluó el número de neuronas en secciones mediante la manipulación de células contadas perfiles para corregir par....
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Protocolo
se siguieron todas las guías internacionales, nacionales o institucionales aplicables para el cuidado y uso de animales. El protocolo fue aprobado por las autoridades locales en el Regierung von Unterfranken, Würzburg, Alemania.
1. procesamiento de tejido e inmunohistoquímica
- Euthanize ratones con CO 2 o cualquier otro método aprobaron.
- Transcardially de ratones machos de C56Bl/6N de 12 semanas de edad Perfuse seis con 10 mL de 0.1 M tampón fosfato salino (PBS) con una aguja de 25 G y una bomba de infusión, seguido de 70 mL de paraformaldehído al 4% (PFA) en PBS de 0,1 M.
PRECAUCIÓN: ....
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Resultados
El método presentado, el número estimado de TH + las neuronas dopaminérgicas en la derecha SN oscilado entre células 7.363 y 7.987 y en la izquierda SN, entre las células 7.446 y 7.904. Así, la media de las neuronas dopaminérgicas (± SEM) fue 7.647 ± 83 células para la derecha SN y 7.675 ± 66 para la izquierda SN. La CE calculado para cada animal fue inferior a 0.08 (gama: 0.079 0.073) (figura 7). Para determinar la comparabilidad de este método con sistemas .......
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Discusión
Estereología se inicia con el proceso de tejido. La serie corte de tejido SN debe realizarse cuidadosamente para evitar la pérdida de las secciones durante el análisis estereológicos. Además, un paso esencial es marcar un hemisferio para distinguir la derecha de la izquierda SN realización de estereología. Colocar un pequeño agujero en la parte superior del tronco encefálico genera los mejores resultados en el estudio presentado. Por otra parte, desde el trabajo con las exigencias de método fraccionador óptico que el tej.......
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Divulgaciones
C. W. I. ha servido en tableros de científicos por Merz Pharmaceuticals, LLC y TEVA; ha recibido fondos para viaje de Ipsen, Merz Pharmaceuticals, LLC y Allergan, Inc.; y ha recibido honorarios de orador de Merz, TEVA y Allergan, Inc. fuera de la obra presentada. J. V. ha servido como un consultor de Boston Scientific, Medtronic y AbbVie y ha recibido honorarios de Medtronic, Boston Scientific, AbbVie, Bial, Allergan y GlobalKinetics fuera de la obra presentada.
Agradecimientos
Los autores agradecemos a Keali Röhm, Louisa Frieß y Heike Menzel por su asistencia técnica especializada; a Helga Brünner para el cuidado de los animales; y Chistopher S. Ward para la generación y distribución del disector óptico grid plugin para el software ImageJ.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| ratón Paxinos | El cerebro del ratón George Paxinos Keith B.J.FranklinCopyright @2001 por Academic Press CD Rom designet & creado por Paul Halasz | ||
| cortador de matriz cerebral | Zivic Instruments BSMAS | 001-1 | |
| paraformaldehído | Merck | 1040051000 | |
| sacarosa /D(+) Sacarosa | Roth | 4621.1 | |
| isopentano | Roth | 3927.1 | |
| glicerol | Merck | 1040931000 | |
| Etanol | Sigma Aldrich | 32205-1L | |
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
| >fosfato tamponado con solución salina ingredientes: | |||
| albúmina sérica bovina | Sigma | A4503-100G | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-100ml | detergente |
| 3,3-Diaminobenzidina-tetraclorhidrato/DAB comprimidos 10mg pH 7.0 | Kem En Tec | 4170 | |
| H2O2/ Peróxido de hidrógeno 30% | Merck | 1072090250 | |
| avidina/biotina reactivo | Thermo Scientific | 32050 | Standard Ultra Sensitive ABC Tinting Kit, 1:100 |
| anticuerpo anti ratón tirosina hidroxilasa | ABCAM | Ab112 | 1:1000 |
| biotinilado cabra anti-conejo IgG H+L | vectoriales BA-1000 | 1:100 | |
| StereoInvestigator versión 11.07 | MBF | ||
| Microscopio BX53 | Olympus | ||
| Visiview | Visitron Systems GmbH | 3.3.0.2 | |
| Axiophot2 | Zeiss | ||
| ImageJ software | NIH | Versión 4.7 | |
| Tissue-TEK OCT | Sakura | 4583 | |
| rejilla de hielo | |||
| Wayne Rasband | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/graphic-overlay.html | ||
| complemento de contador de celdas | Kurt de Vos | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html). | |
| disector óptico macro | Christopher Ward | ||
| C57Bl/6N ratones macho | Charles River, Alemania | ||
| Portaobjetos recubiertos SuperFrost Plus | Langenbrinck, Alemania | ||
| Aguja 25G Microlance 3 | BD | 300400 | |
| REGLO Bomba de infusión analógica | Ismatec | ISM 829 | |
| Sistema StereoInvestigator | StereoInvestigator versión 11.07 | ||
| Microscopio BX53 Microscopio | BX53 | ||
| estereología | Visiview | ||
| Axiophot2 | Axiophot2 |
Referencias
- Ip, C. W., et al. AAV1/2-induced overexpression of A53T-alpha-synuclein in the substantia nigra results in degeneration of the nigrostriatal system with Lewy-like pathology and motor impairment: a new mouse model for Parkinson's disease. Acta Neuropathol Commun. 5 (1), 11(2017).
- Ip, C. W., ....
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Reimpresiones y permisos
