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Artículo de método

Recuento de proteínas en las células con Microarrays de gota direccionable

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DOI:

10.3791/56110

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6 de julio de 2018

 ,  ,  , 
1Institute of Chemical Biology, Department of Chemistry, Imperial College London

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Aquí presentamos gotita direccionable microarrays (ADMs), un método de arreglo de discos basado en la gota capaces de determinar la abundancia absoluta de proteínas en las células. Demostramos la capacidad de ADMs para caracterizar la heterogeneidad en la expresión de la proteína p53 supresora tumoral en una línea celular de cáncer en humanos.

Resumen

Comportamiento a menudo celular y respuestas celulares se analizan a nivel de población donde se agruparon las respuestas de muchas células como resultado promedio enmascara el comportamiento rico sola célula dentro de una población compleja. Tecnologías de detección y cuantificación de la proteína unicelular han hecho un impacto notable en los últimos años. Aquí describimos una plataforma de análisis práctico y flexible única célula basada en microarrays gotita direccionable. Este estudio describe cómo los números de copia absoluta de proteínas objetivo pueden medirse con una resolución de única célula. El tumor supresor p53 es el gen más comúnmente mutado en el cáncer humano, con más del 50% total de casos de cáncer exhibiendo un patrón de expresión de p53 no saludables. El protocolo describe los pasos para crear 10 gotitas de nL en el que las células cancerosas humanas solo son aisladas y se mide el número de copias de la proteína p53 con la resolución sola molécula para determinar precisamente la variabilidad en la expresión. El método puede aplicarse a cualquier tipo de células incluyendo el material principal para determinar el número de copia absoluta de cualquier proteínas target de interés.

Introducción

El objetivo de este método es determinar la variación en la abundancia de una proteína de la blanco en una población de células con una resolución de única célula. Análisis de célula proporciona una serie de beneficios que no están disponibles con métodos bioquímicos de formación tradicional. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 en primer lugar, trabajar en el nivel unicelular puede capturar la rica heterogeneidad de una población celular que de lo contrario se perdería por el promedio que se produce con técnicas bioquímicas de formación tradicional. La mayoría de los métodos bioquímicos de caballo de trabajo trabaja con la mayor parte, que requieren, como a menudo lo hacen, millones de células para producir un resultado. Por supuesto, las consecuencias de la evaluación de las poblaciones de toda la célula depende de varios factores, por ejemplo, la heterogeneidad en la expresión de la proteína donde pueden perderse algunas características importantes de la distribución de la abundancia de la proteína. Desde una perspectiva práctica, la sensibilidad requiere de técnicas unicelular hacerlos capaces de trabajar con cantidades de material biológico que no es suficiente para incluso las más sensibles a granel técnicas de función. Un ejemplo clave de esto es el estudio de tipos raros de la célula tales como células del tumor (CTC) donde incluso para los pacientes con un pronóstico desalentador pronóstico menos 10 CTC puede estar presente en la sangre solo 7,5 mL sacar de circulación. 6 aquí presentamos la metodología necesaria para realizar las mediciones de proteína unicelular mediante un volumen reducido ensayo basados en anticuerpos empleando gotas aceite tapa impresa en un microarray de anticuerpo.

Plataformas de gota microfluídicos son alto rendimiento, capaz de generar miles de gotas por segundo y capaz de aislar y cultivar incluso, las células en gotas individuales a realizar una amplia gama de Ensayos bioquímicos. Técnicas basadas en la gota son adecuadas para el análisis unicelular,7,8,9 con notables ejemplos recientes incluyendo DropSeq10 y inDrop11, que han sido ayudados grandemente por el poder de técnicas de amplificación. La limitada cantidad de material y no métodos de amplificación para las proteínas hacen única célula proteómica especialmente desafiante.

Gotas pueden ser analizadas por una serie de métodos y microscopía de fluorescencia ha sido ampliamente utilizado. Sola molécula técnicas como microscopía de fluorescencia (TIRF) de reflexión interna total permite moléculas fluorescentes para visualizarse con cociente signal-to-noise sin precedentes. 12 debido al decaimiento exponencial del campo evanescente, sólo fluoróforos en gran proximidad a la superficie (orden de 100nm) muy contentos haciendo TIRF una buena estrategia en la detección de pequeñas cantidades de una molécula de la blanco en una mezcla compleja. La fuerza inherente de seccionamiento óptica de TIRF también ayuda a evitar los pasos de lavado y ensayo de límites de tiempo y la complejidad. Sin embargo, TIRF requiere superficies planas y ejemplos de microscopía TIRF aplicado a las gotitas de flujo implican la formación de una superficie plana que a la imagen. 13 para ello, técnicas de proteómica celular solo diseño a menudo chips microfluídicos en agentes de superficie inmovilizado captura en un formato de microarrays. 4 , 14

Las gotitas, ellos mismos, se pueden formar en arreglos de discos en superficies planas, gotita llamada microarrays. 15 , 16 , 17 organizar espacialmente gotitas en arreglos de discos permite que sean convenientemente indexadas, fácilmente monitoreado en el tiempo, individualmente dirigida y, si es necesario, obtenido. Microarrays de gota puede alcanzar una alta densidad de micro reactores con miles de elementos por chip ya sea libre o apoyado por las estructuras de los micropocillos. 18 , 19 , 20 , pueden ser formados por la deposición secuencial por robots de manejo de líquidos, observadores de inyección de tinta, en contacto con microarrayers21,22,23,24,25, 26 o se puede uno montar en superficies tales como superhydrophillic puntos con motivos sobre una superficie superhidrófobos. 27 , 28 , 29

Con estas consideraciones en mente, direccionable gotita Microarrays (ADMs) fueron diseñados para combinar la versatilidad, direccionamiento espacial y volúmenes reducidos de microarrays de gota con la sensibilidad de la microscopía TIRF de sola molécula a cuantitativamente medir la abundancia de la proteína. 5 ADMs permiten análisis de la célula formando un microarray de gotas que contienen las células sobre un microarray de anticuerpo, que luego es cubierto con aceite para evitar la evaporación. Los volúmenes de las gotas son discretos para evitar pérdida de muestra, que de lo contrario se lograría por la en-viruta valvulado en microfluídica de flujo continuo. 30 la cantidad absoluta de proteínas blanco de una sola célula es extremadamente pequeña; sin embargo, el reducido volumen de las gotas permite la relativamente alta concentración local a fin de que se detectan mediante un análisis de anticuerpos del emparedado - anticuerpo es inmovilizado en una región distinta, o de punto, sobre una superficie que capta proteínas que a su vez se une a un anticuerpo de detección fluorescente etiquetado presente en el volumen de la gota. Como un enfoque libre de etiqueta (es decir, proteína de objetivos no es necesario etiquetar directamente), ADMs son generalmente aplicables para el análisis de células a partir de fuentes primarias, tales como sangre procesada, es necesario bien aspirados y biopsias de tumor disociado, así como las células de cultura y los lisados.

Medir la variación en la abundancia de proteínas a través de una población celular es importante en la determinación de la heterogeneidad en la respuesta, por ejemplo, a una droga y ayudará en la provisión de información sobre las funciones celulares y vías, evaluación de subpoblaciones y su comportamiento, así como identificar eventos raros que lo contrario serían ser enmascarados por métodos a granel. Este protocolo describe cómo producir y utilizar gota direccionable microarrays para determinar cuantitativamente la abundancia de la transcripción factor p53 en células cancerosas humanas y puede ser utilizado para investigar el papel de p53 en respuesta a los fármacos quimioterapéuticos. La proteína Diana es determinada por la opción de captura y detección de anticuerpos y puede modificarse para incluir más o diferentes objetivos. Se proporcionan instrucciones para construir un aparato sencillo que incorpora una boquilla concéntrica de consumibles de laboratorio general al array manualmente 10 gotitas de nL con aceite. Se describe el proceso completo experimental por el que cada gota se carga entonces con una sola célula, que luego es lisada y la expresión de proteína determinada con la resolución sola molécula mediante microscopía TIRF.

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Protocolo

1. preparación

  1. Hacer virutas y microarrays de anticuerpos impresión
    1. Colocar un aislador de adhesivo acrílico y silicón a un cubreobjetos funcionalizado para apoyar un microarray de anticuerpo. Esto se conoce como el chip.
      Nota: Varios químicos superficiales han sido probados para su conveniencia con gotitas direccionables. 5 química superficial deben optimizarse para agentes alternativos de captura. Aisladores de ADM están disponibles comercialmente o pueden ser producidos por láser corte de acrílico (CAD para aislador utilizado en este trabajo se ofrece como una descarga de archivo, consulte el Archivo de código suplementario).
    2. Conecte el microarrayer y ajuste la humedad hasta un 75%.
      Nota: humedad relativa reduce la evaporación de la solución de impresión de la espiga de microarrays y reduce la variación intra y inter spot.
    3. Limpie la clavija de microarrays en pin solución durante 5 minutos de limpieza por ultrasonidos. Enjuague el pasador con agua ultra puro con una botella de lavado y secado con nitrógeno.
      Nota: Suspendido el pin que sumerja solamente la punta del pin. Un portaobjetos de microscopio con un sistema debidamente perforado de agujeros ayudarán si no puede obtenerse un porta.
    4. Tomar 5 mL de buffer de impresión que consta de 3 × tampón de citrato salino-sódico (SSC), betaína de 1,5 M con 0.01% sodio dodecil sulfato (SDS). Almacenar a 4 ° C indefinidamente.
    5. Para preparar una solución de impresión, descongelar el anticuerpo anti-p53 (p53/Mdm2 ELISA kit; vea la tabla de materiales) alícuotas almacenadas a-80 ° C. Mezcla 1:1 con el tampón para impresión a una concentración final de 0,5 mg/mL. Carga 5-10 μl de la solución de impresión en una placa bien 384 utilizando una micropipeta y colocar en el microarrayer.
    6. Carga chips ensamblados en el paso 1.1.1 el microarrayer. Programa microarrayer imprimir puntos en las coordenadas definidas por el centro de cada pozo del aislador.
      Nota: Microarrayers emplean una gama de, predominantemente, software propietario y por lo que el lector se recomienda consultar la literatura relevante. Microarrays para el aislador ADM en el archivo de CAD en el paso 1.1.1 se compone de elementos rectangulares; se proporcionan las distancias pertinentes.
    7. Almacenar las virutas en recipientes herméticos y envolver con papel de aluminio. Almacenar a 4 ° C hasta 6 semanas.
      Nota: La hoja es para prevenir cualquier daño de la foto. Almacenamiento a 4 ° C limita la tasa de degradación de las biomoléculas y las reacciones perjudiciales que pueden actuar para reducir la actividad de microarrays. Un recipiente hermético permite virutas se equilibren a temperatura ambiente antes de usarlo sin condensación formando en la superficie del chip. Impresión de microarrays contacto explota la tensión superficial y adhesión entre la solución de impresión y el sustrato de impresión para producir manchas. Impresión o borrar normalmente se requiere para eliminar el exceso de solución del pin de microarrays a ceder puntos uniformemente tamaños. No descarte el sacrificio cubreobjetos previa ya que puede ser utilizado para evaluar la calidad del lote.
  2. Preparar jeringas, tubo y concéntrica boquilla para dispensar gotas direccionables
    1. Desmontar 100 μl (para la gota acuosa) y 1 mL (para el aceite tapado) cristal jeringas Hamilton y enjuague las piezas con agua destilada H2O.
    2. Alimentación de una longitud de 100 mm de 150 μm ID/360 μm OD fundido tubería de silicona a través de una longitud de 40 mm de 1,0 mm ID, 1/16 "tubo PFA OD hasta que sobresalga 2 mm. Esto formará la boquilla concéntrica.
    3. Aplique una capa delgada de pegamento del cianocrilato al extremo de una punta de pipeta 10 μl e inserte la pieza de 40 mm de 1,0 mm ID, 1/16 "tubería de PFA de OD. Si es necesario, vuelva a colocar el tubo de sílice fundida para mantener una saliente de 2 mm de la boquilla antes de los sistemas adhesivos.
    4. Inserte el otro extremo de lo capilares de sílice fundida en el extremo de una longitud de 200 mm de 0,014" ID/0.062" OD tubo de PTFE y conéctelo a una 100 μl jeringa Hamilton llena con 4% albúmina de suero bovino (BSA) en tampón fosfato salino (PBS) (PBSA).
      Nota: Las proteínas y otras especies bioquímicas específicamente no puede obligar a las superficies y pueden perdidos o desnaturalizados. BSA se utiliza para 'bloquear' las superficies para minimizar el atascamiento no específico por sacrificio obligatorio para esas superficies.
    5. Introduzca una longitud de 400 mm de tubo de 1,0 mm ID/2.0 mm OD FEP en una punta de pipeta de 200 μL hasta que se forme un sello. Aplique una capa delgada de pegamento del cianocrilato a la otra punta de la pipeta de 200 μl y este empuje en el primer Consejo para fijar la tubería en su lugar. Conecte el extremo abierto de la tubería de FEP OD 1.0mm ID/2.0 mm a un 1 mL jeringa Hamilton llena con aceite mineral.
    6. Inserte el montaje de punta de pipeta μl 200 10 μl Punta de la pipeta de la tobera concéntrica. Coloque las jeringas en bombas de jeringas separadas como deben funcionar independientemente.
    7. Llene la jeringa de 100 μl con solución al 4% PBSA bloqueo. Vuelva a colocar y lave la tubería 'acuosa' con la solución de bloqueo. Repetir dos veces para un total de 3 colores.
    8. Llene la jeringa de 100 μl con 0.125 μg mL-1 detección anticuerpo (anti-p53 anticuerpo (-1) con Alexa 488) en 4% PBSA y vuelva a colocar la tubería. Vuelva a colocar solución de bloqueo en la tubería de suministro 25 solución de anticuerpo de detección μl.
    9. Enjuague el tubo de 'oil' con aceite mineral hasta que todas las tuberías y el inyector se llena de aceite. Llenar la jeringa de 1 mL con aceite mineral y vuelva a colocar la tubería. Asegure el tubo y la boquilla a un manipulador XYZ.
  3. Prepararse microinyectora y amalgamas dentales
    Nota: Siguientes pasos hacen referencia específica a los componentes de la microinyectora y micromanipulador aparato especificado en la tabla de materiales, pero son generalmente aplicables a dichos aparatos.
    1. Montar la microinyectora conectando la tubería de la presión y el capilar.
    2. Lentamente gire el pistón hasta que el aceite mineral se llena completamente la línea.
    3. Monte el soporte del tubo capilar en el Monte de cabeza de traducción.
    4. Fijar el tubo capilar en el porta capilar con el cabezal de agarre.
    5. Pipetear una solución de 4% PBSA en uno de los pozos del aislador.
    6. Traducir mediante el micromanipulador y sumerja la punta del tubo capilar en la solución.
    7. Llene lentamente el tubo capilar con 4% PBSA y deje de bloquear por 10 min.
    8. Expulse el microcapillary y girar el módulo de traducción para que la Asamblea está clara de la viruta.

2. formar gotitas direccionables y carga con las células

  1. Forma de gotitas direccionables
    1. Fije el chip en la platina del microscopio.
      Nota: El microscopio es una fluorescencia invertida microscopio automatizado capaz de sola molécula TIRF equipado con un una etapa XY codificada y un electrón multiplicando cámara de dispositivo de carga acoplada (EM-CCD).
    2. Registrar las coordenadas de fase microscopio de cada punto de la matriz mediante el software de control automatizado del microscopio.
    3. Encuentra el manipulador XYZ en la platina del microscopio. Coloque la boquilla en un ángulo de 50-60°. Asegúrese de que la boquilla tiene suficiente longitud y la separación a la viruta. Conjunto de la 'acuosa' y 'aceite' jeringa bombas para despachar 10 nL 100 μl/min y 5 μl a 100 μl/min, respectivamente.
      Nota: Durante la preparación, la solución acuosa a la cabeza de la boquilla puede secar.
    4. Pipetear la solución acuosa hasta que una gota de líquido es visible en la cabeza de la boquilla. Frote con un paño libre de polvo para quitarlo.
      Nota: Dependiendo del número de condiciones de investigación, reservar un número de pozos que sirven como depósitos para las células. Para un sola celda línea tipo será suficiente un solo depósito.
    5. Mediante el software de control de microscopio automatizado, establece las coordenadas de fase microscopio en un lugar de anticuerpo en la matriz y el enfoque en la superficie del cubreobjetos.
    6. Cuidado de no perturbar el terreno, con el manipulador XYZ, alinee la punta capilar de vidrio de la boquilla concéntrica al lado del lugar de anticuerpo y dispensar 10 nL de solución acuosa. Sin mover las etapas, dispensar 5 μl de aceite a la tapa de la solución acuosa. Lentamente Levante la boquilla de la gota y pasar a la siguiente también.
    7. Repita el paso 2.1.6 para todos los puntos de anticuerpo en la matriz.
    8. Después de 30 min, imagen de todos los puntos de la matriz mediante el software de control automatizado del microscopio para determinar el fondo de las moléculas individuales a cada punto antes de cargar las células anticuerpo.
  2. Gotas direccionables con células de carga
    1. Retirar los frascos de cultivo celular de la incubadora y separar las células con solución de tripsina/EDTA.
      Nota: En este estudio, el ser humano colon línea celular de carcinoma fue utilizada y cultivado usando modificado águilas medio (DMEM de Dulbecco) suplementado con suero bovino fetal 10% (v/v) (FBS) en un incubador de CO2 .
    2. Si es necesario, tinción fluorescencia células.
      1. Resuspender las células en una solución de 0.125 μg/mL de anticuerpo de detección (anti-p53 anticuerpo (-1) con Alexa 488) en 10% FBS en medios L-15. Para asegurar una suspensión unicelular, filtrar la solución de células a través de un tamiz de 40 μm pitch celular.
    3. Contar las células usando un hemocitómetro y diluir o concentrar la solución de células a una concentración de 25-400 x 103 células/mL. Esto asegura que ese sedimento de células con suficiente espacio para manipular cómodamente el microcapillary.
    4. Carga las células en gotas direccionables desde el embalse de celda utilizando el instrumental quirúrgico y microcapillary.
      Nota: Las células no adherente pueden ser cargadas a granel en la micropipeta y dispensado uno a uno en gotitas direccionables. A pesar de tratamiento superficial de bloqueo, líneas de células adherentes tienden a no específicamente se adhieren a la pared interna de la microcapillary de vidrio y se pierden.
    5. Utilizando un objetivo de × 10 para observar, utilice la microinyectora para aspirar una sola celda en la microcapillary de la reserva de la célula.
    6. Almacenar las coordenadas de fase instrumental quirúrgico si se utiliza una etapa de manipulador electrónico o nota manualmente la posición de z.
    7. Retraiga la micropipeta por traducirlo hacia arriba para despejar la altura de 1 mm de la viruta. Realizar esto manualmente con una palanca de mando o automáticamente mediante la función de 'Expulsión' de una etapa de manipulador electrónico.
    8. Conjunto de que la etapa se coordina para que de una gota direccionable el usar microscopio control software automatizado. 'Inyectar' la micropipeta por regresar a la posición de z almacenada (o conocida). Realizar esto manualmente con una palanca de mando o automáticamente si se utiliza una etapa de manipulador electrónico.
      Nota: El microcapillary perforar el aceite tapado y se encuentra dentro de la porción acuosa de la gota direccionable.
    9. Dispensar la célula en la gota direccionable usando el microinyector. El volumen de una gota direccionable de nL 10 aumentará menos del 1%.
    10. Repetir 2.2.5-2.2.9 las gotitas direccionable restantes dejando algunos gratis para el control experimental donde direccionables gotitas que contienen una célula.
      Nota: Es una alternativa más simple a la carga de las células en gotas direccionables con un microcapillary y un micromanipulador para sustituir la solución en el paso 1.2.8 con una solución de anticuerpo de detección en 4% PBSA que contiene células a una concentración del orden de 10 5 células/mL, equivalente a 1 célula/10 nL. Ocupación única célula será Poissonian y necesitará optimizarse la concentración celular.
  3. Lyse las células y la matriz de la imagen
    1. Imagen de células en las gotas mediante microscopía brightfield, incluyendo cualquier proyección de imagen de fluorescencia.
      Nota: la proyección de imagen toma aproximadamente 3 minutos a la imagen ~ 100 gotas usando un microscopio automatizado. Realizar la proyección de imagen con un NA 60 = 1.49 objetivo de inmersión en aceite. Filtros no son necesarios para el brightfield imágenes mientras que conjuntos de filtro estándar son utilizados para la proyección de imagen de fluorescencia.
    2. Imagen de todos los puntos de la matriz mediante microscopía TIRF de molécula única.
      Nota: Configuración se utiliza como paso 2.3.1 con una TIRF especializado filtro conjunto. Estas imágenes serán posteriormente analizadas en la sección 3 para determinar el fondo de las moléculas individuales a cada punto de anticuerpos antes de la lisis. Proyección de imagen de una molécula utilizando microscopía de fluorescencia (TIRF) de reflexión interna total toma aproximadamente 5 minutos de ~ 100 puntos de la imagen.
    3. Se centran en una celda de una gotita direccionable. Lograr completa lisis óptico concentrándose un 6 solo ns laser pulso (longitud de onda 1064 nm, pulso energías 14,1 ± 0.3 ìj por pulso) cerca de la ubicación de la célula.
      Nota: El pulso de láser establece una creciente burbuja de cavitación tijeras de la célula y libera a componentes celulares en el volumen de la gota. 4 , 31 procesos mecánicos debido a la lisis inducida por láser no perturban la interfaz aceite-agua en energías de bajo pulso. Lisis óptica típicamente toma aproximadamente 20-30 min para lyse las 100 células. Como comentamos en la sección de discusión, hay una serie de métodos alternativos para lyse las células si no es posible la configuración óptica lisis.
    4. Repita para todos gotitas direccionables que contiene la célula dejando 5 gratis para el control experimental donde direccionables gotas contienen una célula no sometidas a lisis.
    5. Tenga en cuenta el momento en el que cada célula es lisada.
      Nota: Estos tiempos se utilizará para corregir las curvas de enlace individual para cada punto en el paso 3.1.9. A menudo es suficiente para notar los tiempos cuando las células de la primeras y la últimas están lisadas y estiman el resto asumiendo adecuadamente consistente en un tiempo entre los acontecimientos de lisis.
    6. Adquisición de imágenes de sola molécula mediante microscopía TIRF de todos los puntos cada 10 minutos para los primeros 30 min luego cada 20 minutos de un 60 minutos más. Si sólo está interesado en la cantidad de proteína limitada en equilibrio, todos los puntos de imagen después de incubar el chip durante 90 minutos a temperatura ambiente.
      Nota: El tiempo para alcanzar el equilibrio depende el volumen de la gota y la afinidad de los anticuerpos utilizados en el ensayo. Microscopía TIRF se realiza utilizando una fuente de excitación láser en = 488 nm y 1.5 de mW de potencia medido en la abertura posterior utilizando un medidor de potencia óptica. Sola molécula imágenes son adquiridas mediante el establecimiento de los parámetros de adquisición de la cámara EM-CCD en tiempo de la adquisición de 900 ms, digitalización de 16 bits a velocidad de lectura de 1 MHz y un EM obtener factor de 10. El aislador puede reutilizarse quitando cuidadosamente el cubreobjetos.

3. Análisis de los datos

  1. Sola molécula contando (régimen no congestionado/digital)
    1. Fiji (o Matlab) para cualquier punto de anticuerpo no congestionadas, carga la imagen adquirida antes de lisis (fondo, BKD).
      Nota: Las operaciones en los siguientes pasos se realizan directamente con software de análisis de imagen de Fiji. Una guía de usuario se puede encontrar en el siguiente enlace https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146.html.
    2. En Fiji, seleccione la imagen BKD. En el menú "Imagen" seleccione "Duplicar" para duplicar BKD. Seleccione la imagen duplicada y en el "proceso > filtros", seleccione "Desenfoque gaussiano" y especificar un radio de 50 píxeles.
    3. Aplanar la imagen BKD para que haya una distribución de intensidad uniforme efectiva de la fuente de luz de excitación dividiendo la imagen BKD la borrosa imagen de BKD, produciendo BKD_FLAT.
      1. "Proceso" seleccionar "imagen calculadora...", especificando la operación "Dividir", las imágenes requieren y seleccionando las cajas "Crear nueva ventana" y "resultado de 32 bits (float)".
    4. Restar cada píxel de la imagen 1 ("proceso > Matemáticas", seleccione "Restar..." y especificar un valor de 1). La intensidad del pixel media debe ser 0.
      Nota: El campo aplanar e imágenes de fondo aplanado pueden revisarse fácilmente, ya que la suma de todos los píxeles debe ser 0 y cualquier desplazamiento restante puede compensarse más directamente.
    5. Seleccione un área de píxeles 50 píxel × 50 en cualquiera de las 4 esquinas de la imagen BKD_FLAT. Medir la desviación de estándar de intensidad de pixel (σ) mediante la opción "Analizar" y "Medida".
      Nota: Las estadísticas de la selección se presentará en una ventana de resultados. Determina antecedentes de lugar donde hay poco probable ser una alta densidad de las moléculas individuales. El área a medir puede seleccionarse manualmente usando las herramientas de selección de menú por defecto o por ejecutar la macro código "makeRectangle (x, y, ancho, altura)"; Esto crea una selección rectangular, donde x e y los argumentos son las coordenadas (en píxeles) de la esquina superior izquierda.
    6. Ajuste del umbral de la imagen a 3σ y crear una imagen binaria SM_MASK.
      1. En "Imagen > ajustar", seleccione "Umbral..." y establecer el nivel de umbral bajo 3σ.
        Nota: Pixeles cuyo valor está por debajo del umbral se establecen en cero y píxeles superior al umbral se establecen en 1. El umbral determina la confianza con la que píxeles thresholded pertenecen a una sola molécula.
    7. En la imagen segmentada SM_MASK, valores de la intensidad del pixel ajuste a cero de los objetos que no tienen un tamaño de pixel de 4-92 y una circularidad de 0.5 - 1 por seleccionar "Analizar" seguido de "Analizar las partículas" y especificar el tamaño y la circularidad.
      Nota: El tamaño de píxel deba ser optimizada para otro conjunto de fluoróforos y microscopio de ups. Debido al tipo de ruido de cámara píxeles solo pueden estar por encima de este umbral y no se descarta a pesar de no ser las moléculas individuales. El criterio de tamaño de pixel deseche correctamente dichos píxeles. Las moléculas individuales son generalmente de forma circulares. Un circularidad el valor 1 indica un círculo perfecto mientras que el valor a 0 indica una forma cada vez más alargada. Los objetos restantes son moléculas individuales y pueden ser contados. Una máscara puede configurarse para delimitar la zona de la mancha para discriminar sobre el terreno y fuera de lugar cuenta cada fotograma. Esto es más fácil para los marcos que adquirió en épocas posteriores cuando hay una señal suficiente sobre el terreno que luego puede ser aplicada a los marcos anteriores.
    8. Para el mismo lugar de anticuerpo no congestionadas, carga y repita los pasos 3.1.1 - 3.1.7 para todos los marcos de imagen capturaron como una serie de tiempo resuelto adquirida post lisis. Utilice los tiempos de lisis en paso 2.3.5. para corregir cualquier curvas de enlace.
  2. Sola molécula contando (régimen congestionado/analógica)
    1. Para calcular la intensidad promedio de una sola molécula, antes de proceder, repita los pasos 3.1.1 - 3.1.8.
    2. Se multiplican las imágenes BKD_FLAT y SM_MASK para producir una imagen por el que se asocian a las moléculas individuales valores de cero píxeles.
      1. Para realizar esto, en el menú de "Proceso", seleccione "Imagen calculadora...", especifique la operación "Multiplicar" y las imágenes necesarias y seleccione las cajas "Crear nueva ventana" y "resultado de 32 bits (float)".
    3. Suma todos los valores de intensidad del píxel al seleccionar "Analizar" y luego "Medida"; el resumen estadístico de la selección se presentará en una ventana de resultados. Dividir por el número de moléculas individuales contados según paso 3.1.8 para calcular la intensidad media por molécula única.
    4. Para cualquier anticuerpo congestionado lugar, carga la lisis de la imagen adquirida y aplanar con una imagen de fondo borroso según pasos 3.1.2 y 3.1.3.
    5. Restar cada píxel de la imagen aplanada de 1 ("proceso > Matemáticas", seleccione "Restar..." y especificar un valor de 1)
    6. Seleccione un área de píxeles 50 píxel × 50 en cualquiera de las 4 esquinas de la imagen y medir la desviación de estándar de intensidad de pixel (σ). Consulte el paso 3.1.5 para más detalles.
    7. Crear una máscara de imagen binaria estableciendo el umbral de la imagen a 3σ y establece valores de intensidad del píxel en cero de los objetos con un tamaño de menos de 4 pixel2. Para realizar esto, en el menú "Analizar", seleccione "Analizar partículas" y especifique el tamaño y la circularidad.
    8. Multiplicar la imagen spot aplanado anticuerpo congestionadas por la máscara de la imagen binaria.
      1. Para realizar esto, en el menú de "Proceso", seleccione "Imagen calculadora...", especifique la operación "Multiplicar" y las imágenes necesarias y seleccione las cajas "Crear nueva ventana" y "resultado de 32 bits (float)".
    9. Suma de las intensidades de píxeles restantes al seleccionar "Analizar" seguido por "Medida"; el resumen estadístico de la selección se presentará en una ventana de resultados.
    10. Dividir la suma de intensidades de píxeles por la intensidad media molécula única para calcular el número de moléculas individuales al lugar congestionado.
  3. Curva de calibración para cuantificación absoluta
    1. Repetir los apartados 1 y 2 para formar 10 gotitas direccionable de nL con el anticuerpo de detección en solución al 4% PBSA añadieron una proteína recombinante de concentración conocida.
    2. Realizar una serie de concentración de 102- 107 proteínas recombinantes por gota mediante la variación de la concentración conocida de la proteína recombinante a la solución. Se recomienda trabajar en términos de cantidad de proteínas por gota para hacer calibración de celda única de datos sencillo.
    3. Utilizar la serie de concentración datos en paso 3.3.2 para calibrar cualquier molécula única cuenta por punto a la abundancia de la proteína por gota y por la abundancia de proteínas de extensión por célula.

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Resultados

Se determinó el número de copia absoluto basal proteína de p53 con la resolución de la célula en una línea de células de cáncer de colon humano, las células se. Demostramos cómo expresión de p53 puede variar en varios órdenes de magnitud y muestran una correlación positiva débil entre numero de celular proteína y tamaño de copia dentro de la población de la célula sea descansa.

Direccionable de gotita de Microarrays se forman cu...

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Discusión

Direccionable de gotita de Microarrays son un método sensible y extensible para determinar cuantitativamente el número de copia absoluta de proteína dentro de una sola célula.

Limitar el nivel de la Unión no específica (NSB) es fundamental en el protocolo para alcanzar hasta un límite de detección posible. Proteínas y otras especies bioquímicas no específicamente pueden obligar a un número de interfaces presentes dentro de las gotas, la superficie del cubreobjetos, el anticuerpo spot y la inte...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

ASR había diseñado experimentos, desarrolló protocolos y análisis de datos. SC y PS realizan experimentos de tamaño celular. ASR y OC escribieron el manuscrito. Los autores desean agradece el apoyo del Prof. David R. Klug para proporcionar acceso al equipo. Los autores desean agradecer la Imperial College avanzado Hackspace para acceso a instalaciones de prototipado y fabricación.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
células fuertes salina tamponada >con
fosfato (PBS)Life Technologies10010015
DMEM alto contenido de glucosaSigmaD6429
Suero fetal bovino (FBS)BiochromS0115
Frascos de cultivo celularCorningSIAL0639
Tripsina/EDTABiochromL2153
NombreCompanyNúmero de catálogoComentarios
Microarray
Microcontact ArrayerDigiLab, Reino UnidoOmniGrid Micro
Microcontact pinArrayIt, USA946MP2
Cubreobjetos (Nexterion)Schott, Europa1098523Tamaño (mm): 65.0 x 25.0; Espesor (mm) 0,17
p53 captura anticuerpoEnzoADI-960-070
p53 detección de anticuerpo, Alexa Fluor 488 etiquetado SantaCruzsc-126concentración de stock 200μ g/mL
Tampón de citrato salino-sódicoGibco15557-044
BetaínaSigma61962
Dodecil sulfato sódicoSigmaL3771
Placa de 384 pocillos (bajo volumen)SigmaCLS4511
Cilindro de gas nitrógenoBOCGrado industrial, libre
Nombre>CompanyNúmero de catálogo>Comentarios
>Droplets
MicromanipuladorEppendorfPatchman NP2
Microinyector manualEppendorfCellTram Vario
MicropipetaOrigio, DinamarcaMBB-FP-L-0
Bombas de jeringaKD ScientificKDS-210
100 μ Jeringa LHamilton81020Hermética al gas, PTFE Luer lock
Jeringa de 1 mLHamilton81327A prueba de gas, PTFE Luer
lock Aislador de siliconaGrace Bio-LabsJTR24R-A-0.56x4 pocillo aislador de silicona con adhesivo
Cortadora láserVersaLASEVLS2.30 CO2 Laser 3Wpara el corte láser de aisladores personalizados
Láminaacrílica de 1 mm de espesorWeatherall-UKClarex Precision Sheet 001para el corte láser de aisladores personalizados
Lámina adhesiva3Mutilizada para adherir aisladores personalizados a cubreobjetos microarrays
Super glueLoctiteLOCPFG3T
150 μ m ID/360 μ m OD tubo de sílice fundidaIDEXFS-115
1,0 mm ID/1/16" Diámetro exterior de la tubería PFAIDEX1503
0.014" Identificación/0.062" Tubo de PTFE de diámetro exteriorKinesis008T16-100
1,0 mm de diámetro interior/2,0 mm de diámetro exterior Tubo de FEPIDEX1673
Albúmina de suero bovino (BSA)Fisher ScientificBP9700100
Aceite mineralSigmaM5904
Agua ultrapuraMillipore, AlemaniaMilliQ
Name CompañíaNúmero de catálogoComments
>Microscopía & Microscopio óptico
excitación láserVortran, EE. UU.Stradus 488-50
Fuente láser de lisis ópticaContinuum, EE. UUSurelite SLI-10
cubo de filtro para TIRFChroma, EE. UU.z488bp
Cubo de filtro de microscopio para láser de lisis óptica2000, Reino UnidoLPD01-532R-25
NameCompanyNúmero de catálogo<>strong>Comments
>Software
FijiSoftware deanálisis de imágenes
MatlabMathworksversión 7.14 o superiorSoftware de análisis de imágenes
de oxígenoTIRF con platina XY codificada Nikon, Japón Nikon Ti-E EM-CCD Andor Technologies, Irlanda IXON DU-897E Fuente de . Microscopio de código abierto

Referencias

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