Aquí presentamos gotita direccionable microarrays (ADMs), un método de arreglo de discos basado en la gota capaces de determinar la abundancia absoluta de proteínas en las células. Demostramos la capacidad de ADMs para caracterizar la heterogeneidad en la expresión de la proteína p53 supresora tumoral en una línea celular de cáncer en humanos.
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Artículo de método
Recuento de proteínas en las células con Microarrays de gota direccionable
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En este artículo
Resumen
Resumen
Comportamiento a menudo celular y respuestas celulares se analizan a nivel de población donde se agruparon las respuestas de muchas células como resultado promedio enmascara el comportamiento rico sola célula dentro de una población compleja. Tecnologías de detección y cuantificación de la proteína unicelular han hecho un impacto notable en los últimos años. Aquí describimos una plataforma de análisis práctico y flexible única célula basada en microarrays gotita direccionable. Este estudio describe cómo los números de copia absoluta de proteínas objetivo pueden medirse con una resolución de única célula. El tumor supresor p53 es el gen más comúnmente mutado en el cáncer humano, con más del 50% total de casos de cáncer exhibiendo un patrón de expresión de p53 no saludables. El protocolo describe los pasos para crear 10 gotitas de nL en el que las células cancerosas humanas solo son aisladas y se mide el número de copias de la proteína p53 con la resolución sola molécula para determinar precisamente la variabilidad en la expresión. El método puede aplicarse a cualquier tipo de células incluyendo el material principal para determinar el número de copia absoluta de cualquier proteínas target de interés.
Introducción
El objetivo de este método es determinar la variación en la abundancia de una proteína de la blanco en una población de células con una resolución de única célula. Análisis de célula proporciona una serie de beneficios que no están disponibles con métodos bioquímicos de formación tradicional. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 en primer lugar, trabajar en el nivel unicelular puede capturar la rica heterogeneidad de una población celular que de lo contrario se perdería por el promedio que se produce con técnicas bioquímicas ....
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Protocolo
1. preparación
-
Hacer virutas y microarrays de anticuerpos impresión
- Colocar un aislador de adhesivo acrílico y silicón a un cubreobjetos funcionalizado para apoyar un microarray de anticuerpo. Esto se conoce como el chip.
Nota: Varios químicos superficiales han sido probados para su conveniencia con gotitas direccionables. 5 química superficial deben optimizarse para agentes alternativos de captura. Aisladores de ADM están disponibles comercialmente o pueden ser producidos por láser corte de acrílico (CAD para aislador utilizado en este trabajo se ofrece como una descarga de archivo, consulte el ....
- Colocar un aislador de adhesivo acrílico y silicón a un cubreobjetos funcionalizado para apoyar un microarray de anticuerpo. Esto se conoce como el chip.
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Resultados
Se determinó el número de copia absoluto basal proteína de p53 con la resolución de la célula en una línea de células de cáncer de colon humano, las células se. Demostramos cómo expresión de p53 puede variar en varios órdenes de magnitud y muestran una correlación positiva débil entre numero de celular proteína y tamaño de copia dentro de la población de la célula sea descansa.
Direccionable de gotita de Microarrays se forman cu.......
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Discusión
Direccionable de gotita de Microarrays son un método sensible y extensible para determinar cuantitativamente el número de copia absoluta de proteína dentro de una sola célula.
Limitar el nivel de la Unión no específica (NSB) es fundamental en el protocolo para alcanzar hasta un límite de detección posible. Proteínas y otras especies bioquímicas no específicamente pueden obligar a un número de interfaces presentes dentro de las gotas, la superficie del cubreobjetos, el anticuerpo spot y la inte.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
ASR había diseñado experimentos, desarrolló protocolos y análisis de datos. SC y PS realizan experimentos de tamaño celular. ASR y OC escribieron el manuscrito. Los autores desean agradece el apoyo del Prof. David R. Klug para proporcionar acceso al equipo. Los autores desean agradecer la Imperial College avanzado Hackspace para acceso a instalaciones de prototipado y fabricación.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| células fuertes salina tamponada >con | |||
| fosfato (PBS) | Life Technologies | 10010015 | |
| DMEM alto contenido de glucosa | Sigma | D6429 | |
| Suero fetal bovino (FBS) | Biochrom | S0115 | |
| Frascos de cultivo celular | Corning | SIAL0639 | |
| Tripsina/EDTA | Biochrom | L2153 | |
| Nombre | Company | Número de catálogo | Comentarios |
| Microarray | |||
| Microcontact Arrayer | DigiLab, Reino Unido | OmniGrid Micro | |
| Microcontact pin | ArrayIt, USA | 946MP2 | |
| Cubreobjetos (Nexterion) | Schott, Europa | 1098523 | Tamaño (mm): 65.0 x 25.0; Espesor (mm) 0,17 |
| p53 captura anticuerpo | Enzo | ADI-960-070 | |
| p53 detección de anticuerpo, Alexa Fluor 488 etiquetado Santa | Cruz | sc-126 | concentración de stock 200μ g/mL |
| Tampón de citrato salino-sódico | Gibco | 15557-044 | |
| Betaína | Sigma | 61962 | |
| Dodecil sulfato sódico | Sigma | L3771 | |
| Placa de 384 pocillos (bajo volumen) | Sigma | CLS4511 | |
| Cilindro de gas nitrógeno | BOC | Grado industrial, libre | |
| Nombre | >Company | Número de catálogo | >Comentarios |
| >Droplets | |||
| Micromanipulador | Eppendorf | Patchman NP2 | |
| Microinyector manual | Eppendorf | CellTram Vario | |
| Micropipeta | Origio, Dinamarca | MBB-FP-L-0 | |
| Bombas de jeringa | KD Scientific | KDS-210 | |
| 100 μ Jeringa L | Hamilton | 81020 | Hermética al gas, PTFE Luer lock |
| Jeringa de 1 mL | Hamilton | 81327 | A prueba de gas, PTFE Luer |
| lock Aislador de silicona | Grace Bio-Labs | JTR24R-A-0.5 | 6x4 pocillo aislador de silicona con adhesivo |
| Cortadora láser | VersaLASE | VLS2.30 CO2 Laser 3W | para el corte láser de aisladores personalizados |
| Lámina | acrílica de 1 mm de espesorWeatherall-UK | Clarex Precision Sheet 001 | para el corte láser de aisladores personalizados |
| Lámina adhesiva | 3M | utilizada para adherir aisladores personalizados a cubreobjetos microarrays | |
| Super glue | Loctite | LOCPFG3T | |
| 150 μ m ID/360 μ m OD tubo de sílice fundida | IDEX | FS-115 | |
| 1,0 mm ID/1/16" Diámetro exterior de la tubería PFA | IDEX | 1503 | |
| 0.014" Identificación/0.062" Tubo de PTFE de diámetro exterior | Kinesis | 008T16-100 | |
| 1,0 mm de diámetro interior/2,0 mm de diámetro exterior Tubo de FEP | IDEX | 1673 | |
| Albúmina de suero bovino (BSA) | Fisher Scientific | BP9700100 | |
| Aceite mineral | Sigma | M5904 | |
| Agua ultrapura | Millipore, Alemania | MilliQ | |
| Name | Compañía | Número de catálogo | Comments |
| >Microscopía & Microscopio óptico | |||
| excitación láser | Vortran, EE. UU. | Stradus 488-50 | |
| Fuente láser de lisis óptica | Continuum, EE. UU | Surelite SLI-10 | |
| cubo de filtro para TIRF | Chroma, EE. UU. | z488bp | |
| Cubo de filtro de microscopio para láser de lisis óptica | 2000, Reino Unido | LPD01-532R-25 | |
| Name | Company | Número de catálogo | <>strong>Comments |
| >Software | |||
| Fiji | Software de | análisis de imágenes | |
| Matlab | Mathworks | versión 7.14 o superior | Software de análisis de imágenes |
Referencias
- Willison, K. R., Klug, D. R. Quantitative single cell and single molecule proteomics for clinical studies. Curr. Opin. Biotechnol. 24 (4), 745-751 (2013).
- Heath, J. R., Ribas, A., Mischel, P. S. Single-cell analysis tools for drug discovery and development.....
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