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Artículo de método

Criopreservación de espermatogonios de pez cebra por todo los testículos aguja inmerso enfriamiento ultra rápido

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DOI:

10.3791/56118

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4 de marzo de 2018

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1Department of Aquaculture, Szent István University

En este artículo

Resumen

El objetivo principal de este estudio fue adaptar la aguja inmerso en procedimiento de vitrificación (NIV) para criopreservar los testículos todo pez cebra. Además, se evaluó la repetibilidad del método en cinco cepas diferentes de pez cebra.

Resumen

Tendencias actuales en ciencia y biotecnología conducen a la creación de miles de nuevas líneas en organismos modelo lo lleva a la necesidad de nuevos métodos para el almacenamiento seguro de los recursos genéticos más allá de las prácticas comunes de mantener colonias de cría. El objetivo principal de este estudio fue adaptar la aguja inmerso en procedimiento de vitrificación (NIV) para criopreservar los testículos todo pez cebra. Criopreservación de células de germen incipiente por los testículos todo NIV ofrece posibilidades para el almacenamiento de pez cebra recursos genéticos, especialmente puesto que después maduran a gametos masculinos y femeninos. Los testículos fueron suprimidos, en una aguja de acupuntura, equilibrada en dos medios crioprotectores (solución de equilibrado que contiene 1,5 M metanol y glicol de propileno de 1.5 M; y solución de vitrificación que contiene dimetilsulfóxido de 3 M y 3 M propilenglicol) y sumergida en nitrógeno líquido. Las muestras fueron calentadas en una serie de tres soluciones de calentamiento consiguientes. Las principales ventajas de esta técnica son (1) la falta de espermatozoides después de la digestión de los testículos caliente facilitando manipulaciones posteriores; (2) ultra rápido de enfriamiento que permite la óptima exposición de los tejidos a nitrógeno líquido, por lo tanto maximizar la refrigeración y reducir la necesaria concentración de crioprotectores, reduciendo así su toxicidad; (3) exposición sincrónica de varios testículos crioprotectores y nitrógeno líquido; y repetibilidad (4) demostró mediante la obtención de la viabilidad de sobre el 50% en cinco cepas diferentes de pez cebra.

Introducción

Nuevas tendencias en la ciencia y la biotecnología han llevado a la creación de miles de nuevas líneas mutantes de Drosophila, pez cebra, ratones y otras especies usadas como organismos modelo en biomedicina y otras ciencias1. Además, como nuevas tecnologías se desarrollan y se convierten en disponibles, los números de líneas mutantes aumentan constantemente2. Esto conduce a la necesidad de un almacenamiento seguro de los recursos genéticos más allá de las prácticas comunes de mantener colonias de cría. Como un método que permite el almacenamiento seguro de los recursos genéticos por un período indefinido de tiempo, criopreservación ofrece muchas ventajas tales como extensión de la temporada reproductiva, evita la necesidad de un mantenimiento continuo de los reproductores, y es más costo - y mano de obra eficiente2.

Protocolos de criopreservación de esperma desarrollado durante los últimos varios años2,3,4 ofrecen la oportunidad para el almacenaje acertado del material genético masculino de pez cebra. Sin embargo, la criopreservación de óvulos o embriones de peces todavía no es posible debido a su compleja estructura y grandes cantidades de material de la yema de huevo. Recientemente, la práctica del trasplante de células de germen primordiales (PGCs) o las células madre espermatogonias (SSCs) ofrece un puente a esta barrera mediante el desarrollo funcional de la esperma y huevos después de trasplante5. Por lo tanto, la criopreservación de SSCs ofrece una nueva frontera en la conservación de los recursos genéticos raros y valiosos.

A pesar de que la criopreservación ofrece muchas ventajas, el proceso de congelación lenta tasa genera varias condiciones que pueden llevar a daño de la célula2. Estos incluyen la formación de hielo intracelular y extracelular, deshidratación y toxicidad del crioprotector. Hielo daña las células, hielo extracelular puede conducir a trituración mecánica de las células, mientras que la difusión de agua desde las células durante la tasa lenta de congelación puede conducir a deshidratación6. Recientemente, se ha aplicado vitrificación como una técnica que evita los efectos negativos de la formación de hielo en la criopreservación de gametos de peces7,8,9. Presenta una técnica de enfriamiento ultra rápida a través del cual los medios de comunicación internos y externos se convierten en un estado amorfo/vidrioso sin crystalizing en hielo7,10. Éxito vitrificación de tejido ovárico y testicular ha sido evidenciado en especies de aves y mamíferos10,11,12, abriendo posibilidades para su aplicación en los peces, así.

En este estudio, presentamos el procedimiento de vitrificación (NIV) aguja sumergido para la criopreservación de los testículos todo pez cebra. Demostrar un método confiable para el aislamiento de las células de germen incipiente pez cebra sin contaminación y un proceso de criopreservación que produce cantidades relativamente altas de células de germen incipiente con una baja presencia de otras células, especialmente de espermatozoides. A lo mejor de nuestro conocimiento, éste es el primer estudio en demostrar un protocolo detallado visualizado para el enfriamiento ultra rápido de tejido gonadal de peces y pez cebra del germline células. Además, la repetibilidad del método se demuestra en cinco cepas diferentes de pez cebra: AB tipo salvaje, casper (roy- / -; nácar- / -), leopardo (leot1/t1), vasa [Tg (vas::eGFP)] y línea transgénica de Wilms tumor [Tg (wt1b::eGFP 1)].

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Protocolo

Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por la ley de Bienestar Animal Húngaro.

1. preparación del reactivo

  1. Soluciones madre
    1. Preparar 1 M trehalosa agregando 0,378 g de trehalosa dihidrato en 1 mL de dH2O. mezcla bien hasta que se disuelva por completo.
    2. Preparar 1 M sacarosa añadiendo 0,342 g de sacarosa en 1 mL de dH2O. mezcla bien hasta que se disuelva por completo.
    3. Preparar 1 M HEPES añadiendo 0,238 g de HEPES y 1 mL de dH2O. mezcla bien hasta que se disuelva por completo.
    4. Preparar la colagenasa (290 U/mg) de 20 mg/mL mediante la adición de 100 mg en 5 mL de PBS. Mezclar bien hasta que se disuelve. Filtro estéril a través de 0,2 μm filtros. Tubos de alícuotas de 50 μL en PCR de 0,2 mL y congelar a - 20 ° C.
    5. Preparar tripsina 15 mg/mL (~ 10000 U/mg) mediante la adición de 75 mg para 5 mL de PBS. Mezclar bien hasta que se disuelve. Filtro estéril a través de 0,2 μm filtros. Tubos de alícuotas de 50 μL en PCR de 0,2 mL y congelar a - 20 ° C.
    6. Preparar 1 mg/mL DNasa I (~ 3000 U/mg) mediante la adición de 5 mg en 5 mL de PBS. Mezclar bien hasta que se disuelve. Filtro estéril a través de 0,2 μm filtros. Tubos de alícuotas de 50 μL en PCR de 0,2 mL y congelar a - 20 ° C.
    7. Preparar tripano 0.4% azul mediante la adición de 40 mg de azul de tripano a 10 mL de PBS. Filtro estéril a través de 0,2 μm filtros. Alícuota 1 mL en tubos de 1,5 mL.
    8. Preparar 200 mg/L MS-222 (sulfonato de metano Metanosulfonato) mediante la adición de 200 mg de MS-222 en 1 L de dH2O. mezcla bien hasta que se disuelva por completo. Además, el MS-222 tampón con bicarbonato de sodio a un pH neutro de 7.0.
  2. Soluciones de vitrificación
    1. Preparar la solución de equilibrado (ES): preparar 2 mL de CE mezclando 121.5 μl de metanol (MeOH; 1,5 M), 220 μl de glicol de propileno (PG; 1,5 M), 200 μL de FBS (10%), 200 μL de solución stock de trehalosa (0,1 M), 50 μl de la solución madre de HEPES (25 mM) y 1208.5 μl de L-15 en un 2 tubo mL.
    2. Preparar la solución de vitrificación (VS): preparar 2 mL de VS mezclando 439 μl de PG (3 M), 426 μl de dimetilsulfóxido (Me2. 3 M), 200 μL de FBS (10%), 200 μL de solución stock de trehalosa (0,1 M), 50 μl de HEPES stock solución (25 mM) y 685 μl de L-15 en un tubo de 2 mL.
  3. Soluciones para el calentamiento
    1. Preparar la solución calentamiento 1 (WS1): preparar 1,5 mL de WS1 en un tubo de 2 mL mediante la mezcla de 150 μL de FBS (10%), 450 μl de solución de sacarosa (3 M) y 900 μl de L-15.
    2. Preparar la solución calentamiento 2 (WS2): preparar 1,5 mL de WS2 en un tubo de 2 mL mediante la mezcla de 150 μL de FBS (10%), 150 μL de solución de sacarosa (1 M) y 1200 μl de L-15.
    3. Preparar solución calentamiento 3 (WS3): preparar mezcla 150 μL FBS (10%) 1.5 mL de WS2 en un tubo de 2 mL y μl de 1350 de L-15.
  4. Preparar la solución de digestión: para cada muestra preparar 500 μl de la solución de digestión mezclando 50 μl de la solución madre de colagenasa (2 mg/mL), 50 μl de la solución madre de tripsina (1,5 mg/mL), 10 μl de DNasa I (20 μg/mL) y 390 μl de L-15 en 2 mL del tubo.
  5. Obtener herramientas de disección: tijeras, microscissors, pinzas, pinzas curvas y agujas de acupuntura.

2. testículos colección

  1. Eutanasia a los peces colocando en un recipiente que contiene 200 mg/L MS-222 (pH = 7). Antes de continuar con la disección, asegúrese de que las branquias han detenido y por lo menos 10 minutos han pasado desde ese momento para asegurar la muerte por hipoxia.
  2. El pescado seco acariciando sobre una toalla de papel y colóquela sobre su lado dorsal en una estera de la disección.
    1. En primer lugar cortar las aletas pélvicas y pectorales para la disección más fácil.
    2. Horizontal, cortar la piel en el vientre de los peces entre las aletas pectorales y cortar la piel y el músculo subyacente a lo largo del vientre hasta la aleta anal.
    3. Abra la cavidad del cuerpo de los peces y la clavija de la pared izquierda y derecha del cuerpo a la estera de la disección con agujas.
      Nota: Los testículos se encuentran por encima de los órganos gastrointestinales en ambos lados de la vejiga natatoria (figura 1).
  3. Para evitar la contaminación, no sacar los órganos gastrointestinales, pero suavemente empuje hacia un lado y quitar el testículo del lado opuesto. Los testículos están conectados con la pared del cuerpo así que quitarlos con cuidado y cortar el peritoneo de conexión por microscissors.
  4. Además, con el fin de evitar la contaminación, en primer lugar esterilizar los testículos poniendo en etanol al 70% durante 2 s y entonces lugar ellos en L-15 en una placa de 96 pozos en el hielo.
    Nota: Si es necesario, limpiamos testículos grandes y del tejido adiposo vasos sanguíneos precisamente bajo el estereomicroscopio

3. ultra rápido enfriamiento del tejido Testicular

  1. Agujas de marca con etiquetas apropiadas dependiendo de la muestra tipo y preparan las soluciones de vitrificación (VS) y equilibrado (ES).
  2. Transferir los testículos a una placa bien grande o plato y perno de dos a tres los testículos (o más dependiendo del tamaño de la aguja) en una aguja de acupuntura estériles.
    1. En primer lugar colocar el testículo en la parte superior curva pinzas. Coloque la punta de la aguja en el centro del testículo y tire cuidadosamente el testículo hacia arriba con las pinzas.
    2. Después de pinchar los testículos, con cuidado tirar hacia arriba hacia la parte superior de la aguja. Asegúrese de que los testículos están separados unos de otros y que no son caerse o deslizarse.
    3. Lugar las agujas con testículos anclados en un tubo de 2 mL con L-15 hasta vitrificación (a 25 ° c; tiempo de almacenamiento no debe exceder 1 h).
      Nota: La fijación de los testículos en la aguja debe hacerse rápidamente para impedir que los testículos se sequen.
  3. Transferir la aguja con los testículos en la solución de equilibrado e incubar durante 5 min a 25 °.
  4. La aguja de transferencia en la solución de vitrificación e incube durante 30 s a 25 °.
  5. Retire la aguja de la solución de vitrificación, suavemente y rápidamente absorben el resto de la solución en el tejido por una toalla de papel estéril. Tenga cuidado para evitar los testículos pegarse a la toalla de papel o caerse.
  6. Rápidamente Coloque la aguja en nitrógeno líquido colocada en una caja de espuma de poliestireno.
    Nota: Hacer este paso rápidamente para evitar la exposición del tejido a los vapores de nitrógeno líquido. Utilizar volúmenes bajos de nitrógeno líquido para evitar la contaminación cruzada de las muestras.
  7. Mantener la aguja en nitrógeno líquido en una caja cerrada de la espuma de poliestireno de 5-10 minutos.
  8. Preenfriar un criotubo abierto 4,5 mL y su tapa en la misma caja.
  9. Después de 5-10 min, transferir cada aguja en un criotubo separado debajo de la superficie de nitrógeno líquido y cerrar el criotubo.
    PRECAUCIÓN: Siempre use ropa protectora (tales como guantes aislados) cuando trabajo con nitrógeno líquido como exposición puede llevar a congelación severa.
  10. Coloque el criotubo en un bastón de metal y coloque en el recipiente de cryobank tan rápido como sea posible. Almacenar las muestras en un almacenamiento de información de vaso dewar hasta su uso posterior.

4. procedimiento de calentamiento

  1. Caliente cada aguja por separado. Todas las soluciones de calentamiento deben ser a 25 ° C.
  2. Separar el criotubo de la caña de metal y sumergirse en nitrógeno líquido, almacenado en una caja de espuma de poliestireno.
  3. Abrir el criotubo en el vapor del nitrógeno líquido (con pinzas) y suelte la aguja en el nitrógeno líquido.
  4. Transferir la aguja muy rápido en la primera solución calentamiento e incubar durante 1 min (a 25 ° C). Asegúrese de transferir la aguja rápidamente para evitar su calentamiento en el aire durante la transferencia.
  5. Transferencia de la aguja en la segunda solución calentamiento e incubar durante 3 minutos (a 25 ° C).
  6. Transferencia de la aguja en la tercera solución calentamiento e incubar durante 5 minutos (a 25 ° C).
  7. Liberar los testículos de la aguja deslizándolo hacia abajo con una pinza curva. Lugar cada testículo calentado individualmente en un pozo independiente (placa de 96 pocillos) con 250 μl de L-15 suplementado con 10% FBS. Asegúrese de que los pozos están etiquetados según la muestra. Mantenga la placa bien en el hielo hasta que todas las muestras se calientan y hasta más trabajo.

5. tejido digestión

  1. Preparar 500 μl de la solución de disociación para cada muestra en tubos separados 2 mL. Etiquetar los tubos de acuerdo con el código de la muestra. Incubar la solución preparada de disociación por 5 min a temperatura ambiente.
  2. Añadir el tejido calentado en la solución de digestión y cortar en trozos pequeños por lo menos 30 movimientos de tijeras pequeñas.
  3. Incubar el tejido cortado en una placa de agitación durante 90 minutos a 25 ° c.
  4. Detener el proceso de digestión mediante la adición de 400 μL de L-15 y 100 μl de FBS (SFB 10% v/v). Brevemente agitar la solución e incubar durante 1 min a temperatura ambiente.
  5. Filtrar la solución obtenida a través de 50 filtros del μm en un tubo de 1,5 mL. Etiquetar los tubos por consiguiente.
  6. Centrifugue la solución filtrada a 200 x g durante 10 min a 25 ° c.
  7. Cuidadosamente Quite el sobrenadante y resuspender el precipitado en 20 μl de L15 suplementado con 10% FBS. Agitar manualmente el tubo hasta que el precipitado se haya disuelto completamente. Mantener la suspensión de células en hielo o a 4 ° c hasta su uso posterior.

6. viabilidad evaluación y recuento celular

  1. Mezcla 5 μl de suspensión celular y 5 μl de solución de azul de tripano 0.4% en un tubo PCR de 0.2 mL debidamente etiquetado. Si se utilizan volúmenes diferentes, asegúrese de que la relación de dilución de 1:1 restos.
  2. Incubar la suspensión de 1 a 3 min a temperatura ambiente (25 ° C).
  3. Comprobar la viabilidad de cada muestra en un hemocitómetro bajo el microscopio.
  4. Contar el número de células vivas (sin mancha de azul tripán) en 15 campos. Calcular el número total de células de 20 μm de la suspensión de células. La suspensión está lista para cualquier aplicación posterior.
    Nota: Cuando optimizar el procedimiento para otras especies con tamaño de cuerpo más grande, utilizar fragmentos de testículos de igual peso. Utilice los testículos de un individuo para todos los grupos experimentales con el fin de evitar la variabilidad individual en los resultados. En el caso del pez cebra, aprovechamos el hecho de que izquierda y testículo derecho debe contener un número igual (o muy similar) de las células germinales13 (véase los resultados de representante). El testículo izquierdo se mantuvo como un control, mientras que el testículo derecho era vitrificados/calentados. Porcentaje de viabilidad se calculó el número de células aisladas del testículo vitrificados/calentados en comparación con el número de células aisladas de los testículos frescos.

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Resultados

En promedio, el número de células de germen inicial aislada de un testículo de pez cebra dulce solo varió entre 40.000 y 200.000 células dependiendo del tamaño de los peces. Al digerir los testículos frescos de pez cebra en todas las 5 cepas, células germinales tempranas no eran las células sólo presentes en las suspensiones de la célula (figura 2). Al lado de las células de germen incipiente, numerosos espermatozoides fueron encontrados también. Por otro lad...

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Discusión

El objetivo principal de este estudio fue adaptar la aguja inmerso en procedimiento de enfriamiento ultra rápido desarrollado para especies de aves y mamíferos10,11,12 a la crioconservación de testículo de pez (pez cebra como modelo organismo). La mayoría de los estudios anteriores con respecto a la criopreservación de los recursos genéticos del pez cebra se centraron principalmente en criopreservación de esperma de pez cebra

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este estudio fue apoyado por la investigación, desarrollo e innovación oficina de Hungría (grant 116912 a ÁH), la oficina de costos (alimentación y agricultura costo acción FA1205: AQUAGAMETE), el programa de becas beca Hungaricum (ayuda a ZM) y el nuevo Húngaro nacional excelencia Beca Predoctoral (grant EK).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Medios de Leibovitz (L-15)Sigma-AldrichL1518Suplementado con L-glutamina
Suero fetal bovino (FBS)Sigma-AldrichF9665
Metanosulfonato de tricaína (MS-222)Sigma-AldrichE10521
HEPESSigma-AldrichH3375
SacarosaAcros Organics57-50-1
TrehalosaAcros Organics99-20-7Metanol Dihidratado
Reanal20740-0-08-65
PropilenglicolReanal08860-1-08-65
DimetilsulfóxidoReanal00190-1-01-65
ColagenasaGibco9001-12-1
TripsinaSigma-AldrichT8003
DNasa IPanreac AppliChemA3778
Azul de tripánSigma-AldrichT6146
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)Sigma-AldrichP4417Comprimidos para la preparación de 200 ml de solución de PBS

Referencias

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