El objetivo principal de este estudio fue adaptar la aguja inmerso en procedimiento de vitrificación (NIV) para criopreservar los testículos todo pez cebra. Además, se evaluó la repetibilidad del método en cinco cepas diferentes de pez cebra.
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Artículo de método
Criopreservación de espermatogonios de pez cebra por todo los testículos aguja inmerso enfriamiento ultra rápido
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Resumen
Resumen
Tendencias actuales en ciencia y biotecnología conducen a la creación de miles de nuevas líneas en organismos modelo lo lleva a la necesidad de nuevos métodos para el almacenamiento seguro de los recursos genéticos más allá de las prácticas comunes de mantener colonias de cría. El objetivo principal de este estudio fue adaptar la aguja inmerso en procedimiento de vitrificación (NIV) para criopreservar los testículos todo pez cebra. Criopreservación de células de germen incipiente por los testículos todo NIV ofrece posibilidades para el almacenamiento de pez cebra recursos genéticos, especialmente puesto que después maduran a gametos masculinos y femeninos. Los testículos fueron suprimidos, en una aguja de acupuntura, equilibrada en dos medios crioprotectores (solución de equilibrado que contiene 1,5 M metanol y glicol de propileno de 1.5 M; y solución de vitrificación que contiene dimetilsulfóxido de 3 M y 3 M propilenglicol) y sumergida en nitrógeno líquido. Las muestras fueron calentadas en una serie de tres soluciones de calentamiento consiguientes. Las principales ventajas de esta técnica son (1) la falta de espermatozoides después de la digestión de los testículos caliente facilitando manipulaciones posteriores; (2) ultra rápido de enfriamiento que permite la óptima exposición de los tejidos a nitrógeno líquido, por lo tanto maximizar la refrigeración y reducir la necesaria concentración de crioprotectores, reduciendo así su toxicidad; (3) exposición sincrónica de varios testículos crioprotectores y nitrógeno líquido; y repetibilidad (4) demostró mediante la obtención de la viabilidad de sobre el 50% en cinco cepas diferentes de pez cebra.
Introducción
Nuevas tendencias en la ciencia y la biotecnología han llevado a la creación de miles de nuevas líneas mutantes de Drosophila, pez cebra, ratones y otras especies usadas como organismos modelo en biomedicina y otras ciencias1. Además, como nuevas tecnologías se desarrollan y se convierten en disponibles, los números de líneas mutantes aumentan constantemente2. Esto conduce a la necesidad de un almacenamiento seguro de los recursos genéticos más allá de las prácticas comunes de mantener colonias de cría. Como un método que permite el almacenamiento seguro de los recursos genéticos por un período indefinido de tie....
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Protocolo
Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por la ley de Bienestar Animal Húngaro.
1. preparación del reactivo
- Soluciones madre
- Preparar 1 M trehalosa agregando 0,378 g de trehalosa dihidrato en 1 mL de dH2O. mezcla bien hasta que se disuelva por completo.
- Preparar 1 M sacarosa añadiendo 0,342 g de sacarosa en 1 mL de dH2O. mezcla bien hasta que se disuelva por completo.
- Preparar 1 M HEPES añadiendo 0,238 g de HEPES y 1 mL de dH2O. mezcla bien hasta que se disuelva por completo.
- Preparar la colagenasa (290 U/mg) de 20 mg/mL mediante la adición de 10....
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Resultados
En promedio, el número de células de germen inicial aislada de un testículo de pez cebra dulce solo varió entre 40.000 y 200.000 células dependiendo del tamaño de los peces. Al digerir los testículos frescos de pez cebra en todas las 5 cepas, células germinales tempranas no eran las células sólo presentes en las suspensiones de la célula (figura 2). Al lado de las células de germen incipiente, numerosos espermatozoides fueron encontrados también. Por otro lad.......
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Discusión
El objetivo principal de este estudio fue adaptar la aguja inmerso en procedimiento de enfriamiento ultra rápido desarrollado para especies de aves y mamíferos10,11,12 a la crioconservación de testículo de pez (pez cebra como modelo organismo). La mayoría de los estudios anteriores con respecto a la criopreservación de los recursos genéticos del pez cebra se centraron principalmente en criopreservación de esperma de pez cebra
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este estudio fue apoyado por la investigación, desarrollo e innovación oficina de Hungría (grant 116912 a ÁH), la oficina de costos (alimentación y agricultura costo acción FA1205: AQUAGAMETE), el programa de becas beca Hungaricum (ayuda a ZM) y el nuevo Húngaro nacional excelencia Beca Predoctoral (grant EK).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Medios de Leibovitz (L-15) | Sigma-Aldrich | L1518 | Suplementado con L-glutamina |
| Suero fetal bovino (FBS) | Sigma-Aldrich | F9665 | |
| Metanosulfonato de tricaína (MS-222) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Sacarosa | Acros Organics | 57-50-1 | |
| Trehalosa | Acros Organics | 99-20-7 | Metanol Dihidratado |
| Reanal | 20740-0-08-65 | ||
| Propilenglicol | Reanal | 08860-1-08-65 | |
| Dimetilsulfóxido | Reanal | 00190-1-01-65 | |
| Colagenasa | Gibco | 9001-12-1 | |
| Tripsina | Sigma-Aldrich | T8003 | |
| DNasa I | Panreac AppliChem | A3778 | |
| Azul de tripán | Sigma-Aldrich | T6146 | |
| Solución salina tamponada con fosfato (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | Comprimidos para la preparación de 200 ml de solución de PBS |
Referencias
- Mazur, P., Leibo, S. P., Seidel, G. R. J. Cryopreservation of the germplasm of animals used in biological and medical research: Importance, impact, status, and future directions. Biol. Reprod. 78 (1), 2-12 (2008).
- Carmichael, C., Westerfield, M., Varga, Z. M.
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Reimpresiones y permisos
