Uso de un Mosquito recombinante Densovirus como un Vector de la entrega de genes para el análisis funcional de Genes en larvas de mosquitos

Resumen

Nos informe utilizando una artificial pequeño intronic RNA expresión estrategia para desarrollar un recombinante defectuoso no Aedes aegypti densovirus (AaeDV) en vivo el sistema de entrega. Se describe un procedimiento detallado para la construcción, envases y análisis cuantitativo de los vectores rAaeDV, así como por infección larval.

Resumen

Microinyección en vivo es la técnica de transferencia de genes más comúnmente utilizado para el análisis de las funciones del gene en los mosquitos. Sin embargo, este método requiere más técnicamente exigente operación y consiste en complicados procedimientos, especialmente cuando se utiliza en las larvas debido a su pequeño tamaño, relativamente delgada y frágil de la cutícula y alta mortalidad, que limitan su aplicación. Por el contrario, vectores virales para la entrega del gene se han desarrollado para superar las barreras extracelulares e intracelulares. Estos sistemas tienen las ventajas de fácil manipulación, eficiencia de transducción genética alta, mantenimiento a largo plazo de la expresión génica y la capacidad para producir efectos persistentes en vivo. Mosquito densoviruses (MDVs) son específicos de mosquito, pequeños virus de ADN de monocatenario que efectivamente pueden entregar extranjeros los ácidos nucleicos en células de mosquito; sin embargo, la sustitución o inserción de genes foráneos a crear virus recombinantes que típicamente causa una pérdida de capacidades de envases o replicación, que es un obstáculo para el desarrollo de estos virus como vectores de la entrega.

Adjunto, divulgamos usando una estrategia de expresión de ARN pequeño intronic artificial para desarrollar un recombinante defectuoso no Aedes aegypti densovirus (AaeDV) en vivo el sistema de entrega. Se describen los procedimientos detallados para la construcción, envases y análisis cuantitativo de los vectores rAaeDV y para la infección de larvas.

Este estudio demuestra, por primera vez, la viabilidad del desarrollo de un no-defectuosa recombinante MDV micro RNA (miRNA) sistema de la expresión, proporcionando una potente herramienta para el análisis funcional de genes en mosquito y establecer una base para la aplicación de paratransgenesis viral para el control de enfermedades transmitidas por mosquitos. Hemos demostrado que larvas de Aedes albopictus 1^st estadio podrían ser fácilmente y efectivamente infectadas mediante la introducción de virus en el cuerpo de agua del sitio de cría de larvas y que el rAaeDVs desarrollado podría utilizarse para sobreexpresar o derribar el expresión de un gen Diana en larvas, proporcionando una herramienta para el análisis funcional del mosquito de genes.

Introducción

Enfermedades transmitidas por mosquitos como la malaria, dengue, fiebre zika y fiebre amarilla, son problemas de salud pública internacional importante que siguen representan una fracción significativa de la carga global enfermedades infecciosas^1,2. Los insecticidas convencionales, que han sido utilizados en respuesta a vectores, son un componente importante de la estrategia de control de mosquito integrado sostenible para la prevención de enfermedades transmitidas por mosquitos. Sin embargo, tales estrategias han probado para ser relativamente ineficaz o indeseables debido a los impactos ambientales negativos....

Protocolo

todos los protocolos fueron aprobados por el Comité de ética de la Universidad de médica sur.

1. diseño de un intrón Artificial

Nota: el intrón artificial utilizado en este trabajo es 65 bp de longitud y la secuencia es de 5 ' - GTAAGAGTCGATCGACGCGTTACTAACTGGTACCTCTTCTTTTTTTTTTGATATCCTGCAG - 3 '.

1. Lugar el Hpa restricción sitio en ambos extremos del intrón artificial así que Hpa digestión puede liberar del intrón de plásmidos (véase la figura 1 A).
2. Lugar los dos Xba I sitios de restricción en el intrón así que....

Resultados

Estrategias para la construcción de rAaeDV
Un vector de rAaeDV defectuosa se generó para expresar el gen DsRed en larvas de mosquitos. El plásmido resultante contenía un cassette de la proteína NS1-DsRed fusión con la proteína VP eliminada (figura 1A). rAaeDV de plásmidos que contienen construcciones de expresión de miRNA, amiRNA, shRNA y miRNA esponja fueron diseñados (se muestra en la figura 1

Discusión

Es importante superar dos de las principales barreras que limitan la construcción de rAaeDV. La primera es la producción de virus recombinante defectuoso. Se ha reportado que MDV se puede utilizar como un vector para expresar apropiadamente genes extranjeros, como el escorpión insectos específicos neurotoxins20 y la proteína GFP; sin embargo, independientemente de la estrategia de construcción, una vez ORFs de MDV se inserta o se reemplazan con genes exógenos, los viriones no pueden formar independientemente a menos que .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Máquina centrífuga	Thermo Scientific	75004260
Sistema de centrífuga	Beckman Coulter	363118
GeneJET Kit de extracción de gel	Thermo Scientific	K0691
E.Z.N.A. Kit Midi de plásmido	Omega Biotech	D6904
Agar purificado	OXOID	LP0028A
Fosfatasa alcalina termosensible FastAP (1 U/µ L)	Thermo Scientific	EF0651
FastDigest HpaI	Thermo Scientific	FD1034
FastDigest XbaI	Thermo Scientific	FD0684
T4 DNA Ligase (5 U/µ L)	Thermo Scientific	EL0011
TransStbl3 Célula químicamente competente	Beijing Transgen Biotech	CD521-01
Ampicilina	Beijing Tiangen Biotech	RT501
Proteinasa K	Promega	MC5008
SuperReal PreMix Plus (SYBR Green)	Beijing Tiangen Biotech	FP205