Aquí describimos un método simple y ampliamente accesible para lesionar nervios segmentarios en larvas de Drosophila para visualizar y cuantificar la neurodegeneración de neuronas motoras en la unión neuromuscular (NMJ) de larvas de tercer estadio.
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Artículo de método
Una Metodología Neuronal Simple de Lesiones Mecánicas para Estudiar
En este artículo
Resumen
Resumen
La degeneración de las neuronas se produce durante el desarrollo normal y en respuesta a lesiones, estrés y enfermedades. Las características celulares de la degeneración neuronal son notablemente similares en los seres humanos e invertebrados como son los mecanismos moleculares que impulsan estos procesos. La mosca de la fruta, Drosophila melanogaster , proporciona un poderoso pero simple organismo modelo genético para estudiar las complejidades celulares de las enfermedades neurodegenerativas. De hecho, aproximadamente el 70% de los genes humanos asociados a la enfermedad tienen un homólogo de Drosophila y una plétora de herramientas y ensayos se han descrito utilizando moscas para estudiar enfermedades neurodegenerativas humanas. Más específicamente, la unión neuromuscular (NMJ) en Drosophila ha demostrado ser un sistema eficaz para estudiar enfermedades neuromusculares debido a la capacidad de analizar las conexiones estructurales entre la neurona y el músculo. Aquí, informamos sobre un ensayo de lesión de neurona motora in vivo en Drosophila , queInduce de forma reproducible la neurodegeneración en el NMJ por 24 h. Utilizando esta metodología, hemos descrito una secuencia temporal de eventos celulares que resultan en la degeneración de la neurona motora. El método de lesión tiene diversas aplicaciones y también se ha utilizado para identificar genes específicos necesarios para la neurodegeneración y diseccionar las respuestas transcripcionales a la lesión neuronal.
Introducción
La degeneración neuronal se produce durante el desarrollo normal y puede ser causada por el proceso de envejecimiento natural, lesiones, estrés o estados de enfermedad. Drosophila melanogaster , la mosca común de la fruta, proporciona un organismo modelo simple y poderoso para estudiar la neurodegeneración debido a las notables similitudes en los mecanismos moleculares que impulsan la degeneración de las neuronas. Estas similitudes se destacan por el hecho de que aproximadamente el 70% de los genes humanos asociados con la enfermedad tienen un homólogo de Drosophila . 1 Además, numerosos ensayos y herramientas tecnológicas para estudiar enfermedades neurodegenerativas humanas se han desarrollado y utilizado en Drosophila. 2 , 3 Dentro de Drosophila , la unión neuromuscular (NMJ) permite el análisis de las propiedades celulares y electrofisiológicas y ha demostrado ser un importante sistema para estudiar la enfermedad neuromuscular debido a la visible nEurón-músculo. 2 En este estudio, describimos un ensayo de lesión neuronal in vivo en larvas de Drosophila que permite la lesión reproducible de los nervios segmentarios. Esta lesión motoneurónica da lugar a una secuencia temporal de eventos celulares que dan como resultado la neurodegeneración en el NMJ 24 h después de la lesión. La capacidad de motoneuronas de lesión reproducible que da lugar a neurodegeneración tiene aplicaciones diversas tales como la identificación de genes específicos requeridos para el proceso degenerativo, la disección de respuestas transcripcionales a lesión neuronal y el análisis de cascadas de señalización protectora. 4 , 5 , 6 Este método también se ha utilizado en combinación con microfluidos para estudiar la degeneración neuronal y la regeneración en animales vivos. 7
Utilizamos un ensayo cuantitativo establecido para examinar la degeneración de las neuronas motorasIon en el Drosophila NMJ después de lesión mecánica. Este ensayo se basa en el hecho de que la pérdida de membrana y proteínas presinápticas precede al desmontaje del retículo subsináptico (SSR) caracterizado por los pliegues de la membrana muscular postsináptica. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 Este ensayo permite la cuantificación de "huellas sinápticas" en las que la neurona pre-sináptica ha perdido la conexión con el músculo postsináptico adyacente. Se ha demostrado que el proceso degenerativo es progresivo a lo largo del desarrollo larvario 12 y no puede explicarse por el desarrollo alterado de la sinapsis o el brote. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 El anuncioLa ventaja de usar lesiones mecánicas sobre mutaciones preexistentes es que permite la disección de la secuencia temporal de eventos celulares que conducen a la neurodegeneración en el NMJ. 13
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Protocolo
1. Preparación de reactivos y equipos
- Preparar 1x Disección Buffer (NaCl 70 mM, KCl 5 mM, 0,02 mM CaCl 2 mM, MgCl 2 20, 10 mM de NaHCO3, sacarosa 115 mM, trehalosa 5 mM, HEPES 5 mM; pH 7,2).
- Preparar 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS).
- Preparar 1x PBT usando 1x PBS con Triton X-100 al 0,01%.
- Preparar las placas de agar de jugo de frutas. 14 Brevemente, mezclar 30 g de agar en 700 ml de H 2 O y autoclave. Disolver 0,5 g de metil parabeno en 10 ml de etanol y agregar la solución a 300 ml de concentrado de jugo de frutas (uva o manzana). Mezclar el concentrado en una solución de agar autoclavada y verter en las tapas de placas de Petri de 10 mm x 35 mm.
NOTA: La premezcla de poder de agar de uva también se puede comprar de varias compañías (ver Tablas de Materiales ). - Obtenga pinzas de tamaño 5 que permitan dañar mecánicamente a las larvas.
- Utilice Drosophila CO 2 estándar basado aparato de anestesia.
2. Selección de larvas de Drosophila
- Tome un vial o una botella de Drosophila que contiene larvas errantes de tercer estadio que se han cultivado a 25 ° C.
- Seleccionar diez 2º individuales o larvas 3ª basados en la apariencia. Las larvas de tercer estadio pueden ser identificadas por la aparición de espiráculos ramificados anteriores, mientras que las larvas de segundo estadio son más pequeñas y tienen más espiráculos anteriores de tipo club.
NOTA: Las etapas Larval también pueden ser identificadas por el momento. A 25 ° C, las larvas del segundo estadio aparecen aproximadamente 48 h después de la eclosión, y las larvas del tercer estadio se mueven aproximadamente 24 h después. Si están interesados en examinar la neurodegeneración en la NMJ, las larvas de segundo estadio necesitan ser lesionadas.
3. Preparación de larvas de Drosophila para lesiones mecánicas
- Cuidadosamente recoger las larvas individuales con una pinza o un pincel, siendo cautelosoNo para comprimirlo de todos modos.
- Coloque directamente diez larvas en un plato de vidrio que contenga 1X PBS frío o tampón de disección para eliminar cualquier desecho de alimentos y para desacelerar la motilidad larvaria.
4. Lesión mecánica y tratamiento de larvas de Drosophila
- Colocar cada larva individual en un aparato de anestesia de CO 2 .
- Bajo un microscopio de disección, cuidadosamente rodar cada larva en su lado dorsal con el fin de visualizar los nervios segmentarios a través de la cutícula.
- Posición de tamaño 5 pinzas de aproximadamente 1/2 a 2/3 de la longitud de la larva a partir de los ganchos boca. Una vez posicionado, pellizque aproximadamente 1/3 de la cutícula ventral que contiene los nervios segmentarios con fórceps de tamaño 5.
- Para asegurarse de que los nervios segmentales larvales se lesionan, aplique fuerza suficiente para aplastar los nervios segmentarios, pero dejar la cutícula intacta. Para determinar la cantidad correcta de fuerza, aplaste 10 larvas y asegúreseLa tasa de mortalidad después de 5 h es inferior al 50%.
- Tras la lesión, transferir cuidadosamente las larvas a una placa de agar de zumo de fruta que contenga aproximadamente 0,5 g de pasta de levadura. Coloque cada larva para que su extremo anterior esté en la pasta de levadura, para la alimentación continua a pesar de la motilidad interrumpida.
NOTA: Para asegurar que los nervios segmentales de las larvas se hayan lesionado, se puede observar la motilidad larval interrumpida tras la transferencia a la placa de agar. Las larvas lesionadas se paralizan de forma efectiva posterior al sitio de la lesión, pero todavía pueden mover sus ganchos bucales y alimentarse. Una alta tasa de mortalidad de los animales después de la lesión es común por lo que es mejor dañar 20-50% más animales de lo necesario para un experimento. - Coloque las placas de agar que contengan pasta de levadura y 10 larvas dañadas en el fondo de una placa de Petri vacía de 100 x 15 mm. Cubra esta placa de Petri, que ahora contiene las larvas dañadas en una placa de agar con una toalla de papel húmedo, asegurando que la toalla de papel no toque las larvas o las placas de agar. Coloque estoPetri en un recipiente hermético más grande, a RT.
- Recuperar larvas para disección después de períodos especificados (6, 12 o 24 h) después de la lesión.
NOTA: Para examinar los efectos inmediatos de la lesión en el citoesqueleto axonal, las larvas pueden ser disecadas directamente después de la lesión. Para examinar defectos de transporte axonal, las larvas pueden ser disecadas aproximadamente 6 h después de la lesión. Alrededor de 12 horas después de la lesión se puede observar una acumulación de proteínas ubiquitinadas, y 24 horas después de la lesión, se puede observar la degeneración de las neuronas motoras en el NMJ.
5. Análisis de la neurodegeneración en el NMJ
- Disecar Drosophila larval NMJ como se describió anteriormente. 15 , 16 En pocas palabras, ponga las larvas en una placa de Sylgard, corte a lo largo de la superficie dorsal, y filetee con los pernos en una gota del amortiguador de la disección para exponer la musculatura de la pared del cuerpo. Fije las larvas en 4% de paraformaldehído (PFA) o solución de Bouin dependiendo del antiCuerpos utilizados para visualizar neuronas y músculos.
NOTA: Debe usarse la fijación de PFA si las etiquetas fluorescentes de la proteína, tales como la proteína fluorescente verde (GFP) se visualizan como fijador de Bouin puede ser demasiado áspera. - Realizar la inmunofluorescencia, que se ha descrito anteriormente 11 , 13 , 16 , para marcar simultáneamente las neuronas motrices presinápticas y pliegues musculares postsinápticos (SSR) adyacentes. Visualice membranas presinápticas y axones con peroxidasa de rábano conjugado con fluorescencia (HRP) (1: 300) 17 y las zonas activas pueden ser teñidas usando un anticuerpo anti-Bruchpilot (Brp) (nc82; 1: 100; Developmental Studies Hybridoma Bank). Simultáneamente etiquetar los músculos post-sinápticos con un anticuerpo anti-Dics Large (Dlg) (1: 10.000). 18
- Realizar un ensayo establecido para cuantificar la neurodegeneración en el NMJ como se describió anteriormente. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 Brevemente, visualice simultáneamente NMJ individuales para los compartimentos pre y post-sinápticos. Cualquier boutons etiquetados con marcadores postsinápticos pero no marcadores presinápticos indican sitios de neurodegeneración ( Figura 1 ). El número medio de boutons por NMJ así como el número medio de NMJs por animal puede ser cuantificado.
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Resultados
Utilizando el procedimiento presentado aquí, hemos demostrado que la lesión neuronal mecánica permite la disección temporal de los eventos neurodegenerativos. 14 , 18 La secuencia de eventos se ha caracterizado previamente y comienza con una interrupción inmediata del citoesqueleto, seguida de defectos de tráfico axonal, acumulación de proteínas ubiquitinadas y posterior neurodegeneración 24 h después de la lesión. Antes de la le...
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Discusión
La lesión mecánica neuronal descrita anteriormente y demostrada aquí puede usarse para inducir lesión / estrés en los nervios segmentarios de larvas de Drosophila . 4 , 5 , 6 , 14 Esta técnica experimental se ha empleado previamente para diseccionar la secuencia temporal de los eventos que conducen a la neurodegeneración, así como para examinar los cambios transcripcionales en los cue...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Nos gustaría agradecer a todos los miembros de los Laboratorios Keller y Magie en la Universidad Quinnipiac por sugerencias útiles. En particular, queremos agradecer a Barron L. Lincoln II por el desarrollo de este ensayo de lesión dentro del Laboratorio Keller. También queremos agradecer a la Universidad de Quinnipiac el premio otorgado a LC Keller.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Tijeras de microdisección | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Dumont #3 Pinzas | Fine Science Tools | 11231-30 | Algunas personas prefieren el tamaño 3, mientras que otras prefieren el tamaño 5 |
| Dumont #5 Pinzas | Fine Science Tools | 11251-30 | Algunas personas prefieren el tamaño 3, mientras que otras prefieren el tamaño 5 |
| CO2 Tanque de aire | Tech Air | UN 1013 | Se pueden comprar varios tamaños de tanque |
| CO2 Aparato de anestesia | Genesee Scientific | 59-114 | |
| Pasadores de acero inoxidable, tamaño 0.1 | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| SylGard 184 Elastómero de silicona, base y agente de curado | Dow Corning | 3097358-1004 | Para verter placas de disección |
| Solución de Bouin | Sigma | HT 10132-1L | debe probar la eficacia de los anticuerpos en el |
| paraformaldehído (PFA) de Bouin y PFA al 4% en solución salina tamponada con fosfato (PBS) | Affymetrix | FLY-8030-20 | eficacia de los anticuerpos debe probarse en |
| microscopio estereoscópico de disección | AmScope | SM-1BZ | |
| Fuente de luz | AmScope | HL150-AY-220V | |
| Anticuerpo anti-nc82 | Estudios del desarrollo Banco de hibridomas | nc82-s | |
| anti-discos anticuerpo grande | Estudios del desarrollo Banco de hibridomas | AF3 | |
| Alexa Fluor peroxidasa anti-rábano picante | Jackson Immunoresearch | 123-545-021; 123-585-021; 123-605-021 | Uno puede Alexa Fluor® 488, 594 o 647 |
| Flystuff Jugo de uva Agar Premezcla | Genesee Scientific | 47-102 | |
| Portaobjetos de microscopio | Genesee Scientific | 29-101 | |
| Cubreobjetos de vidrio | Fisher Scientific | 12-545-87 | |
| Thermo Scientific Nalgene Utility Box | Fisher Scientific | 03-484C | Se utiliza para crear una cámara húmeda para la recuperación de larvas |
Referencias
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