Aquí describimos un método simple y ampliamente accesible para lesionar nervios segmentarios en larvas de Drosophila para visualizar y cuantificar la neurodegeneración de neuronas motoras en la unión neuromuscular (NMJ) de larvas de tercer estadio.
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Artículo de método
Una Metodología Neuronal Simple de Lesiones Mecánicas para Estudiar
En este artículo
Resumen
Resumen
La degeneración de las neuronas se produce durante el desarrollo normal y en respuesta a lesiones, estrés y enfermedades. Las características celulares de la degeneración neuronal son notablemente similares en los seres humanos e invertebrados como son los mecanismos moleculares que impulsan estos procesos. La mosca de la fruta, Drosophila melanogaster , proporciona un poderoso pero simple organismo modelo genético para estudiar las complejidades celulares de las enfermedades neurodegenerativas. De hecho, aproximadamente el 70% de los genes humanos asociados a la enfermedad tienen un homólogo de Drosophila y una plétora de herramientas y ensayos se han descrito utilizando moscas para estudiar enfermedades neurodegenerativas humanas. Más específicamente, la unión neuromuscular (NMJ) en Drosophila ha demostrado ser un sistema eficaz para estudiar enfermedades neuromusculares debido a la capacidad de analizar las conexiones estructurales entre la neurona y el músculo. Aquí, informamos sobre un ensayo de lesión de neurona motora in vivo en Drosophila , queInduce de forma reproducible la neurodegeneración en el NMJ por 24 h. Utilizando esta metodología, hemos descrito una secuencia temporal de eventos celulares que resultan en la degeneración de la neurona motora. El método de lesión tiene diversas aplicaciones y también se ha utilizado para identificar genes específicos necesarios para la neurodegeneración y diseccionar las respuestas transcripcionales a la lesión neuronal.
Introducción
La degeneración neuronal se produce durante el desarrollo normal y puede ser causada por el proceso de envejecimiento natural, lesiones, estrés o estados de enfermedad. Drosophila melanogaster , la mosca común de la fruta, proporciona un organismo modelo simple y poderoso para estudiar la neurodegeneración debido a las notables similitudes en los mecanismos moleculares que impulsan la degeneración de las neuronas. Estas similitudes se destacan por el hecho de que aproximadamente el 70% de los genes humanos asociados con la enfermedad tienen un homólogo de Drosophila . 1 Además, numerosos ensayos y herramientas tecnológicas pa....
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Protocolo
1. Preparación de reactivos y equipos
- Preparar 1x Disección Buffer (NaCl 70 mM, KCl 5 mM, 0,02 mM CaCl 2 mM, MgCl 2 20, 10 mM de NaHCO3, sacarosa 115 mM, trehalosa 5 mM, HEPES 5 mM; pH 7,2).
- Preparar 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS).
- Preparar 1x PBT usando 1x PBS con Triton X-100 al 0,01%.
- Preparar las placas de agar de jugo de frutas. 14 Brevemente, mezclar 30 g de agar en 700 ml de H 2 O y autoclave. Disolver 0,5 g de metil parabeno en 10 ml de etanol y agregar la solución a 300 ml de concentrado de jugo de frutas (uva o manzana). Mezclar el co....
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Resultados
Utilizando el procedimiento presentado aquí, hemos demostrado que la lesión neuronal mecánica permite la disección temporal de los eventos neurodegenerativos. 14 , 18 La secuencia de eventos se ha caracterizado previamente y comienza con una interrupción inmediata del citoesqueleto, seguida de defectos de tráfico axonal, acumulación de proteínas ubiquitinadas y posterior neurodegeneración 24 h después de la lesión. Antes de la le.......
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Discusión
La lesión mecánica neuronal descrita anteriormente y demostrada aquí puede usarse para inducir lesión / estrés en los nervios segmentarios de larvas de Drosophila . 4 , 5 , 6 , 14 Esta técnica experimental se ha empleado previamente para diseccionar la secuencia temporal de los eventos que conducen a la neurodegeneración, así como para examinar los cambios transcripcionales en los cue.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Nos gustaría agradecer a todos los miembros de los Laboratorios Keller y Magie en la Universidad Quinnipiac por sugerencias útiles. En particular, queremos agradecer a Barron L. Lincoln II por el desarrollo de este ensayo de lesión dentro del Laboratorio Keller. También queremos agradecer a la Universidad de Quinnipiac el premio otorgado a LC Keller.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Tijeras de microdisección | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Dumont #3 Pinzas | Fine Science Tools | 11231-30 | Algunas personas prefieren el tamaño 3, mientras que otras prefieren el tamaño 5 |
| Dumont #5 Pinzas | Fine Science Tools | 11251-30 | Algunas personas prefieren el tamaño 3, mientras que otras prefieren el tamaño 5 |
| CO2 Tanque de aire | Tech Air | UN 1013 | Se pueden comprar varios tamaños de tanque |
| CO2 Aparato de anestesia | Genesee Scientific | 59-114 | |
| Pasadores de acero inoxidable, tamaño 0.1 | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| SylGard 184 Elastómero de silicona, base y agente de curado | Dow Corning | 3097358-1004 | Para verter placas de disección |
| Solución de Bouin | Sigma | HT 10132-1L | debe probar la eficacia de los anticuerpos en el |
| paraformaldehído (PFA) de Bouin y PFA al 4% en solución salina tamponada con fosfato (PBS) | Affymetrix | FLY-8030-20 | eficacia de los anticuerpos debe probarse en |
| microscopio estereoscópico de disección | AmScope | SM-1BZ | |
| Fuente de luz | AmScope | HL150-AY-220V | |
| Anticuerpo anti-nc82 | Estudios del desarrollo Banco de hibridomas | nc82-s | |
| anti-discos anticuerpo grande | Estudios del desarrollo Banco de hibridomas | AF3 | |
| Alexa Fluor peroxidasa anti-rábano picante | Jackson Immunoresearch | 123-545-021; 123-585-021; 123-605-021 | Uno puede Alexa Fluor® 488, 594 o 647 |
| Flystuff Jugo de uva Agar Premezcla | Genesee Scientific | 47-102 | |
| Portaobjetos de microscopio | Genesee Scientific | 29-101 | |
| Cubreobjetos de vidrio | Fisher Scientific | 12-545-87 | |
| Thermo Scientific Nalgene Utility Box | Fisher Scientific | 03-484C | Se utiliza para crear una cámara húmeda para la recuperación de larvas |
Referencias
- Bier, E. Drosophilia, the golden bug, emerges as a tool for human genetics. Nat. Rev. Genet. 6 (1), 9-23 (2005).
- Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. Drosophila tools and assays for the study of human diseases. Dis Model Mech. 9 (3), 235-244 (2016).
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Reimpresiones y permisos
