Protocolo de laboratorio para análisis genéticos de contenido intestinal de macroinvertebrados acuáticos con grupo-específica rDNA cartillas

Resumen

Análisis de contenido intestinal más común de macroinvertebrados son visuales. Que requiere intenso conocimiento sobre la diversidad morfológica de los organismos presa, perder presa con cuerpo suave y, debido a la fuerte trituración de presa, son casi imposibles para algunos organismos, incluyendo los anfípodos. Ofrecemos detallados novela enfoques genéticos para macroinvertebrados presa de identificación en la dieta de los anfípodos.

Resumen

Análisis de redes tróficas es esencial para una mejor comprensión de los ecosistemas. Por ejemplo, las interacciones tróficas pueden sufrir cambios severos causados por la invasión de especies no autóctonas. Sin embargo, es difícil en muchos casos una identificación exacta de las interacciones depredador-presa de campo. Estos análisis a menudo se basan en una evaluación visual del contenido de la tripa o el análisis de ratios de isótopos estables (δ¹⁵N y δ¹³C). Tales métodos requieren amplio conocimiento, respectivamente, diversidad morfológica o la firma isotópica de organismos presa individual, conduce a obstáculos en la identificación exacta de organismos presa. Análisis de contenido de Visual intestino especialmente subestimar organismos presa de cuerpo suave, porque maceración, ingestión y digestión de presas organismos dificultan la identificación de especies específicas. Por lo tanto, estrategias de polimerasa en la reacción en cadena (PCR), por ejemplo el uso de la cartilla del específico de grupo se establece, brindan una herramienta poderosa para la investigación de las interacciones tróficas. Aquí, describimos protocolos detallados para investigar el contenido estomacal de los consumidores de macroinvertebrados del campo mediante sistemas específicos de grupo primer nuclear ácido desoxirribonucleico ribosómico (ADNr). ADN puede ser extraído de especímenes enteros (en el caso de taxa pequeño) o de contenido estomacal de ejemplares recolectados en el campo. Presencia y eficiencia funcional de las plantillas de ADN necesitan ser confirmado directamente desde el individuo probado usando la cartilla universal establece contra la subunidad correspondiente del DNA. También demostramos que presa consumida puede ser determinado más a nivel de especie mediante PCR con cebadores específicos de grupo sin modificar combinan con análisis de polimorfismo (SSCP) hebra posterior conformación utilizando geles de poliacrilamida. Además, nos muestran que el uso de diferentes tintes fluorescentes como etiquetas permite proyección paralela para fragmentos de ADN de grupos de presas diferentes de múltiples muestras contenido intestinal mediante el análisis del fragmento automatizado.

Introducción

Las interacciones depredador-presa, que constituyen la mayoría de las interacciones tróficas y dinámica trófica, son aspectos claves para caracterizar los flujos de materia y energía a través de redes tróficas dentro y entre ecosistemas, que es uno de los principales objetivos de la ecología ¹. la determinación de la fuente y el flujo de carbono y nutrientes es promover la comprensión de la conectividad ecológica entre los ecosistemas². Sin embargo, los ecosistemas, tales como ríos y sus cuencas, no están ligados sólo por flujos de materia orgánica y nutrientes sino también por los movimientos de los organismos

Protocolo

1. recoger los macroinvertebrados en el campo y preparar las muestras para los análisis de contenido intestinal genéticos.

1. Colecta de macroinvertebrados en cada sitio, ordenar a individuos de especies de consumo de interés en tubos individuales y congelarlas directamente en nitrógeno líquido o hielo seco para evitar la separación de la tripa y la degradación de DNA.
   Nota: Evite guardar las muestras en alcohol, porque algunos macroinvertebrados suelen regurgitar antes de que el alcohol mata.
2. Uso sólo del tracto gastro-intestinal de medianas y grandes (aproximadamente > mm 3) especies de macroinvertebrados para análisis de conteni....

Resultados

Hemos utilizado con éxito pasos descritos en este protocolo para el análisis de la dieta en diferentes estudios. En esta sección, presentamos ejemplos que describe la aplicabilidad de las distintas secciones del protocolo.

Por ejemplo, para demostrar la efectividad de los sistemas de primer grupo-específica establecida por los autores²⁸ y el potencial de mayores aguas abajo análisis de productos PCR por a.......

Discusión

Aquí, presentamos un método fácil y costo-eficiente para la polimerización en cadena-basado determinación de interacciones depredador-presa de muestras de campo a través de cartillas de Grupo-específicas para las regiones de ADNr, que pueden combinarse con otros análisis no moleculares de las mismas muestras. Sin embargo, hay varios pasos críticos dentro del protocolo. En primer lugar, es esencial asegurar la especificidad de los cebadores utilizados. En segundo lugar, es crucial para evitar la contaminación y pérdida de.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
nitrógeno líquido	Cualquier	NA	Para el transporte de muestras de campo de macroinvertebrados al laboratorio.
Tubos de reacción de 1,5 ml - Safelock	Any	NA	Para la recolección de muestras de consumo en el campo y su posterior conservación en nitrógeno líquido, los tubos de reacción no necesitan estar necesariamente limpios por PCR. Para evitar la explosión de los tubos, la tapa de los tubos debe perforarse con una aguja.
Microscopio estereoscópico	Cualquier	NA	Asegúrese de que el aumento sea adecuado para preparar el tracto gastrointestinal del tamaño del consumidor de interés.
Placas de Petri	Cualquier	NA	Para diseccionar el tracto gastrointestinal de especímenes de consumo bajo el estereomikroscopio.
Fórceps de acero inoxidable: pinza Dumont n.º 7	Bioform	B40d	Esta pinza curvada de acero inoxidable a veces puede ser muy útil para sujetar la muestra fija entre la parte curva sin perforar el tracto gastrointestinal.
Fórceps de acero inoxidable: Pinza Dumont Electronic Nº 5	Bioform	B40b	Esta fina pinza de acero inoxidable es ideal para la preparación del tracto gastrointestinal de muestras de consumo.
DNA-ExitusPlus	AppliChem	A7409,1000RF	Solución de descontaminación para la eliminación de contaminaciones de ADN y ARN
Toalla de papel sin pelusa	Cualquier
Cualquier		precisión	debe ser de al menos 0,01 g.
Pipetas de microlitros (0,5-10/10-100/50-200/100-1000 μ L)	Cualquier	NA
Safe-Lock 2.0 ml	VWR	211-2165	¡Es crucial que estos tubos de reacción estén libres de ADN, DNasa, RNasa e inhibidores de PCR (PCR clean)!
Tubos Safe-Lock 1,5 ml	VWR	211-2164	¡Es crucial que estos tubos de reacción estén libres de ADN, DNasa, RNasa e inhibidores de PCR (PCR clean)!
Cloruro de sodio ≥ 99.5%, p.a., ACS, ISO	carlroth	3957.3	Para tampón de extracción de sal (SEB) y solución de NaCl 5M necesarios para la extracción de ADN.
Tris(hidroximetil)-aminometano Tris	carlroth	4855.2	Para tampón de extracción de sal (SEB) y tampón TBE
Pipetas de microlitros (0,5-10/10-100/50-200/100-1000 μ L)	carlroth	8043.1	Para tampón de extracción de sal (SEB) y tampón TBE
Ácido bórico ≥ 99,8 %, p.a., ACS, ISO	carlroth	6943.2	Para tampón TBE. No es necesario si se obtiene un tampón TBE disponible en el mercado.
Dodecil sulfato de sodio (SDS)	carlroth	4360.1	Para la extracción de ADN
proteinasa K liofilo.	carlroth	7528.1	Prepare una solución de trabajo que contenga 10 mg/ml.
TissueLyser II	Quiagen	85300	Molino de bolas para la homogeneización de las muestras.
Perlas de acero inoxidable, 5 mm	Quiagen	69989	Para la homogeneización de muestras.
Termoagitador de calefacción	Cualquier	NA
Mezclador de vórtice	Cualquier	NA
Centrífuga refrigerada: himac CT 15 RE	Hitachi	NA	Centrífuga refrigerada utilizada para la centrifugación durante la extracción de ADN (Protocolo 1).
Isopropanol	carlroth	6752.5
Etanol 99.8 %, p.a.	Cualquier
agua de NA Agua de biología molecular (ddH2O)	AppliChem	A7398,1000	agua libre de nucleasas (esterilizada por corriente y tratada con DPC) utilizada para la resuspensión de ADN y siempre que se haga referencia a ddH2O dentro del manuscrito
Olegonucleótidos no modificados	Eurofins MWG Operon	NA	Primers sin etiquetar
Olegonucleótidos modificados	Metabion International AG	NA	Imprimaciones con la etiqueta
peqGOLD Taq todo incluido	VWR Peqlab	01-1000	Taq todo incluido para mezclas de reacción PCR (tampón de reacción Y y S, dNTPs y MgCl2)
Termociclador de gradiente avanzado Primus 96 o peqStar96x Universal Gradient	Peqlab	NA	Los juegos de cebadores se establecieron originalmente en un termociclador de gradiente avanzado Primus 96. Como este ciclador era bastante antiguo, comprobamos si nuestros juegos de cebadores eran eficientes y específicos en las mismas condiciones utilizando el peqSta96x (que también podía simular el modelo anterior). Sin embargo, las pruebas demostraron que nuestros cebadores funcionan bien y siguen siendo específicos (véase Koester et al. 2013) sin utilizar la simulación de la máquina antigua.
Placas de PCR estándar de 96 pocillos	VWR Peqlab	732-2879	utilizadas para reacciones de PCR.
Tiras de tubo de perfil bajo de 0,15 ml con tiras de tapa plana	VWR Peqlab	732-3223	Tiras de tapa utilizadas para cerrar las placas de PCR.
Agarosa	Peqlab	35-1020	Se utiliza para la electroforesis en gel.
Microondas	Cualquier	NA
Matraz cónico	Cualquier	NA
Cilindro de medición	Cualquier	NA
Unidad de electroforesis horizontal y sus respectivos peines con dientes	Cualquier	NA	Para electroforesis en gel de agarosa.
Fuente de alimentación para electroforesis PS3002	Life Technologies	NA
Solución de bromuro de etidio 1 %	carlroth	2218.1	Se utiliza para preparar un baño de tinción para geles de agarosa.
Formamida	carlroth	6749.1	Necesario para el tampón de desnaturalización para análisis SSCP.
Azul de bromphenol	AppliChem	A3640.0010	Necesario para la carga de colorante para la electroforesis en gel de agarosa.
Sacarosa	carlroth	4621.1	Necesaria para el colorante de carga para la electroforesis en gel de agarosa.
100 bp-DNA-Escalera extendida	carlroth	T835.1	Como tamaño estándar para la electroforesis en gel de agarosa.
Sistema de documentación UV	Cualquier	NA	Para visualizar los resultados de la electroforesis en gel.
Rotiphorese NF-Acrilamida/Bis-solución 40 % (29:1)	carlroth	A121.1	Para la preparación de geles de poliacrílamida.
Peroxidisulfato de amonio	carlroth	9592.2	Para la preparación de geles de poliacrílamida.
clips plegables (32 mm)	Cualquier	NA	Para la preparación de geles de poliacrílamida.
caja de plástico de forma cuadrada (21 &veces; 6,5 veces; 5 cm)	Cualquier	NA	Para la preparación de geles de poliacrílamida.
Tetrametiletilendiamina (TEMED)	carlroth	23.67.1	Para la preparación de geles de poliacrilamida.
Vaso de precipitados	Any	NA
RC 10 Enfriador digital	VWR	462-0138	Para análisis SSCP mediante electroforesis en gel de poliacrilamida.
Unidad de electroforesis vertical P10DS (OWL Separation Systems)	VWR	700-2361	Para análisis SSCP con electroforesis en gel de poliacrilamida.
Placa de vidrio con muescas	VWR	730-0261	Para análisis SSCP con electroforesis en gel de poliacrilamida.
Placa de vidrio en bruto	VWR	730-0260	Para análisis SSCP mediante electroforesis en gel de poliacrilamida.
Espaciadores	VWR	730-0262	Para análisis SSCP mediante electroforesis en gel de poliacrilamida.
Peine de 25 dientes	VWR	730-0294	Para análisis SSCP con electroforesis en gel de poliacrilamida.
Plataforma de agitación	Cualquier	NA	Para la agitación constante del baño de tinción.
Tinción de ácido nucleico GelStar (Lonza Rockland, Inc.)	Biozym	850535 (50535)	Para la tinción de geles de poliacrilamida.
GenomeLab DNA Size Standard Kit 400bp	AB Sciex	608098	Para análisis automatizados de fragmentos. Estándar de tamaño para el lote B.
GenomeLab DNA Size Standard Kit 600bp	AB Sciex 608095		Para análisis automatizados de fragmentos. Estándar de tamaño para el lote A.
Solución de carga de muestras (SLS)	AB Sciex	608082	Para análisis automatizados de fragmentos.
Placa de secuestro - Microplaca PCR de polipropileno de 96 pocillos	Costar	6551	Para análisis automatizados de fragmentos.
Centrífuga de placas, minicentrífuga de placas PerfectSpin P	VWR Peqlab	NA	utilizada para centrifugar productos de PCR.
Placa amortiguadora - 96 pocillos EIA/RIA Poliestireno transparente de fondo plano sin tratar Microplaca	Corning	9017	Para análisis automatizados de fragmentos.
GenomeLab Tampón de separación	AB Sciex	608012	Para análisis automatizados de fragmentos.
Gel de separación - LPAI	AB Sciex	608010	Para análisis automatizados de fragmentos.
Sequenzer - CEQ8000 Sistema de Análisis Genético	Beckman Coulter	NA	Para análisis automatizados de fragmentos.
GeneMarker V1.95	Softgenetics	NA	Para analizar los resultados de análisis automatizados de fragmentos.

báscula de laboratorio NA NA tubo