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Artículo de método

Protocolo de laboratorio para análisis genéticos de contenido intestinal de macroinvertebrados acuáticos con grupo-específica rDNA cartillas

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DOI:

10.3791/56132

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5 de octubre de 2017

 , 
1Institute for Environmental Sciences, University of Koblenz-Landau, 2Institute of Integrated Natural Sciences, University of Koblenz-Landau, 3IV 2.5 (Trace Analysis, Artificial Pond and stream system), Federal Environment Agency

En este artículo

Resumen

Análisis de contenido intestinal más común de macroinvertebrados son visuales. Que requiere intenso conocimiento sobre la diversidad morfológica de los organismos presa, perder presa con cuerpo suave y, debido a la fuerte trituración de presa, son casi imposibles para algunos organismos, incluyendo los anfípodos. Ofrecemos detallados novela enfoques genéticos para macroinvertebrados presa de identificación en la dieta de los anfípodos.

Resumen

Análisis de redes tróficas es esencial para una mejor comprensión de los ecosistemas. Por ejemplo, las interacciones tróficas pueden sufrir cambios severos causados por la invasión de especies no autóctonas. Sin embargo, es difícil en muchos casos una identificación exacta de las interacciones depredador-presa de campo. Estos análisis a menudo se basan en una evaluación visual del contenido de la tripa o el análisis de ratios de isótopos estables (δ15N y δ13C). Tales métodos requieren amplio conocimiento, respectivamente, diversidad morfológica o la firma isotópica de organismos presa individual, conduce a obstáculos en la identificación exacta de organismos presa. Análisis de contenido de Visual intestino especialmente subestimar organismos presa de cuerpo suave, porque maceración, ingestión y digestión de presas organismos dificultan la identificación de especies específicas. Por lo tanto, estrategias de polimerasa en la reacción en cadena (PCR), por ejemplo el uso de la cartilla del específico de grupo se establece, brindan una herramienta poderosa para la investigación de las interacciones tróficas. Aquí, describimos protocolos detallados para investigar el contenido estomacal de los consumidores de macroinvertebrados del campo mediante sistemas específicos de grupo primer nuclear ácido desoxirribonucleico ribosómico (ADNr). ADN puede ser extraído de especímenes enteros (en el caso de taxa pequeño) o de contenido estomacal de ejemplares recolectados en el campo. Presencia y eficiencia funcional de las plantillas de ADN necesitan ser confirmado directamente desde el individuo probado usando la cartilla universal establece contra la subunidad correspondiente del DNA. También demostramos que presa consumida puede ser determinado más a nivel de especie mediante PCR con cebadores específicos de grupo sin modificar combinan con análisis de polimorfismo (SSCP) hebra posterior conformación utilizando geles de poliacrilamida. Además, nos muestran que el uso de diferentes tintes fluorescentes como etiquetas permite proyección paralela para fragmentos de ADN de grupos de presas diferentes de múltiples muestras contenido intestinal mediante el análisis del fragmento automatizado.

Introducción

Las interacciones depredador-presa, que constituyen la mayoría de las interacciones tróficas y dinámica trófica, son aspectos claves para caracterizar los flujos de materia y energía a través de redes tróficas dentro y entre ecosistemas, que es uno de los principales objetivos de la ecología 1. la determinación de la fuente y el flujo de carbono y nutrientes es promover la comprensión de la conectividad ecológica entre los ecosistemas2. Sin embargo, los ecosistemas, tales como ríos y sus cuencas, no están ligados sólo por flujos de materia orgánica y nutrientes sino también por los movimientos de los organismos3. Así, alteraciones de hábitat interrumpiendo el flujo de recursos que los sistemas pueden fuertemente alterar las redes tróficas de ambos ecosistemas, no sólo directamente sino también indirectamente cambiando la composición respectiva de las comunidades de depredador-presa. Por ejemplo, cambios de redes tróficas han demostrado para ser ligado a los movimientos de depredador solo especies (e.g., trucha arco iris)4. Tales cambios potencialmente amenazan la biodiversidad y el funcionamiento de los ecosistemas acuáticos. Por lo tanto, analizando las interacciones depredador-presa en el campo es esencial para determinar el impacto de los cambios ambientales inducidos por humanos, como prácticas de manejo de agua, en la biodiversidad nativa de los ecosistemas acuáticos.

Puesto que el seguimiento de los vínculos tróficos es difícil en sistemas complejos, varios acercamientos se han establecido que permiten la evaluación de la alimentación de las interacciones en el campo5. Tradicionalmente, las investigaciones de interacciones en el campo de la alimentación se basan en la identificación visual de los restos de la presa en intestinos disecados y requieren un amplio conocimiento acerca de la diversidad morfológica de la presa. Análisis de contenido de Visual intestino han proporcionado penetraciones en el uso de los recursos de varios grupos de consumidores (por ejemplo, variación estacional en la dieta de langosta pescado de6 y7,8 o alimentación preferencias de copépodos). Sin embargo, el proceso físico de digestión dificulta el análisis de contenido de visual intestino y generalmente falta presa-organismos con cuerpo blando9. Para la alimentación de las especies por ingestión de líquido o para algunos consumidores invertebrados que intensivo dilacerar su comida antes de la ingestión, como anfípodos, identificación visual de especies de presas en contenido estomacal es imposible10. Debido a estas limitaciones, el análisis molecular ofrece una alternativa prometedora.

Los análisis moleculares se han convertido en una herramienta común que permiten la detección de la presa rápida y precisa en el contenido estomacal. La gama de tales técnicas es diversa: estrategias basadas en anticuerpos monoclonales o reacciones en cadena de polimerasa (polimerización en cadena) se utilizan a menudo, debido a su alta especificidad y sensibilidad11. El desarrollo de nuevos anticuerpos monoclonales es intensivo en tiempo y costo, por lo tanto, la aplicación de otras técnicas moleculares es más útil cuando los anticuerpos ya no existen11. Otro método común es la amplificación de regiones del ácido desoxirribonucleico (ADN), como el ácido ribonucleico ribosomal (ARN) genes presentes en la mayoría de las especies, usando la cartilla universal establece12,13. Cuando se utiliza esta técnica, a menudo no es posible identificar toda la gama de organismos presa dentro de fuentes mixtas de ADN14. Un enfoque eficaz para evitar tal inconveniente es usar primer grupo-específicas para el análisis de contenido intestinal genéticos. Diseñado para amplificar sólo regiones de ADN de grupos particulares y excluyen otras especies15,16, cebadores específicos de Grupo permiten la identificación de organismos presa en el nivel taxonómico de los grupos especificados sin análisis secundario de tiempo y costosa. Sin embargo, como todo análisis de contenido de la tripa, tales análisis proporcionan sólo una instantánea del comportamiento alimentario. Por lo tanto, la combinación de análisis de contenido intestinal molecular con análisis de marcadores naturales integración de tiempo (por ejemplo, los isótopos estables) se considera beneficioso1,2.

Aquí, describimos un método detallado para las investigaciones basadas en la PCR de las interacciones depredador-presa utilizando conjuntos de primer grupo-específicas para las regiones de ADN (ADNr) ribosomales nucleares para ser combinado con análisis de isótopos estables de la misma muestra. Describimos la detección de ADN de grupos de presas solo mediante electroforesis en gel de agarosa. Además, se presenta una oportunidad para mayores posteriores análisis de productos PCR de tales cartillas de Grupo-específicas aplicables siempre que se requiera una mayor resolución taxonómica que la especificidad de los cebadores. Porque la sola DNA trenzada (ssDNA) fragmentos de conformaciones terciaria de forma que se determinaron por su secuencia primaria17, pequeñas variaciones en los fragmentos amplificados por tales cebadores específicos de grupo conducen a cambios conformacionales. Estos cambios pueden detectarse por análisis de polimorfismo (SSCP) conformación de cadena única con geles de poliacrilamida17,18, lo que permite una identificación más precisa de organismos presa (hasta el nivel de especie).

Mientras que la electroforesis en gel de agarosa es una herramienta común y barata para visualizar fragmentos de ADN y determinar su longitud aproximada19, la resolución depende de la cantidad de ADN y el tinción colorante usado20. Por lo general, la visualización es sencillo cuando se trabaja con muestras de ADN puras, pero potencialmente bajas cantidades de presas DNA en el contenido estomacal de los consumidores puede complicar el marcador de resultados de electroforesis de gel de agarosa. Todavía, este método de detección es factible para detectar un bajo número de muestras al consumidor desde el campo uno o presa de algunos grupos, pero complicación en el marcador hace que la proyección de un gran número de muestras por múltiples presas taxones extremadamente tiempo intensivo y así impracticable. Un método de detección más sensible es el análisis automatizado de fragmentos por electroforesis capilar, que además permite la determinación de la longitud exacta de fragmentos21. Varios microsatélites en estudios han demostrado que mediante el uso de diferentes tintes fluorescentes como las etiquetas, es posible detectar y determinar diferentes fragmentos de longitud comparable por fragmento automatizado análisis22,23, 24. Por lo tanto, también presentamos un protocolo detallado para paralelo detección de ADN de presas múltiples grupos mediante PCR con conjuntos de etiquetado específico de grupo primer y detección mediante análisis del fragmento automatizado con un secuenciador automatizado. Además, presentamos los resultados de un estudio de caso que demuestra que la detección del ADN de la presa mediante el análisis del fragmento automatizado es un enfoque que también permite una cuantificación relativa de la presa ingerida.

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Protocolo

1. recoger los macroinvertebrados en el campo y preparar las muestras para los análisis de contenido intestinal genéticos.

  1. Colecta de macroinvertebrados en cada sitio, ordenar a individuos de especies de consumo de interés en tubos individuales y congelarlas directamente en nitrógeno líquido o hielo seco para evitar la separación de la tripa y la degradación de DNA.
    Nota: Evite guardar las muestras en alcohol, porque algunos macroinvertebrados suelen regurgitar antes de que el alcohol mata.
  2. Uso sólo del tracto gastro-intestinal de medianas y grandes (aproximadamente > mm 3) especies de macroinvertebrados para análisis de contenido intestinal genéticos así lo restante de la muestra puede ser utilizada para otros procedimientos (por ejemplo, isótopos estables Análisis). Tenga en cuenta que esto no es aplicable al investigar taxones muy pequeños como ácaros de agua. Por lo tanto, pueden omitirse pasos 1.2.1 y 1.2.2.
    1. Descongela ligeramente un individuo y diseccionar cuidadosamente su tracto gastro-intestinal bajo un estereomicroscopio con unas pinzas finas de acero inoxidable. Asegúrese de no pinchar el tracto gastro-intestinal para evitar la pérdida de la materia.
      2. Pinzas de
    2. limpiar con solución de descontaminación para eliminar contaminaciones de DNA y RNA después de la preparación de cada tracto gastro-intestinal. Por lo tanto, incubar fórceps durante 10 min en la solución de descontaminación. Luego, enjuagar con agua estéril para retirar residuos y limpiarlo con una toalla de papel sin pelusa.
    3. Transferencia del tracto gastrointestinal disecado a una reacción de safe-lock 2.0 mL del tubo que contiene 440 μl (450 μl posible uso de pipeta repetitiva) de tampón de extracción de la sal [SEB; 0,4 M cloruro de sodio (NaCl), 10 mM Tris (hidroximetil)-aminometano clorhidrato (Tris-HCl) pH 8.0 y sal de disodio del ácido etilendiaminotetracético 2 mM deshidratan pH 8.0 de (EDTA)]. Tienda preparado muestras en − 20 ° C inmediatamente hasta la extracción de ADN. Asegurar que se extraerá ADN dentro de un par de días.
  3. Utilizar un protocolo de extracción de sal modificada 25 para extraer ADN.
    1. Toma de muestras fuera del congelador. Utilizar pinzas para añadir una bola de acero inoxidable de 5 mm a cada tubo de muestras y dejar las muestras congeladas en el Banco a temperatura ambiente (RT) para descongelar. Utilizar un molino de grano para homogeneizar las muestras durante 1 min a 15 Hz.
    2. Desactivación de muestras con un corto plazo de una centrifugadora. Utilizar pipetas de microlitro para agregar 90 μl (100 μl posible para el uso de la pipeta repetitiva) solución 10% de sodio dodecil sulfato (SDS) y 5 μl de proteinasa K. de 10 mg/mL
    3. Vortex muestras bien y mezclas por 1 h a 60 ° C con agitación constante a 400 rpm en un Termomezcladores de incubar. Además, bien torbellino muestras cada 10 minutos para promover aún más la lisis.
    4. Vuelta abajo las muestras con un corto plazo de una centrifugadora, añadir 350 μl de 5 M de NaCl con una pipeta microlitros y agitar bien para aproximadamente 0,5 - 1min centrifugar las muestras durante 40 min a 16.200 x g a 5 ° C.
      Nota: Si varios sistemas en una fila tienen que hacer, la temperatura de la centrífuga necesita ser ligeramente levantado (no superior a 10 ° C) porque SDS tiende a flocular si la temperatura es demasiado baja.
      5. Pipetas de microlitro de uso
    5. para transferir aproximadamente 600 μl de sobrenadante a un nuevo tubo de reacción de 1,5 mL. Tenga cuidado de no quitar nada de la pelotilla de.
      6. Granos de
    6. punta de acero inoxidable de los tubos de reacción en un colador de té de acero inoxidable, limpiar con agua corriente y les Incube en un plato Petri con la solución de descontaminación para 10 minutos enjuagar bien la solución de descontaminación con estéril de agua y almacenar granos limpios en etanol (> 99%, grado p.a.) o secos hasta reutilización.
      Nota: Limpieza de cuentas no necesita hacer en este paso directamente, pero algo se puede hacer siempre que haya tiempo de espera en los pasos siguientes.
    7. Añadir 600 μl de isopropanol helada (grado p.a.) en el sobrenadante con un microlitro pipeta e invertir cuidadosamente el tubo un par de veces. Almacenar las muestras durante la noche a -20 ° C.
    8. Tomar muestras fuera del congelador y centrifugar 20 min a 16.200 x g y temperatura ambiente. Cuidadosamente, deseche el sobrenadante y secar el tubo cuidadosamente con papel sin pelusa. Tenga en cuenta que si la temperatura ambiente es alta (más de 25 ° C), centrifugar a 5 ° C para evitar que los pellets deslizarse mientras descartando el sobrenadante.
      9. Lavado de
    9. bolitas que contienen ADN con etanol al 70%. Para ello, añada 200 μL de etanol helada (70%, grado p.a.) utilizando una pipeta microlitros y centrifugar las muestras durante 10 minutos a 16.200 x g y temperatura ambiente (o 5 ° C, si es necesario). Cuidadosamente, deseche el sobrenadante y secar el tubo cuidadosamente con papel sin pelusa. Utiliza una pipeta μl 10 ajustado a aproximadamente 8 μl de pipeta cuidadosamente apagado el sobrenadante restante. Asegúrese de no perturbar el sedimento.
    10. Secar el pellet para aproximadamente 5-20 min a 60 ° C o a temperatura ambiente en el Banco hasta que el etanol se evapora.
    11. Pellets de disolver en 50-100 μl libre de nucleasas (vapor esterilizado y tratada DEPC) agua (ddH 2 O), espere al menos 1 h (aunque se obtienen mejores resultados durante la noche a 4 ° C).
    12. Medir la cantidad de ADN contenida en cada muestra con un espectrofotómetro micro volumen, según el fabricante ' instrucciones. Hacer una dilución de trabajo de cada muestra que contiene aproximadamente 2-10 ng de ADN / μl. mantener la solución en el congelador. Mantener la solución de trabajo en el frigorífico y asegúrese de que muestra mayor procesamiento se realiza poco.

2. Verificar eficiencia funcional de extractos de ADN para la detección posterior de la presa recientemente ingerido.

  1. Para asegurar la presencia y la eficiencia funcional de las plantillas, prueba cada extracto de ADN (pasos 1.1 a 1.3.11) usando la cartilla universal fija adecuada para la alimentación respectiva (por ejemplo, los invertebrados 16 , 26) que apuntan a la misma subunidad nuclear como el primer grupo-específica, utilizada para la posterior detección de presa 25 , 27. Los pasos siguientes se refieren a la utilización de sistemas de imprimación universal NSF1419/20 y NSR1642/16 16 y LSU D1, D2 fw1 y LSU D1, D2 rev2 o LSU D1, D2 rev4 26. Para demostrar que la reacción de PCR ha sido exitosa y que no llevó a cabo ninguna contaminación, utilizar un control positivo que contiene ADN que ya había sido amplificado con éxito y muestra de un control que contenga ddH 2 O en lugar de ADN dentro de cada PCR ejecutar.
    1. Para preparar soluciones de trabajo que contienen una concentración final de 10 μm de la cartilla, pipetear la cantidad apropiada de la cartilla respectiva acción solución y ddH 2 O (dependiendo de la concentración de la solución madre) de cartilla en un tubo de reacción de 1,5 mL fresco usando Micropipetas.
    2. Añadir cebadores, mezcla de Deoxinucleótidos (dNTPs), tampón de reacción, tubo de reacción de Taq ADN polimerasa y ddH 2 O de 1,5 o 2,0 mL (dependiendo del número de muestras a procesar) y vórtice esta mezcla. Detallada los volúmenes de la mezcla de reacción estándar para una reacción de PCR de 10 μl se dan en la tabla 1 (para información de productos químicos utilizados, véase Tabla de materiales).
      3. Extracción de
    3. uso microlitro Pipetas para transferir cada 1 μl de ADN en 9 μl de thmezcla de reacción estándar de e dentro de un tubo PCR (o un pozo de una placa de la polimerización en cadena). Cerrar el tubo de reacción o los pocillos de la placa (con rayas de tapa).
    4. Programa del termociclador: es el protocolo estándar para el conjunto de la cartilla de NSF1419/20 y NSR1642/16 16: 94 ° C durante 4 min (desnaturalización), seguido de 30 ciclos de 94 ° C por 30 s, 50 ° C (temperatura de recocido) durante 30 s, 72 ° C durante 90 s y una extensión final a 72 ° C durante 10 minutos. Para la imprimación LSU establece 26, utilice lo siguiente: 94 ° C durante 4 min, seguido de 45 ciclos de 94 ° C por 20 s, 52,5 ° C por 20 s, 72 ° C durante 90 s y una extensión final a 72 ° C durante 8 minutos
    5. Tubos de PCR de lugar o placas en el termociclador, cierre la tapa de la cycler e iniciar el programa.
    6. Preparar una agarosa 1.5% gel con una solución tampón que contiene Tris base, ácido bórico y EDTA (tampón TBE) y agarosa. Para la preparación de un gel de agarosa al 1,5%, con una bandeja de gel casting con dimensiones de 10 cm × 7,5 cm × 3 cm, pesa 0,45 g agarosa en un matraz cónico, utilice una probeta para medir 30 mL de tampón de x TBE 1 (89 mM Tris pH 7,6, el ácido bórico 89 mM y 2 mM EDTA, pH 8.0) y verter en el frasco cónico. Calentar la mezcla usando un microondas. Parar el microondas cada vez que hay burbujas de aire grandes y agitar cuidadosamente el matraz hasta que la solución tiene sólo una fase.
    7. Enfriar la solución a aproximadamente 60 ° C, agitar el matraz en un baño de agua. Rápidamente verter la solución en una bandeja de gel casting eliminar burbujas de aire y colocar los peines. Esperar unos 20 min hasta que el gel se endurece.
      8. Unidad de electroforesis
    8. relleno con 0,5 x TBE y Coloque gel casting bandeja que contiene el gel de agarosa. Asegúrese de que las ranuras de gel libres de burbujas de aire.
    9. Desactivación de los productos PCR mediante la opción run corto de una centrifugadora de mini (placa). Utilice una pipeta microlitros para mezclar cada 3 μl del producto de PCR con 1 μl de 6 x tinte (40% de sacarosa y 0,25% azul de bromofenol) de carga y carga en las ranuras del gel del gel de agarosa. Pipetear 1,5 μl de una escalera de DNA 100 bp en una ranura de cada línea con una pipeta microlitros como tamaño estándar. Vuelva a colocar la tapa de la unidad de electroforesis correctamente y conecte los cables a una fuente de alimentación. Correr el gel a 100 V/cm durante 35 minutos
    10. Para preparar un baño de tinción, pour 1.000 mL de 1 x TBE en una caja plástica cuadrada impermeable a la luz. Añadir 50 μl de bromuro de etidio con una pipeta de microlitros, cierre la tapa de la caja de plástico y agite para asegurar la distribución equitativa del bromuro de etidio.
    11. Quitar el gel de la unidad de electroforesis y colóquelo en el baño de tinción durante aproximadamente 10 minutos. Luego, tomar el gel en el baño de tinción y colóquela en un sistema de documentación de gel y visualizar según el manual.
    12. Analizar sólo las muestras que mostraron resultados positivos (fragmentos de tamaño adecuado visual en gel de agarosa) en términos de presencia y eficiencia funcional de las plantillas para la posterior detección de presas recientemente ingeridos.
de < t d > 0,25 μl de
solución de trabajo de la concentraciónPCR-MixMix 10 reacción de PCR μlconcentración Final en la polimerización en
Primer FW10 μm0.5 μl0.5 μm
Cartilla RW10 μmde 0.5 & #956 ; l0.5 μm
buffer de reacción (20 mM Tris-HCl, pH 8,55, 16 m m (NH4) 2SO4 y concentraciones finales de MgCl2 2 mM)1 μm1 μl1 μm
dNTP10 mM0.25 mM
5 UTaq polimerasa0.1 μl0.05 U
ddH 2 06.65 μl
< stro ng > Total de mezcla de reacción de la cantidad9 μl
ADN1 μl

Tabla 1: detalle de protocolo para la preparación de la mezcla de reacción estándar para una reacción de PCR de 10 μl.

3. detectar presas/alimentos recientemente ingeridos con conjuntos de Primer grupo-específica usando la electroforesis del Gel.

  1. Realizar PCR utilizando que los extractos de la solución de trabajo de la DNA (preparado según pasos 1.1 a 1.3.11) y el conjunto del primer grupo-específica (sin etiqueta, es decir, sin modificación) apropiado para el grupo presa dirigido como se describen en pasos 2.1.1 al 2.1.3 (variaciones en la mezcla de reacción para el conjunto de la cartilla respectiva, ver tabla 2). Ejecutar la polimerización en cadena usando el protocolo estándar de paso 2.1.4 (recocido las temperaturas para el conjunto de la cartilla respectiva, ver tabla 2).
    1. Utilizar un control con ADN puro de un espécimen perteneciente al grupo de blanco respectivo (control positivo) y un control negativo con el puro ADN de las especies de consumo en cada PCR ejecutar.
  2. Compruebe el éxito de la reacción de polimerización en cadena usando la electroforesis del gel de agarosa se describe en pasos 2.1.6 a 2.1.11. La reacción de PCR fue exitosa si un fragmento de la longitud correcta (ver tabla 2) es visible para el control positivo, pero no para el control negativo. Si uno o ambos de estos criterios están incumplidas, repetir PCR.
    3. Agarosa de uso
  3. gel de electroforesis, como se describe en pasos 2.1.6 a 2.1.11, para detectar si el grupo presa blanco había sido consumido por el consumidor diferentes muestras analizadas (a través de juicio de que el fragmento de longitud apropiada sea visible o no). Asegúrese de que no se pierdan fragmentos con baja resolución visual.
  4. Productos de PCR de almacén a 4 ° C, si más análisis se realizará dentro de las 24 horas, o a-20 ° C si los análisis deben realizarse más adelante.

4. Determinar posteriormente la presa consumida más abajo usando análisis de SSCP mediante geles de poliacrilamida.

  1. Prepara un gel de acrilamida de 9% para electroforesis SSCP. Preparar las soluciones de trabajo en una campana de laboratorio.
    1. Para preparar una solución de trabajo de acrilamida de 200 mL, llene una probeta 20 ml de 10 x TBE (109 g de Tris base, 55 g de ácido bórico y 40 mL de 0.50 M de EDTA, pH 8.0 disuelto en 1000 mL de ddH 2 O) y otra con 45 mL de 40% (29: 1) mezcla de acrilamida. Vierta la mezcla TBE y acrilamida en un matraz aforado (un frasco de vidrio graduado con una marca de 200 mL es apropiado aquí) y añadir ddH 2 O hasta la marca de 200 mL. Seguir trabajando solución en la nevera (4 ° C) hasta que se necesite. No utilice solución de trabajo de más de una semana.
    2. Pesar 0,1 g de persulfato de amonio (APS; uso una balanza con una precisión al menos 0,01 g) en un matraz aforado 1 mL y se disuelven por adición de ddH 2 O hasta la graduación marca para preparar una solución stock al 10% APS. Transferir alícuotas (aproximadamente 350 μL) en tubos de reacción nueva.
      Nota: Se necesita una alícuota para cada gel de poliacrilamida. Tienda el restante aliquOTS a-20 ° C y descongelar sólo alícuotas poco antes de que se necesitan.
    3. Monta un cassette de gel comprometido de dos placas de vidrio, una en blanco y placa de vidrio con muescas (cada 20 cm x 20 cm), con espaciadores (espesor 1,5 mm) de entre ellos corriendo hasta los lados del vidrio. Utilizar cada tres clips de fold-back (32 mm) en el lado derecho e izquierdo para fijar el cartucho de gel ( figura 1).
    4. Mezcla 5 g de agarosa y 250 mL de tampón de x TBE 1 en un erlenmeyer, preparar la solución para una agarosa 2% gel. Calentar y luego enfriar la mezcla tal como se describe en los pasos 2.1.6 y 2.1.7. Rápidamente verter la solución en una caja de plástico en forma de cuadrado (21 cm x 6,5 cm x 5 cm) y colocar el extremo inferior de la cinta de gel (paso 4.1.3) en la solución de agarosa. Ajuste los clips de fold-back en el extremo inferior del gel de cassette para una altura de manera que se sientan en el borde de la caja de plástico en forma de cuadrado ( figura 1). Esperar unos 20-30 min hasta que el enchufe de agarosa ha endurecido completamente.
    5. Llenar un 100 mL medir cilindros con la solución de trabajo de acrilamida (paso 4.1.1) hasta la marca de 60 mL y vierta la solución en un vaso de precipitados. Utilice una micropipeta para añadir 300 μL de una alícuota de la solución madre de APS (paso 4.1.2) y posteriormente agregar 37.5 μl de tetramethylethylenediamine (TEMED). Rápidamente, verter la solución entre las placas de vidrio de la cinta de gel. Alternativamente, inyectar la solución entre las placas de vidrio con una jeringa desechable de 100 mL con una pipeta de 1000 μl, ajustada a la cabeza de inyección de la jeringa de.
    6. Introduzca cuidadosamente un peine estándar espesor de 1,5 mm en el extremo superior entre las placas de vidrio. El peine debe estar rodeado por la solución de poliacrilamida. Espere aproximadamente 1 hora hasta que se polimeriza el gel de poliacrilamida. Evitar la ventilación durante la polimerización lo más lejos posible porque aumenta el tiempo necesario para que el gel polimerice.
      Nota: Es posible almacenar geles fundidos dentro de bolsas de plástico selladas con un pañuelo húmedo en la nevera hasta 3 días.

figure-protocol-1
figura 1: imagen que ilustra el construcción a geles de poliacrilamida. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

  1. Coloque el cartucho de gel, que contiene el gel de poliacrilamida preparado, en una unidad de electroforesis vertical. Llenado el aparato de electroforesis con la cantidad apropiada (dependiendo del tipo de unidad de electroforesis) de 0,5 x TBE y enfriamiento de la unidad hasta 10 ° C mediante un circulador refrigerado.
  2. Para la desnaturalización del ADN, precaliente un termobloque /-cycler a 96 ° C. preparar buffer de desnaturalización 95% formamida (grado de 99.5% p.a.) y 5% de solución acuosa que contiene azul de bromofenol 0.25% y sacarosa al 40% (w/v).
  3. Tomar los productos PCR fuera de la nevera o el congelador y descongelarlos. Desactivación de los productos PCR mediante la opción run corto de una centrifugadora de mini (placa). Luego, mezcle cada 4 μL del producto PCR 4 μL de tampón de desnaturalización. Calentar la mezcla durante 5 minutos a 96 ° C seguida por un paso de enfriamiento en agua muy fría durante 10 minutos
    Nota: Las muestras se deben cargar en el gel de poliacrilamida (paso 4.5) inmediatamente después de esto.
  4. Quitar el peine del gel de poliacrilamida (paso 4.1.6) y utilizar una micropipeta para cargar completamente cada muestra en una ranura de gel. Ejecutar electroforesis en 8 W por gel mientras refrigeración constantemente el aparato de electroforesis a 10 ° C. duración necesaria depende del tamaño del fragmento que se separará. Para tamaños de fragmento de aproximadamente 210 bp, un tiempo en marcha de aproximadamente 3,5 horas se considera apropiado.
  5. Para preparar un baño de tinción, pour 1.000 mL de 1 x TBE en un cuadrado de plástico impermeable a la luz de la caja y añadir 30 μl de coloración de tinte (apto teñir sola DNA trenzada) con una pipeta de microlitros. Cierre la tapa de la caja de plástico y agite para asegurar la distribución equitativa del tinción colorante.
  6. Libere el gel de la cámara de electroforesis y separar cuidadosamente la placa ranurada del gel. Deslice el gel de poliacrilamida de la placa de cristal en blanco en el baño de tinción. Colocar el baño de tinción en un gel manchas y plataforma de agitación durante 20 a 30 min con agitación constante.
  7. Tomar el gel con cuidado en el baño de tinción y colóquela en la mesa de rayos UV de un sistema de documentación.
    Nota: Debido a la inestabilidad del gel se recomienda para manejar el paso previo con dos personas. Una persona debe llevar a cabo el baño de tinción junto a la mesa de la UV y otra debe llegar bajo el gel con ambas manos, llevarlo a cabo y deslícelo sobre la tabla de la UV.
  8. Cierre la tapa o puerta del sistema de documentación y tomar una fotografía según el fabricante ' s manual de instrucciones.

5. Detectar múltiples ingestión recientemente grupos de presas en paralelo con fragmento automatizado análisis.

  1. Analizar el contenido de la tripa ADN extractos utilizando la cartilla específica de grupo 16 establece determinado en la tabla 2, con un primer de un conjunto marcado debido a la modificación con un colorante tinción (ver tabla 2 columna titulada modificación) y utilizar los métodos de detección paralela de un secuenciador automatizado.
    1. Uso la solución de extractos de ADN (preparados según pasos 1.1 a 1.3.11) y conducta separados PCRs para cada cartilla como se describe en pasos 2.1.1 a 2.1.5 (variaciones en la mezcla se dan en la tabla 2). Utilizar al menos un control con ADN puro de un espécimen perteneciente al grupo de blanco respectivo (control positivo) y un control negativo con el puro ADN de las especies de consumo en cada PCR ejecutar.
    2. Run PCR en termociclador usando el protocolo estándar de PCR en paso 2.1.4, ajustada a la respectiva temperatura de recocido (y el número de ciclos) para cada primer conjunto dado en la tabla 2.
      Nota: Utilizar la misma asignación de ADN de los pocillos de reacción para PCR con cada uno de los 16 conjuntos de diferentes cartilla para simplificar el posterior puesta en común de productos de la PCR para procesar por lotes automatizado análisis de fragmento.
      3. Productos de
    3. tienda PCR a-20 ° C hasta todos los PCRs pertenecientes a un lote para el análisis automatizado del fragmento (ver tabla 2) se acaban. Mantener los productos PCR en la oscuridad y no guardarlas más de 1 semana antes del análisis del fragmento.

figure-protocol-2
tabla 2: información de los 2 lotes de 15 pares de primer grupo-específica establecido por Koester et al. (2013) y el nuevo diseño Jae28S primer par amplificar regiones del rDNA 18S o 28S de 16 grupos de macroinvertebrados acuáticos. f, cartillas de avance; r, cartillas inversas; 18 años, cartilla apunta a la subunidad de ADNr 18S; 28S, primer objetivo los 28S subunidad ADNr. " Clegg, es Dikerogammarus villosus (Crustacea, Gammaridae) un ' camarón asesino ' en el sistema del río Rin?, 768, 2016, tabla S1, material complementario página 2, Koester Meike, Bayer Bastian, Gergs René, (© Springer Internacional editorial Suiza 2015) " con autorización de Springer. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta tabla.

  1. para detectar los fragmentos amplificados de todos los conjuntos 16 primer realizar análisis automatizado del fragmento en los 2 lotes dados en la tabla 2. Utilizan un estándar de tamaño interno (Kit estándar de tamaño de DNA - 400 [lote B] y - 600 [lote A], respectivamente) para determinar la longitud del fragmento. Preparar la placa de la secuencia y secuenciador automático como se describe en los pasos siguientes. Tenga en cuenta que este procedimiento podría tener que ajustar si se utiliza otra plataforma que en la tabla de materiales.
    1. Para ejecutar cada lote de muestras, preparar una mezcla que contiene solución de carga de muestra (SLS) y el respectivo tamaño estándar. Pipetee 21,6 μl de SLS y 0,4 μL de ADN tamaño Standard Kit - 600 por muestra del lote A y, respectivamente, 21,7 μl de SLS y 0,3 μl de ADN tamaño Standard Kit- 400 por muestra de lote B.
    2. Tomar los productos PCR de las 8 PCRs perteneciente al lote respectivo fuera del congelador y descongelarlos. Garantizar que se conservan en la oscuridad.
    3. Utilizar una pipeta microlitros para cargar el número de pocillos de una placa de la secuencia necesitada (número de muestras a analizar) con cada 22 μL de la mezcla respectiva descrita en el paso 5.2.1. Desactivación de los productos PCR de cada uno de los 8 PCRs utilizando la opción de funcionamiento corto de una centrifugadora de mini (placa). Transferir cada 1 μl producto de PCR de cada uno de los 8 PCRs en los respectivos pocillos de la placa de la secuencia con una pipeta de microlitros.
    4. Con cuidado girar por esta mezcla dentro de la placa de la secuencia con un corto plazo de una centrífuga de plato mini y superposición de cada uno de los pocillos usados con una gota de aceite mineral. Respectivos pocillos de una placa de búfer se llenan de 250-300 μL de tampón de separación de ADN de.
    5. Utilizar el software para el secuenciador capilar para crear una configuración de muestra según el fabricante ' instrucciones. Asignar los métodos que muestra sistemas de control y determinar la secuencia de métodos que se utilizarán para procesar los datos (ver tabla 3 para el funcionamiento de las condiciones adecuadas para el uso con el tamaño estándar indicado en la Tabla de materiales). Tenga en cuenta que es fundamental que la asignación de las muestras dentro de la instalación de la muestra coincide con la asignación de la muestra en la placa de la secuencia (incluyendo controles positivos y negativos, vea el paso 5.1.1) y que el método adecuado para el fragmento se analiza con el respectivo tamaño estándar es elegido.
    6. Llenar una bandeja de humedecimiento con agua desionizada e inserte la placa de la secuencia, placa de búfer y mojar la bandeja en el secuenciador capilar. Inserte un cartucho de gel que contiene una cantidad suficiente de gel fresco de la separación de ADN que se necesita para la muestra ejecutar. Funcionamiento de la placa de la secuencia con la instalación de muestra preparada.
desnaturalizar separado Capilar inyectar
Temperaturatiempotensión detiempovoltajetiempo
tamaño estándar 60090 ° C120 s4.8 kV60 min50 º C esperar a que Temp: sí2.0 kV30 s
tamaño estándar 40090 ° C120 s6 kV45 min50 º C esperar a que Temp: sí2.0 kV30 s

tabla 3: condiciones específicas para el análisis del fragmento sobre el secuenciador automatizado utilizando los estándares de tamaño en la tabla de materiales.

  1. analizar los resultados exportar datos y cargar los datos en el programa de análisis de un fragmento. Elegir tinte estándar órdenes de color de los respectivos fabricantes para establecer canales de color de tinte.
    1. Crear un Panel que el rango de la longitud del fragmento amplificado por el primer grupo-específica solo establece dentro de un lote según el manual del usuario del programa.
    2. Para procesar los datos, seleccione el Panel respectivo estándar de tamaño adecuado, color estándar y tipo de análisis y ejecutar un procedimiento. Elija la opción del electroferograma para mostrar intensidades de la señal fluorescente de los instrumentos de electroforesis capilar como un rastreo único para cada color de tinte. Conjuntos de marcadores de la cartilla se muestra indicando el rango respectivo fragmento y se resaltará la longitud exacta del fragmento detectado asociado con el centro de cada pico llamado (en la mayoría de los programas por coloración o nombre asignado) automáticamente.
    3. Para cada muestra, calcular cuánto la muestra ' s interna tamaño estándar coincide con el estándar de tamaño seleccionado para asegurar el éxito de la convocatoria de tamaño. La mayoría fragmento análisis de programas tienen la opcion de calcular y visualizar al partido automáticamente. Si el llamado tamaño error, repetir fragmento análisis de las muestras.
    4. Visualmente Revise el electroferograma de cada muestra y confirmar/unconfirm cada pico llamado para cada marcador/primer set por separado. Inserte manualmente picos fuera de lugar que cumplan los criterios de un sistema de marcador/cartilla o eliminar equivocadas según el manual del usuario del programa utilizado. Aplicar el nombre de tamaño o bin de pares en el ' etiqueta del alelo '. Calcular y mostrar las especificaciones de pico en la ' tabla de pico '.

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Resultados

Hemos utilizado con éxito pasos descritos en este protocolo para el análisis de la dieta en diferentes estudios. En esta sección, presentamos ejemplos que describe la aplicabilidad de las distintas secciones del protocolo.

Por ejemplo, para demostrar la efectividad de los sistemas de primer grupo-específica establecida por los autores28 y el potencial de mayores aguas abajo análisis de productos PCR por a...

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Discusión

Aquí, presentamos un método fácil y costo-eficiente para la polimerización en cadena-basado determinación de interacciones depredador-presa de muestras de campo a través de cartillas de Grupo-específicas para las regiones de ADNr, que pueden combinarse con otros análisis no moleculares de las mismas muestras. Sin embargo, hay varios pasos críticos dentro del protocolo. En primer lugar, es esencial asegurar la especificidad de los cebadores utilizados. En segundo lugar, es crucial para evitar la contaminación y pérdida de...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Agradecemos a Silke Classen del Instituto de investigación para el análisis de ecosistemas y evaluación (gaiac), RWTH Aquisgrán para su asistencia en el establecimiento de los conjuntos de primer grupo específico utilizado en el presente Protocolo. También agradecemos a Peter Martin y Laura Schynawa de la Universidad de Kiel para la colaboración en los experimentos de los ácaros de agua. También agradecemos a los asistentes de laboratorio técnico para mantenimiento de laboratorio funcionando sin problemas y preparar el registro de empresas y números de catálogo. Este trabajo fue financiado por la Fundación de investigación alemana (DFG; proyecto GE 2219/3-1).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
nitrógeno líquidoCualquierNAPara el transporte de muestras de campo de macroinvertebrados al laboratorio.
Tubos de reacción de 1,5 ml - SafelockAnyNAPara la recolección de muestras de consumo en el campo y su posterior conservación en nitrógeno líquido, los tubos de reacción no necesitan estar necesariamente limpios por PCR. Para evitar la explosión de los tubos, la tapa de los tubos debe perforarse con una aguja.
Microscopio estereoscópicoCualquierNAAsegúrese de que el aumento sea adecuado para preparar el tracto gastrointestinal del tamaño del consumidor de interés.
Placas de PetriCualquierNAPara diseccionar el tracto gastrointestinal de especímenes de consumo bajo el estereomikroscopio.
Fórceps de acero inoxidable: pinza Dumont n.º 7BioformB40dEsta pinza curvada de acero inoxidable a veces puede ser muy útil para sujetar la muestra fija entre la parte curva sin perforar el tracto gastrointestinal.
Fórceps de acero inoxidable: Pinza Dumont Electronic Nº 5BioformB40bEsta fina pinza de acero inoxidable es ideal para la preparación del tracto gastrointestinal de muestras de consumo.
DNA-ExitusPlusAppliChemA7409,1000RFSolución de descontaminación para la eliminación de contaminaciones de ADN y ARN
Toalla de papel sin pelusaCualquier
Cualquierprecisióndebe ser de al menos 0,01 g.
Pipetas de microlitros (0,5-10/10-100/50-200/100-1000 μ L)CualquierNA
Safe-Lock 2.0 mlVWR211-2165¡Es crucial que estos tubos de reacción estén libres de ADN, DNasa, RNasa e inhibidores de PCR (PCR clean)!
Tubos Safe-Lock 1,5 mlVWR211-2164¡Es crucial que estos tubos de reacción estén libres de ADN, DNasa, RNasa e inhibidores de PCR (PCR clean)!
Cloruro de sodio ≥ 99.5%, p.a., ACS, ISOcarlroth3957.3Para tampón de extracción de sal (SEB) y solución de NaCl 5M necesarios para la extracción de ADN.
Tris(hidroximetil)-aminometano Triscarlroth4855.2Para tampón de extracción de sal (SEB) y tampón TBE
Pipetas de microlitros (0,5-10/10-100/50-200/100-1000 μ L)carlroth8043.1Para tampón de extracción de sal (SEB) y tampón TBE
Ácido bórico ≥ 99,8 %, p.a., ACS, ISOcarlroth6943.2Para tampón TBE. No es necesario si se obtiene un tampón TBE disponible en el mercado.
Dodecil sulfato de sodio (SDS)carlroth4360.1Para la extracción de ADN
proteinasa K liofilo.carlroth7528.1Prepare una solución de trabajo que contenga 10 mg/ml.
TissueLyser IIQuiagen85300Molino de bolas para la homogeneización de las muestras.
Perlas de acero inoxidable, 5 mmQuiagen69989Para la homogeneización de muestras.
Termoagitador de calefacciónCualquierNA
Mezclador de vórticeCualquierNA
Centrífuga refrigerada: himac CT 15 REHitachiNACentrífuga refrigerada utilizada para la centrifugación durante la extracción de ADN (Protocolo 1).
Isopropanolcarlroth6752.5
Etanol 99.8 %, p.a.Cualquier
agua de NA Agua de biología molecular (ddH2O)AppliChemA7398,1000agua libre de nucleasas (esterilizada por corriente y tratada con DPC) utilizada para la resuspensión de ADN y siempre que se haga referencia a ddH2O dentro del manuscrito
Olegonucleótidos no modificadosEurofins MWG OperonNAPrimers sin etiquetar
Olegonucleótidos modificadosMetabion International AGNAImprimaciones con la etiqueta
peqGOLD Taq todo incluidoVWR Peqlab01-1000Taq todo incluido para mezclas de reacción PCR (tampón de reacción Y y S, dNTPs y MgCl2)
Termociclador de gradiente avanzado Primus 96 o peqStar96x Universal GradientPeqlabNALos juegos de cebadores se establecieron originalmente en un termociclador de gradiente avanzado Primus 96. Como este ciclador era bastante antiguo, comprobamos si nuestros juegos de cebadores eran eficientes y específicos en las mismas condiciones utilizando el peqSta96x (que también podía simular el modelo anterior). Sin embargo, las pruebas demostraron que nuestros cebadores funcionan bien y siguen siendo específicos (véase Koester et al. 2013) sin utilizar la simulación de la máquina antigua.
Placas de PCR estándar de 96 pocillosVWR Peqlab732-2879utilizadas para reacciones de PCR.
Tiras de tubo de perfil bajo de 0,15 ml con tiras de tapa planaVWR Peqlab732-3223Tiras de tapa utilizadas para cerrar las placas de PCR.
AgarosaPeqlab35-1020Se utiliza para la electroforesis en gel.
MicroondasCualquierNA
Matraz cónicoCualquierNA
Cilindro de mediciónCualquierNA
Unidad de electroforesis horizontal y sus respectivos peines con dientesCualquierNAPara electroforesis en gel de agarosa.
Fuente de alimentación para electroforesis PS3002Life TechnologiesNA
Solución de bromuro de etidio 1 %carlroth2218.1Se utiliza para preparar un baño de tinción para geles de agarosa.
Formamidacarlroth6749.1Necesario para el tampón de desnaturalización para análisis SSCP.
Azul de bromphenolAppliChemA3640.0010Necesario para la carga de colorante para la electroforesis en gel de agarosa.
Sacarosacarlroth4621.1Necesaria para el colorante de carga para la electroforesis en gel de agarosa.
100 bp-DNA-Escalera extendidacarlrothT835.1Como tamaño estándar para la electroforesis en gel de agarosa.
Sistema de documentación UVCualquierNAPara visualizar los resultados de la electroforesis en gel.
Rotiphorese NF-Acrilamida/Bis-solución 40 % (29:1)carlrothA121.1Para la preparación de geles de poliacrílamida.
Peroxidisulfato de amoniocarlroth9592.2Para la preparación de geles de poliacrílamida.
clips plegables (32 mm)CualquierNAPara la preparación de geles de poliacrílamida.
caja de plástico de forma cuadrada (21 &veces; 6,5 veces; 5 cm)CualquierNAPara la preparación de geles de poliacrílamida.
Tetrametiletilendiamina (TEMED)carlroth23.67.1Para la preparación de geles de poliacrilamida.
Vaso de precipitadosAnyNA
RC 10 Enfriador digitalVWR462-0138Para análisis SSCP mediante electroforesis en gel de poliacrilamida.
Unidad de electroforesis vertical P10DS (OWL Separation Systems)VWR700-2361Para análisis SSCP con electroforesis en gel de poliacrilamida.
Placa de vidrio con muescasVWR730-0261Para análisis SSCP con electroforesis en gel de poliacrilamida.
Placa de vidrio en brutoVWR730-0260Para análisis SSCP mediante electroforesis en gel de poliacrilamida.
EspaciadoresVWR730-0262Para análisis SSCP mediante electroforesis en gel de poliacrilamida.
Peine de 25 dientesVWR730-0294Para análisis SSCP con electroforesis en gel de poliacrilamida.
Plataforma de agitaciónCualquierNAPara la agitación constante del baño de tinción.
Tinción de ácido nucleico GelStar (Lonza Rockland, Inc.)Biozym850535 (50535)Para la tinción de geles de poliacrilamida.
GenomeLab DNA Size Standard Kit 400bpAB Sciex608098Para análisis automatizados de fragmentos. Estándar de tamaño para el lote B.
GenomeLab DNA Size Standard Kit 600bpAB Sciex 608095Para análisis automatizados de fragmentos. Estándar de tamaño para el lote A.
Solución de carga de muestras (SLS)AB Sciex608082Para análisis automatizados de fragmentos.
Placa de secuestro - Microplaca PCR de polipropileno de 96 pocillosCostar6551Para análisis automatizados de fragmentos.
Centrífuga de placas, minicentrífuga de placas PerfectSpin PVWR PeqlabNAutilizada para centrifugar productos de PCR.
Placa amortiguadora - 96 pocillos EIA/RIA Poliestireno transparente de fondo plano sin tratar MicroplacaCorning9017Para análisis automatizados de fragmentos.
GenomeLab Tampón de separaciónAB Sciex608012Para análisis automatizados de fragmentos.
Gel de separación - LPAIAB Sciex608010Para análisis automatizados de fragmentos.
Sequenzer - CEQ8000 Sistema de Análisis GenéticoBeckman CoulterNAPara análisis automatizados de fragmentos.
GeneMarker V1.95SoftgeneticsNAPara analizar los resultados de análisis automatizados de fragmentos.
báscula de laboratorio NA NA tubo

Referencias

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