Artículo de método

Síntesis de bacteriófagos infecciosas en una e. coli -basan sistema de expresión libre

DOI:

10.3791/56144

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17 de agosto de 2017

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1School of Physics and Astronomy, University of Minnesota, 2Department of Diagnostic and Biological Sciences and Institute for Molecular Virology, University of Minnesota

En este artículo

Resumen

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Una nueva generación de plataformas de transcripción-traducción libre de la célula ha sido diseñada para la construcción de sistemas bioquímicos en vitro a través de la ejecución de circuitos de gene. En este artículo describimos cómo bacteriófagos como MS2, ΦΧ174 y T7, son sintetizados a partir de su genoma mediante un todo e. coli sin células TXTL sistema.

Resumen

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Una nueva generación de sistemas libres de células transcripción-traducción (TXTL), diseñado para tener una mayor versatilidad y modularidad, proporcionar nuevas capacidades para ciencias básicas y aplicadas en reacciones de tubo de ensayo. En la última década, TXTL libres de células se ha convertido en una técnica poderosa para una amplia gama de la biología relacionados con cuantitativa y sintética de áreas nuevas investigaciones multidisciplinarias. Las nuevas plataformas TXTL son particularmente útiles para construir e interrogar a sistemas bioquímicos a través de la ejecución de circuitos gen sintético o natural. In vitro TXTL ha demostrado conveniente rápidamente elementos reguladores del prototipo y redes biológicas así que recapitulemos molecular autoensamblaje mecanismos encontraron en los sistemas vivos. En este artículo describimos cómo infecciosos bacteriófagos, como el MS2 (RNA), ΦΧ174 (ssDNA) y T7 (dsDNA), son sintetizados totalmente de su genoma en las reacciones de un pote con Escherichia coli, un sistema libre de células TXTL. Síntesis de los tres colífagos se cuantifican utilizando el ensayo de placa. Mostramos cómo la producción de fagos sintetizada depende de los parámetros bioquímicos de las reacciones. Hacinamiento molecular, emulado a través de una concentración controlada de PEG 8000, afecta a la cantidad de fagos sintetizadas por órdenes de magnitud. También describimos cómo amplificar los phages y purificar sus genomas. El conjunto de protocolos y resultados presentados en este trabajo debe ser de interés para los investigadores multidisciplinarios involucrados en Bioingeniería y biología sintética sin células.

Introducción

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En la última década, la tecnología de libre expresión ha sido diseñada para aplicaciones novedosas de dirección en biología relacionados con sintético y cuantitativa de áreas emergentes de investigación multidisciplinar. Originalmente utilizado para expresar las proteínas de un organismo vivo, se han desarrollado nuevos sistemas acelulares de TXTL para ambas ciencias básicas y aplicadas1,2, ampliar considerablemente el alcance de esta tecnología. La nueva generación de plataformas TXTL ha sido diseñada para ser fácil de usar, más eficiente (llegar a 2 mg/mL de síntesis de proteínas en modo batch

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Protocolo

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Nota: los pasos siguientes de la amplificación y el método de extracción son en gran medida generalizables para muchos fago de DNA de doble cadena, por ejemplo, bacteriófago T7, fago T4 de enterobacterias o enterobacterias fago λ (L). Se utilizan predominante para un fago cuyo genoma no está disponible para la compra de fuentes comerciales.

1. amplificación de fago

Nota: la técnica de elaboración de fago (SPMC) solo-placa, multi-ciclo es descrita bien por el fago T4 en Chen, et al. 14 la siguiente amplificación de phage y ADN método de extracción es una generalización p....

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Resultados

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Mostramos cuatro resultados representativos. En la figura 1, presentamos un conjunto de controles negativos para asegurar que el sistema TXTL libres de células y las poblaciones de DNA de fago no estén contaminadas con vida las células de e. coli . Verificar que el sistema TXTL libre es libre de intacta e. coli contaminación de la célula por tanto una solución de reacción incubadas y no incubadas de ADN genómico (figura .......

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Discusión

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Siguiendo la técnica de Chen, et al. 14 para SPMC, un paso crítico se alcanza al determinar las condiciones adecuadas para la sobreinfección. El parámetro que mejor controla la habilidad de una cepa de host para soportar el superinfection con frecuencia es la concentración inicial de la infección phage. Las células hospedadoras deben estar en fase de crecimiento logarítmico antes de la infección inicial con una pequeña cantidad de fagos. Finalmente, los fagos también alcanzará crecimiento.......

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Divulgaciones

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Los autores declaran la interest(s) financiera competencia siguientes: Noireaux laboratorio recibe fondos de investigación de MYcroarray, un distribuidor del kit de expresión de proteína libre de MYtxtl.

Agradecimientos

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Este material está basado en trabajo apoyado por el Oficina de investigación Naval Premio número N00014-13-1-0074 (V.N.), el programa de Ciencias humanas de frontera número RGP0037/2015 de la concesión (a V.N.) y la Fundación binacional de ciencia concede 2014400 (a V.N.).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Tubos de ultracentrifugaciónBeckman Coulter344057
Tubos cónicosFalcon352070
Creador de gradientesBioComp Gradient Masterver Anal Biochem. 1985 Jul; 148(1):254-9.
Jeringa y cánula romaMonoject8881513918 y 888202017
Puntas de pipeta de diámetro anchoFischerbrand02-707-134
Contador de placasNuevo Brunswik Contador de colonias científicasmodelo C-110
Tubos de cultivoFischerbrand14-961-33
Sistema sin célulasMycroarray IncMytxtl
Receta
LB25 g/L Luria-Bertani medio (LB Broth, Miller - Fisher BioReagents número de producto BP1426) y 15 g/L Bacto-Agar sólido (Brenton, Dickenson and Company - número de producto 214010).
de placa de agar BioComp Gradient Master BioComp Instruments modelo 105ME

Referencias

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  1. Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free protein synthesis: Applications come of age. Biotechnol Adv. , (2011).
  2. Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free synthetic biology: Thinking outside the cell. Metab Eng. , (2011).
  3. Caschera, F., Noireaux, V.

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Etiquetas

S ntesis de bacteri fagossistema E coliensayo de placashacinamiento molecularPEG 8000purificaci n de fagosextracci n de ADNgradiente de sacarosafenol cloroformo

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