Registro electrofisiológico de Drosophila Tricoide Sensilla en Respuesta a Odorantes de Baja Volatilidad

Los ORNs de Drosophila responden a un gran número de odorantes, con longitudes de cadena de carbono ampliamente extendidas y una variedad de grupos funcionales, incluyendo ésteres, alcoholes, cetonas, lactonas, aldehídos, terpenos, ácidos orgánicos, aminas, compuestos de azufre, heterocíclicos y aromáticos ^{2 , 3} . Odorantes variados en sus características físico-químicas pueden tener volatilidades marcadamente diferentes, indicadas por la presión de vapor del compuesto. En particular, los odorantes biológicamente relevantes para Drosophila melanogaster difieren enormemente en su volatilidad. Por ejemplo, los ORN de Ir92a responden al amoníaco ⁴ , que es altamente volátil, con una presión de vapor de 6.432 mmHg a 20 ° C. Por el contrario, Or67d ORNs responden a una feromona masculina, acetato de cis- vinceno ( c VA) ^{5 , 6} , cuya presión de vapor es de 43 mmHg a 20 ° C.

El estudio de la respuesta olfativa a los odorantes de baja volatilidad es particularmente difícil con los métodos convencionales de suministro de olores, en los que los odorizantes se suministran a través de una corriente de aire portadora a una distancia relativamente larga ( es decir, varios centímetros) A un determinado odorante de baja volatilidad puede variar en gran medida, dependiendo del diseño del sistema de suministro de olor.Por ejemplo, la respuesta informada de Or67d ORNs a una dosis alta de c VA oscila entre ~ 40 ⁷ -> 200 picos / s ⁶ . Además, la entrega ineficaz de c VA con métodos convencionales de entrega es probablemente atribuida a falsos resultados negativos, lo que lleva a la interpretación de que c VA por sí mismo no es suficiente para activar Or67d ORNs ^8. Esta interpretación fue más tarde impugnada por otro estudio utilizando un Método ^de distribución de olores a corta distancia.Desarrollar un robusto sistema de suministro de olores para la presentación eficaz de olorantes de baja volatilidad.

Recientemente, identificamos varios ácidos grasos cuticulares de cadena larga como ligandos para los ORN de Or47b. Se alojan en el tipo 4 Antennal Trichoid Sensillum (at4). Entre los odorantes de ácidos grasos de cadena larga, encontramos que el ácido palmitoleico funciona como una feromona afrodisíaca que promueve el cortejo masculino mediante la activación de Or47b ORNs ¹ . Sin embargo, en otro estudio utilizando un método de suministro de olor convencional, se demostró que el laurato de metilo induce respuestas de los ORN de Or47b, mientras que el ácido palmitoleico no evoca respuesta cuando se presenta a partir de la misma distancia ¹⁰ . En comparación con c VA, los ácidos grasos de cadena larga son aún menos volátiles, con presiones de vapor inferiores a 0,001 mmHg a 25 ° C ¹¹ . La volatilidad inherentemente baja de los odorantes de ácidos grasos de cadena larga, que impide la presentación eficiente a la antena víaConvencional de los sistemas de suministro de olores, probablemente representaron los resultados falsos negativos [ ^10] . Esta incoherencia pone de manifiesto la insuficiencia de los sistemas convencionales de suministro de olores al presentar olorantes de baja volatilidad. Anteriormente se demostró que el suministro efectivo de olores cuticulares de mosca requiere una estrecha proximidad entre la fuente de olor y el tejido diana ⁶ . Por lo tanto, para caracterizar completamente los efectos de las feromonas biológicamente activas mientras mimetiza la distancia desde la cual son probablemente encontrados por las moscas de la fruta en la naturaleza ^{12 , 13} , acordamos que la distancia mínima debe ser de alta prioridad en nuestro procedimiento.

Nuestro método tiene otras ventajas, incluyendo la compatibilidad con equipos y técnicas de electrofisiología estándar. Las configuraciones de equipos preexistentes requieren una modificación mínima para acomodar este protocolo, y la mayoría de los pasos de SSR requieren solo ajustes menores. EstaHace que nuestra técnica sea fácilmente accesible a los investigadores con experiencia en SSR. Además, nuestra técnica permite la presentación de odorantes de baja volatilidad con inicio y desplazamiento agudos, correlacionando el estímulo con la respuesta neuronal. Finalmente, la disposición del hardware facilita los intercambios rápidos entre los cartuchos de olor, acelerando la recopilación de datos sobre un rango de dosificación deseado.

Empezaremos por revisar la preparación de los electrodos de referencia y de registro, la solución de hemolinfa tipo adulto (AHL), los cartuchos de suministro de odorantes y el olfatómetro correspondiente. A continuación se discute la preparación de las soluciones odorantes de ácido palmitoleico, seguido por la preparación de la mosca para su registro. Se procede a considerar los criterios para seleccionar un tricloide sensillum para registrar y examinar más de cerca el posicionamiento del cartucho odorante antes de presentar datos representativos adquiridos usando este método. Finalmente, concluimos explorando aplicaciones útiles de esta técnicaUe, algunos problemas encontrados y sus soluciones.

1. Preparación del hardware para la grabación de at4

1. Utilice un instrumento de extracción de pipeta para preparar electrodos con tubos de vidrio de aluminosilicato (OD 1,0 mm, ID 0,64 mm). Blunt la punta del electrodo de referencia ligeramente con un par de pinzas finas para facilitar la inserción en el clypeus de la mosca ( es decir, una placa redondeada en la parte delantera de la cabeza de la mosca, por encima de las partes bucales).
   NOTA: En este estudio se utilizaron varones WT de 7 días de edad (Berlín). Utilice solución salina AHL ¹⁴ como el electrolito para ambos electrodos.
2. Preparar 1 L de AHL mediante la mezcla de 900 ml de agua destilada con 6,312 g de NaCl, 0,373 g de KCl, 0,337 g de NaHCO _3, 0,1120 g de NaH ₂ PO _4, 1,892 g de trehalosa ּ 2 H ₂ O, 3,423 g de sacarosa, 1,192 g de HEPES y 8,2 ml de MgCl _ { _2} 1M. Utilizando agua destilada, llevar el volumen total hasta 1 L. Llevar el pH a 7,4 usando NaOH 1 N y esterilizar la solución con unSistema de filtro accionado por vacío. Para almacenamiento a largo plazo, mantenga las alícuotas de AHL a 4 ° C.
   NOTA: Las entregas consistentes de ácido palmitoleico dependen de la uniformidad entre los cartuchos. Es crítico que cada cartucho esté ensamblado de una manera reproducible.
3. Utilizando una cuchilla de afeitar, retire 0,9 cm de la punta de una punta de pipeta de 200 μl para crear la primera sección del cartucho, que mide 4,1 cm; Consulte las dimensiones detalladas en la Figura 1A . Utilice otra punta de pipeta de 200 μl y quite 1,7 cm y 1,5 cm de la punta y la base, respectivamente, para crear la segunda sección del cartucho, midiendo 1,8 cm ( Figura 1A ). Utilice una regla para asegurar la reproducibilidad.
4. Utilice un perforador de ⅛ "para cortar los discos del papel de filtro.
5. Utilice fórceps para colocar un disco de papel de filtro en la punta de la segunda sección del cartucho. Confirme visualmente que hay una abertura en la punta del cartucho a través de la cual puede pasar el aire.
6. Conecte las secciones de cartucho primero y segundo juntos, como se muestra en la Figura 1A . Ángulo de la segunda sección del cartucho hacia abajo para facilitar la orientación cuadrada en la preparación ( Figura 1B ).
7. Conecte el cartucho con el tubo de suministro de olor, que está montado en un micromanipulador.
   NOTA: Este diseño permite que el cartucho sea girado hacia afuera para facilitar el intercambio ( Figura 1C ).
8. Ajuste el flujo de aire humidificado constante a 2 L / min en un controlador de masa y el flujo de odorante a 500 mL / min en otro controlador de masa.
9. Usando el software (vea la Tabla de Materiales ), programe el procedimiento para administrar un soplo de olor de 500 ms.

2. Preparación de Soluciones Odorantes de Ácido Palmitoleico para Entrega

NOTA: Or47b ORNs responder tanto a cis - y ácido -palmitoleic trans. Como el ácido palmitoleico es inestable en RT, las existencias se almacenan a -20 ° C y se utilizan dentro de un mes tras la apertura. El etanol es el disolvente de elección para el ácido palmitoleico.

1. Utilice un mezclador de vórtice para mezclar bien 10 μl de ácido cis- o trans- palmitoleico o diluciones con 90 μl de etanol al 100% para diluciones en serie de diez veces en microtubos de 1,7 ml. Preparar diluciones frescas de ácido palmitoleico diariamente antes de los experimentos y usarlos en un día.
   NOTA: Para los odorantes que no son solubles en etanol, se recomienda un vial de vidrio para preparar diluciones de olor con otros tipos de disolventes orgánicos.
2. Utilizando una micropipeta P10, aplicar 5 μl de soluciones de ácido cis- palmitoléico de las diluciones deseadas al papel de filtro en cada cartucho correspondiente.
   NOTA: La dosis más alta (10 ^-1 ) contiene 450 μg del compuesto. Para las soluciones de ácido trans -palmitoleico, aplique 4,5 μL en lugar de modo que la dosis más alta (10 ^-1 ) también contenga 450 μg de tÉl compuesto.
3. Para evaporar completamente el disolvente, coloque los cartuchos de ácido palmitoleico en un desecador de vacío durante 1 h a RT y 7,59 mmHg de presión.
   NOTA: Los cartuchos se pueden utilizar hasta 4 h en RT.

3. Preparación de Drosophila para acceso listo a la Sensilla at4 para grabaciones electrofisiológicas in vivo

NOTA: Las moscas WT (Berlín) se crian en medio estándar de harina de maíz a 25 ° C en un ciclo 12:12 luz-oscuridad. Tras la eclosión, las moscas se separan por sexo en grupos de diez, por lo que se alojan en grupo hasta los 7 días de edad. Or47b ORNs tanto en moscas masculinas como femeninas responden al ácido palmitoleico. Por simplicidad, sólo las moscas macho se examinan en el estudio actual.

1. Montar una diapositiva de mosca-prep: en una diapositiva de cristal, coloque un cubreobjetos de vidrio (18 x 18 mm ² ) sobre una pequeña cantidad de arcilla de modelado, formando un ángulo de ~ 3 ° con el portaobjetos de vidrio. Coloque la cinta de doble cara en el interior eDge de la cubreobjetos y en el área de la corredera inmediatamente debajo. Reemplace con cinta nueva por cada día de grabación ( Figura 2A ).
2. Utilice un aspirador de mosca ¹⁵ para recoger la mosca de interés en el tubo y luego coloque una punta de pipeta de 200 μL sobre el extremo del tubo. Simultáneamente deslice el tubo hacia adelante mientras sopla aire en el tubo para empujar la mosca hasta el extremo de la punta de la pipeta. Utilice una cuchilla de afeitar para cortar justo debajo del cuerpo de la mosca y 2 longitudes de las cabezas por encima de la mosca.
3. Tamp la parte inferior de la punta de la pipeta con la arcilla de modelado, empujando la mosca hacia arriba hasta tanto las antenas y el clypeus están expuestos ( Figura 2B ). Para evitar la muerte de la mosca, agregue sólo suficiente arcilla para exponer las antenas y aristae, ya que esto evita que el abdomen de la mosca de ser aplastado. Además, agregue la arcilla lentamente y suavemente para prevenir cualquier constricción repentina. Confirme que la mosca está viva revisando la antenaO movimiento de probóscide.
4. Use fórceps para maniobrar la punta de la pipeta que aloja la mosca. Oriente la cabeza de modo que el clypeus esté mirando a la derecha del observador. Ajustar la preparación a lo largo de la cubreobjetos con una pinza fina hasta que el lado lateral de la antena se apoye contra la superficie tapada de la cubreobjetos ( Figura 2B ).
5. Coloque una barra de sujeción en el arista para asegurar la antena a la cinta de doble cara para evitar el movimiento ( Figura 2B ).
   NOTA: La varilla de sujeción se extrae de un capilar de vidrio de borosilicato con un extractor de pipeta y se mantiene en posición con arcilla de modelado ( Figura 2A ).
6. Coloque la preparación en el escenario de la plataforma ( Figura 2C ). Utilizando el microscopio, confirme que los tricoides son visibles a lo largo del borde distal-lateral del tercer segmento de la antena.
   NOTA: Idealmente, la sensilla debe ser claramente silueta contra el fondo, lo que simplifica su Identificación y facilita el registro ( Figura 3 ). En esta preparación, la mayoría de los accesibles tricino sensilla son del tipo at4.
7. Mantenga la preparación bajo flujo de aire humidificado constante (2 L / min) suministrado a través de un tubo de suministro de aire separado a una distancia de aproximadamente 2 cm de la preparación ( Figura 4 ), como se ha descrito anteriormente ^{2 , 15} .

4. Registro de At4 Sensillum Actividad de Or47b ORNs en los tricoides at4 en respuesta al ácido palmitoleico

1. Inserte el electrodo de referencia en el clypeus ( Figura 3A ). Para evitar daños en los tejidos, asegúrese de que el electrodo se inserta justo debajo de la superficie, donde puede ponerse en contacto con la hemolinfa bajo la cutícula, con un movimiento rápido y suave.
2. Baje el electrodo de grabación lentamente hasta que entre en el mismo plano de visión que el objetivo sensillum (= "Xfig"> Figura 3B). Grabe bajo un objetivo de 50X.
   NOTA: La cutícula tricoidal resistente requiere insertar el electrodo de registro en la base sensilar, cuya área más amplia proporciona un objetivo mayor que reduce la probabilidad de que el electrodo se desvíe ( figura 3B , inserto).
3. Antes de aplicar estímulos de olor a un sensor, observe los siguientes criterios de selección: Cualquier tricero que no cumpla con estos estándares debe ser rechazado y otro sensillum elegido en su lugar.
   1. Observe una alta relación señal-ruido (vea la Figura 3C para un ejemplo).
   2. Observar identificables picos de 4A y 4C neuronas ( Figura 3C ].
      NOTA: Es de destacar que la amplitud pico at4B parece muy similar a at4A ¹⁰ y no se puede identificar fácilmente sin estimulación olor.
   3. Obsérvese que la tasa de disparo basal de las neuronas at4A esAlrededor o por debajo de 20 Hz.
      NOTA: Este criterio es específico para at4A porque la tasa de disparo basal para la neurona es mayor que la de los ORN básicos ² . Un disparo basal mucho más alto indica que las neuronas pueden haber sido dañadas durante la inserción del electrodo.
4. Conecte el cartucho al tubo de suministro de olor. Comience con el control de disolventes y después los odorantes, desde concentraciones bajas a altas. Utilice el micromanipulador para maniobrar el cartucho hacia la preparación mientras que apunta el cartucho directamente en la cabeza de la preparación. Confirme visualmente que el cartucho está apuntando directamente a la antena ( Figura 4 ) desde unos pocos milímetros de distancia.
   NOTA: El objetivo es orientar la apertura del cartucho directamente en la antena y colocarla cerca del tejido objetivo.
5. Asegúrese de que el cartucho de olor se separa del electrodo de registro a su derecha de 1 - 2 mm y de la mosca preP deslizarse por debajo de aproximadamente 1 mm.
   NOTA: En la configuración descrita aquí, el cartucho de olor está estrechamente rodeado por el electrodo de registro, el electrodo de referencia y la corredera de preparación de mosca ( Figura 4 ).
   NOTA: Preste atención a la distancia entre el cartucho y los electrodos de grabación / referencia. Se recomienda una distancia de alrededor de 4 mm ¹ . El contacto involuntario puede terminar la señal y romper la punta del electrodo de grabación, dañando la neurona actual y complicando otras grabaciones.
   NOTA: Considere la distancia que separa el cartucho y la diapositiva de preparación de la mosca. Tocar el cubreobjetos también puede desalojar el electrodo de grabación para interrumpir la grabación.
6. Pulse "Grabar" en el software de adquisición de datos para iniciar la grabación.
   NOTA: Para cada grabación de 10 s, se suministra un solo impulso de olor de 500 ms directamente a la antena, como se describe en el paso 1.9.
7. Después de la aplicación odorante,Cuidadosamente retraer el cartucho antes de reemplazarlo con un cartucho de la siguiente concentración más alta. Continúe hasta que se obtenga el rango de dosificación completo.
   NOTA: Se recomienda que solo se registre un Or47b ORN de cada mosca para evitar posibles efectos de adaptación.
8. Enjuague bien el electrodo de registro con agua destilada después de terminar la grabación para el día.
9. Analizar y trazar los datos utilizando software de análisis offline disponible comercialmente.

Nuestra técnica se aplicó con éxito para determinar la eficacia relativa de los isómeros trans ( Figura 5A ) versus isómeros cis ( Figura 5B ) del ácido palmitoleico. Nuestros datos representativos demuestra que el ácido trans- palmitoléico es un ligando más eficaz para Or47b ORNs en comparación con la cis isoforma ( Figura 5C ]. Se registró una única neurona de cada mosca, con doce moscas registradas por curva de dosificación, para un total de 24 moscas. Los datos colectivos se obtuvieron a partir de tres repeticiones independientes de los experimentos, con 8 moscas registradas en cada uno. Las barras de error representan el sem

De notar, la distancia entre la apertura del cartucho de olor y la cabeza de la mosca tiene una influencia significativa en el resultado de la grabación. Para obtener una respuesta significativa a pAlmitoleico en Or47b ORNs, presentamos el odorante a corta distancia, a unos 4 mm de distancia de la antena 1 ( Figura 6A ). Cuando el ácido palmitoleico se presenta más lejos de la antena (~ 11 mm), que difícilmente podría observar cualquier respuesta significativa de la misma Or47b ORNs ( Figura 6B ]. Estos resultados ponen de relieve la importancia de la presentación a corto plazo del ácido palmitoleico ( Figura 6C- D ). Los datos fueron recogidos a partir de experimentos paralelos de 6 moscas macho (Berlín, 7 d de edad). Se registró un ORN de Or47b único / mosca. Las barras de error representan el sem

Figura 1: Configuración del cartucho y del olfatómetro. ( A ) Preparación de cartuchos de olor. De izquierda a derecha: un estándar de 200 μLLa punta de la pipeta, la primera y la segunda secciones del cartucho, y un cartucho de odorante completo. ( B ) El cartucho conectado al olfatómetro, mostrando la inclinación hacia abajo de la segunda sección. ( C ) Configuración de olfactómetro que representa el tubo de suministro de olor montado en el micromanipulador, con un cartucho odorante adjunto. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Preparación de Drosophila . ( A ) Una preparación completa, que muestra las posiciones relativas de la mosca, el cubreobjetos y la varilla de sujeción. ( B ) Vista cercana de la preparación, mostrando el posicionamiento de la mosca, su orientación antenal, y su clypeus. La barra de sujeción se coloca sobre el arista,Asegurando el tercer segmento antenal a la cinta de doble cara. ( C ) Instalación del aparejo. Todos los componentes principales están anotados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Identificación de la at4 Sensillum para SSR. ( A ) vista 4X de la preparación, mostrando el electrodo de referencia insertado en el clypeus, la barra de sujeción encima del arista, y el electrodo de registro situado cerca del tercer segmento antenal. ( B ) vista 50X del electrodo, posicionado para su inserción en el tricloide at4. Insertar: Ilustración de la posición del electrodo de grabación. ( C ) Riestros de SSR representativos de la actividad de pico basal, que demuestran buena (arriba) o pobre (abajo) señal a ruidoE. Una buena relación señal / ruido permite la identificación fiable de las espigas at4A y at4C. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Colocación del cartucho. ( A ) El cartucho de olor está dirigido directamente a la cabeza de la mosca desde una distancia de unos pocos mm. ( B ) Otra vista del prep y olfactómetro desde un ángulo diferente. ( C ) Una vista cercana del prep y olfactómetro, que muestra la posición del cartucho de olor encima de la corredera de preparación de mosca. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Trazas representativos y curvas de dosificación de Or47b ORNs en respuesta a cis - o trans Acid -palmitoleic. ( AB ) SSR de los ORNs at4A que expresan el receptor Or47b con ácido trans - ( A ) o cis - palmitoleico ( B ). Se realizaron grabaciones con machos WT Berlin de 7 días de edad. Se muestran debajo de los trazos de muestra (n = 12) rasters de espiga correspondientes (medio) y un histograma de tiempo de peri-estímulo (fondo, almacenado a 50 ms). Curvas (C) de dosis-respuesta que comparan las respuestas pico Or47b ORN a cis - o ácido -palmitoleic trans. Media ± sem (* p <0,05; ** p <0,01; prueba t ). Ctrl: Control negativo sin ácido palmitoleico. Haga clic aquíPara ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: La activación de at4A por el ácido palmitoleico requiere una estimulación de corto alcance. ( AB ) SSR de los ORNs at4A en los hombres de Berlín de tipo salvaje de 7 días de edad. Se suministró ácido cis- palmitoléico a una distancia cercana (~ 4 mm) o más lejos (~ 11 mm) (n = 6). ( C ) Comparación de las respuestas de espiga correspondientes (almacenadas a 50 ms, histogramas de tiempo de peri-estímulo suavizado). ( D ) Comparación de las correspondientes respuestas de pico promedio. Las respuestas de at4A al ácido palmitoleico disminuyen notablemente a medida que aumenta la distancia del estímulo. Reimpreso con permiso de la Figura S4 en la referencia 1 . Haga clic aquí para ver unaVersión más grande de esta figura.

Los autores no tienen nada que revelar.