Registro electrofisiológico de Drosophila Tricoide Sensilla en Respuesta a Odorantes de Baja Volatilidad

Summary

El objetivo general de este protocolo es demostrar cómo presentar olorosos de baja volatilidad para el registro de un solo sensor de Drosophila neuronas receptoras olfativas que responden a la cadena larga de feromonas cuticulares.

Abstract

Los insectos dependen de su sentido del olfato para guiar una amplia gama de comportamientos que son críticos para su supervivencia, tales como la búsqueda de alimentos, la evitación de depredadores, la oviposición y el apareamiento. Se han identificado innumerables sustancias químicas de diferentes volatilidades como olores naturales que activan las Neuronas de Receptor Olfativas de Insectos (ORN). Sin embargo, el estudio de las respuestas olfativas a los odorizantes de baja volatilidad se ha visto obstaculizado por la incapacidad de presentar eficazmente tales estímulos usando métodos convencionales de suministro de olor. En este sentido, describimos un procedimiento que permite la presentación eficaz de los odorantes de baja volatilidad para la grabación de Sensillum único (SSR) in vivo . Al minimizar la distancia entre la fuente de olor y el tejido diana, este método permite la aplicación de los odorantes biológicamente sobresalientes pero hasta ahora inaccesibles, incluyendo el ácido palmitoleico, una feromona de estimulación con un efecto demostrado sobre ORNs implicados en cortejo y apareamiento comportamiento ^1.Nuestro procedimiento proporciona así una nueva vía para analizar una serie de odorantes de baja volatilidad para el estudio de olfato de insectos y la comunicación de feromonas.

Introduction

Los ORNs de Drosophila responden a un gran número de odorantes, con longitudes de cadena de carbono ampliamente extendidas y una variedad de grupos funcionales, incluyendo ésteres, alcoholes, cetonas, lactonas, aldehídos, terpenos, ácidos orgánicos, aminas, compuestos de azufre, heterocíclicos y aromáticos ^{2 , 3} . Odorantes variados en sus características físico-químicas pueden tener volatilidades marcadamente diferentes, indicadas por la presión de vapor del compuesto. En particular, los odorantes biológicamente relevantes para Drosophila melanogaster difieren enormemente en ....

Protocol

1. Preparación del hardware para la grabación de at4

1. Utilice un instrumento de extracción de pipeta para preparar electrodos con tubos de vidrio de aluminosilicato (OD 1,0 mm, ID 0,64 mm). Blunt la punta del electrodo de referencia ligeramente con un par de pinzas finas para facilitar la inserción en el clypeus de la mosca ( es decir, una placa redondeada en la parte delantera de la cabeza de la mosca, por encima de las partes bucales).
   NOTA: En este estudio se utilizaron varones WT de 7 días de edad (Berlín). Utilice solución salina AHL ¹⁴ como el electrolito para ambos electrodos.
2. Preparar 1 L de AHL medi....

Results

Nuestra técnica se aplicó con éxito para determinar la eficacia relativa de los isómeros trans ( Figura 5A ) versus isómeros cis ( Figura 5B ) del ácido palmitoleico. Nuestros datos representativos demuestra que el ácido trans- palmitoléico es un ligando más eficaz para Or47b ORNs en comparación con la cis isoforma ( Figura 5C ]. Se registró una única neurona de c.......

Discussion

Aquí, se describe un procedimiento por el cual las respuestas de Or47b ORNs a palmitoleic ácido puede ser fuertemente inducida y registrada. Se modificó un método convencional de entrega de olores a larga distancia ^{2 , 7 , 10} para solucionar el problema de suministro insuficiente de odorante de feromonas. Se abordó la cuestión de la baja volatilidad olorosa mediante la entrega del compuesto a través de cartuchos de olor, cuya a.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Configuración de preparación & Materiales varios
pipetas	Sutter Instruments Novato CA	P97	Extractor de pipetas
Capilares de vidrio de borosilicato	World Precision Instruments Sarasota FL USA	1B100F-4	para fabricar varillas de sujeción
Capilares de vidrio de aluminosilica	Sutter Instruments Novato CA USA	AF100-64-10	para fabricar electrodos
Superfrost Microscopio	Portaobjetos Fisher Scientific Pittsburgh PA USA	12-550-143	para estación de preparación de moscas
doble cara	Scotch St. Paul MN USA	NA	para estación de preparación de moscas
Microscopio vertical	Olympus Shinjuku, Tokio, Japón	BX51	para la plataforma de grabación
Plastalina plastilina arcilla para modelar	Van Aken North Charleston SC EE. UU	B0019QZMQQ	para la estación de preparación y para estabilizar la varilla de sujeción
Unidad de filtro desechable estéril de flujo rápido con membrana SFCA, 0,45 mm	Nalgene Rochester NY USA	#156-4045	para esterilizar la solución
AHLName	Company	Número de catálogo	Comentarios
>Materiales del cartucho
200 y micro; L punta de pipeta	VWR Radnor PA USA	53508-810	para hacer cartuchos de olor y preparación de moscas
Papel de filtro	Whatman Maidstone Kent UK	740-E	para hacer cartuchos de olor
Desecador de vacío	Cole-Parmer Vernon Hills IL USA	VX-06514-30	para vaporizar etanol solvente
Name	Company	Número de catálogo	Comments
>Odorant Materials	cis-palmitoleico fuerte>
	Cayman Chemical Ann Arbor MI USA	#10009871 (CAS # 373-49-9)	Or47b odorante
trans-palmitoleico	Cayman Chemical Ann Arbor MI USA	#9001798 (CAS # 10030-73-6)	Or47b odorante
Ethanol	Spectrum Chemical MFG.  New Brunswick NJ USA	E1028-500MLGL	para diluir el ácido palmitoleico
Name	Company	Número de catálogo	Comments
Materiales de configuración del equipo	>
Odorant Cartridge Micromanipulator	Siskiyou Grants Pass OR USA	MX130R	para posicionar el software Flow
Vision del olfatómetro	Alicat Tuscon AZ USA	FLOWVISIONSC	software para controlar el caudal
Controlador de masa	Alicat Tuscon AZ USA	MC-2SLPM-D	para controlar el caudal de aire humidificado
Controlador de masa	Alicat Tuscon AZ USA	MC-500SCCM-D	para controlar el caudal para la estimulación de olores
Clampex	Molecular Devices Sunnyvale CA USA	Ver. 10.4	software de adquisición de datos
Tubo de suministro de aire	Ace Glass Vineland NJ USA	8802-936	para suministrar aire humidificado
Lente de objetivo de 50X	Olympus Shinjuku, Tokio, Japón	LMPLFL50X	equipo de grabación
Clampfit 10	Molecular Devices Sunnyvale, CA, EE. UU	. Ver. 10.4	software para análisis de picos
Igor Pro 6	WaveMetrics Lake Oswego OR USA	Ver. 6.37	software para análisis de datos
Monitor de audio	ALA Scientific Instruments Farmingdale NY EE. UU	. NPIEXB-AUDIS-08B	Informes auditivos de picos individuales
Amplificador extracelular	ALA Scientific Instruments Farmingdale NY USA	NPIEXT-02F	para aumentar la amplitud de las señales eléctricas Controlador de
válvulas	Warner Instruments	VC-8	para controlar la apertura de la válvula para la estimulación de olores
Micromanipulador de electrodos de registro	Sutter Instruments Novato CA USA	MP-285	para posicionar el electrodo de registro Amplificador de
cabecera	ALA Scientific Instruments Farmingdale NY USA	EQ-16.0008	para aumentar la amplitud de las señales eléctricas
Osciloscopio	Tektronix Beaverton O EE. UU.	TDS2000C	Informe visual de picos individuales