Preparación de muestras y análisis de datos de expresión basada en RNASeq gen de pez cebra

Timothy L. Hostelley; Jessica E. Nesmith; Norann A. Zaghloul

doi:10.3791/56187

Artículo de método

Preparación de muestras y análisis de datos de expresión basada en RNASeq gen de pez cebra

DOI:

10.3791/56187

⸱

27 de octubre de 2017

Timothy L. Hostelley^*¹ , Jessica E. Nesmith^*¹ , Norann A. Zaghloul¹

¹Division of Endocrinology, Diabetes and Nutrition, Department of Medicine, University of Maryland School of Medicine

^* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

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Este protocolo presenta un enfoque para el análisis del transcriptoma completo de embriones de pez cebra, larvas, o clasificar las células. Se incluyen aislamiento de RNA, análisis de la vía de datos RNASeq y qRT-PCR-based validación de los cambios de expresión génica.

Resumen

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El análisis de los cambios de expresión génica global es una herramienta valiosa para la identificación de nuevas vías subyacen fenotipos observados. El pez cebra es un excelente modelo para la evaluación rápida de transcriptoma conjunto de poblaciones de todo animal o individuales de la célula debido a la facilidad de aislamiento de ARN de grandes cantidades de animales. Aquí se presenta un protocolo para el análisis de expresión génica global en embriones de pez cebra, mediante secuenciación del RNA (RNASeq). Se describe la preparación del ARN de embriones enteros o de poblaciones celulares obtenidas mediante célula clasificación en animales transgénicos. También se describe un enfoque para el análisis de datos RNASeq identificar vías enriquecidas y términos de Ontology del Gene (vaya) en conjuntos de datos de expresión génica global. Por último, proporcionamos un protocolo para la validación de los cambios de expresión génica utilizando transcriptasa inversa cuantitativa PCR (qRT-PCR). Estos protocolos pueden utilizarse para el análisis comparativo de control y grupos experimentales del pez cebra para identificar cambios de expresión de gene nuevo y proporcionan la penetración molecular en fenotipos de interés.

Introducción

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Análisis comparativo de expresión génica global es una herramienta valiosa para identificar nuevos genes que contribuyen a los fenotipos observados. Tales análisis normalmente dependen de evaluación cuantitativa de la abundancia de transcripción comparada entre experimentales y control de muestras. Enfoques específicos, tales como qRT-PCR son relativamente rápido y preciso para la investigación de los cambios de expresión de gen único. La secuencia de RNA (RNASeq) ofrece un enfoque amplio, libre de hipótesis para identificar cambios significativos en la expresión génica entre las muestras, lo que es ahora el estándar para tales investigaciones a través de sistemas exp....

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Protocolo

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animal todos los protocolos se detallan a continuación están de acuerdo con y aprobado por la Universidad de Maryland institucional Animal Care y el Comité uso (IACUC).

1. preparación de embriones

generar embriones a través de monta natural
1. embriones de cultura a 3 meses de edad reproductiva madurez ⁵ ^, ⁸.
2. Separar peces adultos macho y hembra de la cepa deseada en tanques de acoplamiento divididos la noche antes de embrión y añadir 2 machos y 3 hembras a cada tanque.
  Nota: Uso de la cepa de transgénicos insulin2a:mCherry<....

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Resultados

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Clasificación de diferencialmente expresados Genes:

Para identificar genes diferencialmente expresados en la etapa larvaria del pez cebra modelos de síndrome de Alström y de síndrome de Bardet-Biedl (BBS), dirigido cualquiera alms1 o transcripciones bbs1 inyectando previamente validaron MOs En bloqueo de empalme embriones de pez cebra de tipo salvaje de¹⁶^,¹⁷

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Discusión

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El enfoque se describe en este protocolo ofrece una estrategia relativamente rápida y rentable para el análisis a nivel de transcriptoma de animales enteros o de poblaciones celulares específicas ordenadas. El pez cebra proporciona un modelo ventajoso para este tipo de estudio debido a la facilidad y rapidez en la generación de grandes cantidades de a partir de material, la facilidad de la aplicación de genética o ambientales condiciones experimentales y la disponibilidad de una gran espectro de líneas transgénicas repor.......

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Este trabajo fue apoyado por R01DK102001 (N.A.Z.), P30DK072488 (N.A.Z.) y T32DK098107 (T.L.H. y J.E.N.).

....

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
fuerte lisis >
TriZol	Thermo Scientific	15596026
tampón de disociación	TrypLE	Gibc	12604013
tampón de disociación	FACSMax	Genlantis	T200100
agua tratada con DEPC	Sigma	95284
Conversión de ADNc FirstStrand	Thermo Scientific	K1621	kit de conversión de ADNc
2X SYBR Green Master Mix	Roche	4707516001	tampón QRT-PCR Master Mix
FACS	Fisher Scientific	50-105-9042
cloroformo	Sigma Aldrich	288306
acetato de sodio	Sigma Aldrich	S2889
Nombre	Compañía	Número de catálogo	>Comentarios
Cepas de pez cebra
Tuebingen	ZIRC	ZL57
ins2a:mCherry	ZIRC	ZL1483
Name	< strong>Company	Número de catálogo	>Comentarios
Equipo
40 micras filtro de células	Sigma	CLS431750
FACS tubo	BD Falcon	352063
hemocitómetro	Sigma	Z359629
Microscopio de disección	Zeiss
Microscopio invertido	Zeiss
Nanodrop	Thermo Scientific
Illumina HiSeq	Illumina
LightCycler 480	Roche
Tanques de acoplamiento 1.0L Juego de tanques de cruce	Acuanear	ZHCT100
Tubo FACS 5 mL tubo de polipropileno	BD Falcon	352063
Name	>Company	>Número de catálogo	>Comentarios
Software
Excel
Microsoft Consensus Path DB	Análisis
GO	http://geneontology.org/page/go-enrichment-analysis

o 1 2 de enriquecimiento de http://cpdb.molgen.mpg.de/

Referencias

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Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish. , Oxford University Press. (2002).
Detrich, H. W., Zon, L., Westerfield, M. The Zebrafish: Disease Models and Chemical Screens. , 4th ed, Academic Press. (2017).
Detrich, H. W., Zon, L. I., Westerfield, M.

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RNASeq en pez cebra an lisis de expresi n g nica aislamiento de ARN clasificaci n celular validaci n mediante qRT PCR enriquecimiento de rutas an lisis de t rminos GO expresi n diferencial perfilado del transcriptoma estadificaci n embrionaria

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