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Artículo de método

Un análisis de citotoxicidad basados en la citometría de flujo para la evaluación de la actividad de las células NK humanas

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DOI:

10.3791/56191

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9 de agosto de 2017

 ,  ,  , 
1UCLA Immunogenetics Center, Department of Pathology and Laboratory Medicine, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

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Resumen

Aquí se muestra un método basado en la citometría de flujo para determinar cuantitativamente la actividad citotóxica de las células de asesino naturales humanas.

Resumen

Dentro del sistema inmune innato, los linfocitos efectores conocidos como células de naturales del asesinas (NK) juegan un papel esencial en la defensa del huésped contra las células aberrantes, especialmente eliminando tumoral y viralmente infectadas las células. Aproximadamente 30 defectos monogénicas conocidos, junto con una serie de otras condiciones patológicas, deficiencia funcional o clásico NK célula, que se manifiesta en reducción o ausencia de actividad citotóxica. Históricamente, se ha investigado la citotoxicidad con métodos radiactivos, que son engorrosos, costosos y potencialmente peligrosos. Este artículo describe un método basado en la citometría de flujo aerodinámico, clínicamente aplicable para cuantificar la actividad citotóxica de células NK. En este ensayo, las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) o preparaciones de células NK purificadas son co se incubó a relaciones diferentes con una línea de células de tumor objetivo sabida que es sensible a la citotoxicidad mediada por células NK (NKCC). Las células diana son las marcadas con un colorante fluorescente para permitir la discriminación de las células efectoras (células NK). Después del período de incubación, las células diana mataron son identificadas por una mancha de ácido nucleico, que impregna específicamente células muertas. Este método es susceptible de diagnóstico y aplicaciones de investigación y, gracias a las capacidades de múltiples parámetros de la citometría de flujo, tiene la ventaja añadida de que potencialmente permite un análisis más profundo del fenotipo de la célula NK y la función.

Introducción

Células de naturales del asesinas (NK) son un subconjunto sofisticado de linfocitos innatos humanos críticamente implicados en la eliminación de las células viralmente infectadas, las células transformadas y otras amenazas patógenas 1,2. Casa de gránulos líticos de la célula NK proteínas citotóxicas, como perforin y granzymes. Tras la activación, las células NK forman una interacción compleja con sus objetivos conocidos como sinapsis inmunológica, por el que estas moléculas citolíticas se liberan localmente, dando por resultado la lisis de la célula objetivo directo y apoptosis, junto con liberación de citoquinas y quimioquinas y en última instancia en la inducción de un inflamatorio estado 1,3,4.

Activación de la célula NK involucra una compleja cadena de activación y las interacciones inhibitorias entre NK célula receptores y ligandos expresadas en la superficie de las células de la blanco, formando un sistema fuertemente regulado. Uno de los mecanismos más estudiados de la activación de células NK es la "falta". De hecho, falta de detección de clase en que mayor complejo de histocompatibilidad (MHC), o moléculas de leucocito humano antígeno (HLA), infectados o transformado citotoxicidad celular de células desencadenantes NK. Tumorales y células infectadas por virus generalmente regular a la baja estos antígenos para escapar de la inmunidad mediada por células T, convirtiéndose en principal NK célula objetivos 1,3,4.

Evaluación de la función de la célula NK se categoriza principalmente en degranulación o citotoxicidad ensayos. Sin embargo, ensayos de degranulación, como detección de citometría de flujo del degranulation asociados marcador CD107a, sólo son indicativos de la activación de células NK y no de su función final, la muerte directa de las células objetivo 5,6,7,8. Por lo tanto, esta limitación ha dibujado los investigadores ensayos de citotoxicidad como alternativa más directa y más revelador.

El largo plazo "gold standard" para evaluar la actividad citotóxica mediada por células de las células T y NK es el ensayo de liberación de cromo (CRA). CRA implica radiactivo etiquetado de células diana con 51Cr y co los incuban con las células efectoras. Este ensayo se empapa en el principio que lisis celular resulta en la liberación de proteína determinada 51Cr en el sobrenadante, que puede ser medido contando gamma. Este ensayo, al mismo tiempo eficaz, es problemático para una variedad de razones: altos costos de material, manejo y disposición de radiactivo 51Cr, lanzamiento espontáneo de 51Cr y difícil estandarización - lo que en conjunto práctico 9,10.

Un número de ensayos no radiactivo, con etiquetado fluorescente, liberación de enzima e incluso bioluminiscencia, desde entonces se han desarrollado como alternativas a la CRA 11,12,13,14. Aquí describimos un método basado en la citometría de flujo para medición de NK célula actividad citotóxica en las células K562 objetivo simple, sensible y reproducible. Células K562 son una células erythroleukemic humana la línea con menor expresión de HLA clase I y una mayor expresión de ligandos para receptores NK activatory, que los hace particularmente susceptibles a NK Citotoxicidad mediada por células 15. En este ensayo, las células K562 están marcadas previamente con carboxyfluorescein diacetato succinimidyl éster (CFSE) y cultivan conjuntamente en diferentes proporciones con cualquiera células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) o purificaron de células NK 1. CFSE es un colorante fluorescente estable, proteínas de Unión que permite la discriminación de las células de la blanco del efectoras NK células 16,17. Después de la incubación Co, una mancha de ácido nucleico, específicamente impregnando la membrana de las células muertas, se utiliza para identificar las células de la blanco matado (véase tabla de materiales). Las muestras entonces se adquieren en un citómetro de flujo para determinar el porcentaje de muertos (es decir, mancha +) CFSE + células diana.

Este ensayo puede utilizarse como una investigación rutinaria de diagnóstico para defectos monogénicas, que afectan el compartimiento de células NK, que son aproximadamente 30 defectos conocidos que causan deficiencia de células NK ya sea funcional o clásica, y para el lymphohistiocytosis hemophagocytic primario o secundario. También es útil para investigar la actividad de células NK en pacientes con infecciones virales herpes recurrente, grave, para evaluar la reconstitución inmune tras el trasplante de células hematopoyéticas o post inmunomoduladores terapia 18,19,20y de una serie de aplicaciones de la investigación básica.

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Protocolo

Las muestras se recolectaron de acuerdo con las pautas éticas establecidas por el Programa de Protección de la Investigación Humana de UCLA y aprobadas por el IRB.

1. Preparación de reactivos

NOTA: A menos que se indique lo contrario, se debe permitir que todos los reactivos se equilibren a temperatura ambiente antes de su uso. Todos los reactivos deben permanecer estériles.

  1. Prepare una solución de trabajo 2 veces mayor de Tween-20 (es decir, 0,2%) añadiendo 10 μL de solución de Tween-20 a 5 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) sin calcio y magnesio con una pipeta p20.
    1. Dada la alta viscosidad de Tween-20, siga los siguientes pasos para garantizar la precisión: recoja lentamente para evitar la formación de burbujas, no sumerja toda la punta para evitar el arrastre y pipetee hacia arriba y hacia abajo varias veces en PBS para lavar todo Tween-20 de la punta.
  2. Agregue 2 μL de solución madre de IL-2 (2.1E6 UI/mL) a 198 μL de medio completo (es decir, dilución 1:100), que es RPMI con 1% de penicilina-estreptomicina y 10% de suero fetal bovino (FBS), luego proceda a una dilución adicional 1:100 agregando 2 μL de solución intermedia de IL-2 a 198 μL de medio completo para preparar una solución de trabajo 7x (210 UI/mL).
  3. Agregue 2 μL de solución madre de CFSE (5 mM) a 500 μL de medio simple (RPMI). Vortex, gire hacia abajo para eliminar las gotas de la tapa, luego proceda con una dilución adicional 1:20 agregando 50 μL de la solución intermedia CFSE a 950 μL de RPMI simple para obtener una solución de trabajo 2x de 1 μM. Vortex bien y manténgalo protegido de la luz.

2. Aislamiento de PBMCs como células efectoras

NOTA: Este ensayo ha sido validado para su uso efectivo con PBMC totales de controles sanos. Sin embargo, se recomienda que el contenido de células NK se verifique con cada preparación de PBMC (Figura 1). Además, el volumen de sangre entera para la recolección se basa en la frecuencia de células NK en la sangre total periférica y esto puede variar de una persona a otra, particularmente entre donantes sanos y pacientes.

  1. Recolectar un mínimo de 4 mL de sangre humana entera en tubos de recolección de sangre heparinizada con sodio o litio. Almacene las muestras de sangre a temperatura ambiente en el momento de la recolección y utilícelas dentro de las 30 horas posteriores a la recolección.
  2. Diluya la sangre entera con 4 mL de PBS (es decir, el mismo volumen de PBS que la sangre entera).
  3. Agregue 4 mL de solución de gradiente de densidad (ver tabla de materiales) a un tubo cónico de 15 mL. Cubra cuidadosamente la sangre entera diluida sobre la solución de gradiente de densidad inclinando el tubo.
  4. Centrifugar a 650 x g durante 24 min con el freno apagado.
  5. Recoja cuidadosamente la capa de células mononucleares, que es la capa blanca delgada debajo de la capa superior de plasma y plaquetas, en un nuevo tubo cónico de 15 ml. Lleve el volumen a 15 mL con PBS.
  6. Centrifugar a 450 x g durante 10 min con el freno puesto. Aspire el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 0,5 mL de medio completo.
  7. Utilice un contador de células automatizado o un hemocitómetro para contar las células y ajuste la concentración de PBMC a 5x106 células/mL con medios completos.
  8. Compruebe el contenido de células NK mediante citometría de flujo (ver paso 4).
  9. Comience el ensayo dentro de los 30 minutos. Mantenga las células a temperatura ambiente durante un máximo de 10 minutos, o colóquelas en una incubadora humidificada con 5% deCO2 a 37 °C hasta que estén listas para usar.

3. Aislamiento de células NK como células efectoras

NOTA: Esta parte del protocolo es una alternativa al uso de PBMCs totales como células efectoras. El rendimiento típico de 4 mL de sangre entera de un individuo sano es de aproximadamente 4x105 células NK, o aproximadamente 5-15% de PBMC, aunque esta frecuencia varía entre donantes 21. Se recomienda realizar un control de pureza después del aislamiento.

  1. Recolectar un mínimo de 4 mL de sangre humana entera en tubos de recolección de sangre heparinizada con sodio o litio. Tome 50 μL de sangre entera para teñir como muestra previa al enriquecimiento.
  2. Añadir el cóctel de enriquecimiento a las muestras de sangre a 50 μL/mL (ver tabla de materiales). Mezclar bien e incubar durante 10 min a temperatura ambiente.
  3. Agregue un volumen igual de PBS + 2% de FBS para diluir la muestra y mezcle suavemente bien.
  4. Agregue 4 mL de solución de gradiente de densidad a un tubo cónico de 15 mL. Superponga cuidadosamente la muestra diluida sobre el medio de gradiente de densidad.
  5. Centrifugar a 1.200 x g durante 10 min con el freno apagado.
  6. Recoja cuidadosamente la capa de células enriquecidas en un nuevo tubo cónico de 15 ml. Lave las células elevando el volumen hasta 50 mL con PBS + 2% FBS.
  7. Centrifugar a 300 x g durante 10 min. Deseche el sobrenadante y repita el lavado.
  8. Aspire el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 0,5 mL de medio completo.
  9. Usando un contador de células automatizado o un hemocitómetro, cuente las células y ajuste la concentración a 5x105 células/mL. Tome 50 μL de suspensión celular purificada para teñir como muestra posterior al enriquecimiento.
  10. Mantenga las células a temperatura ambiente durante un máximo de 10 minutos, o colóquelas en una incubadora humidificada con 5% deCO2 a 37 °C hasta que estén listas para usar.

4. Inmunofenotipado para la evaluación del contenido de células NK

  1. Usando 50 μl de PBMC aisladas totales, sangre entera previa al enriquecimiento o células NK purificadas, tinción con anticuerpo conjugado con fluorocromo anti-CD56 como marcador de células NK. También se pueden incluir marcadores para otros tipos de células y linajes (es decir, células T CD3+, células B CD19+) para evaluar el origen de la contaminación, si la hubiera.
  2. Incubar durante 20 min a 4 °C y lavar añadiendo 2 mL de PBS + 2% de FBS.
  3. Centrifugar a 450 x g durante 5 min.
  4. En el caso de las células PBMC o NK, aspire el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 100 μL de PBS + 2% de FBS.
  5. Para muestras de sangre completa, realice la lisis de glóbulos rojos (RBC):
    1. Después de la centrifugación, aspirar el sobrenadante y volver a suspender en 2 mL de tampón de lisis de glóbulos rojos (31,75 g de cloruro de amonio + 4,16 g de Tris base + 6,65 g de EDTA, disuelto en 5000 mL de agua desionizada).
    2. Incubar durante 10 min a temperatura ambiente.
    3. Repetir el lavado dos veces, aspirar el sobrenadante y volver a suspender la muestra lisada en 100 μL de PBS + 2% FBS.
      NOTA: La lisis de glóbulos rojos también se puede realizar antes de la tinción.
    4. Proceda con el análisis de citometría de flujo.

5. Descongelación, cultivo y recolección de células objetivo K562

  1. Aliquot 10 mL de medio completo en un tubo cónico de 15 mL y dejar calentar en un baño de agua a 37 °C. Para la descongelación y el cultivo de células K562, utilice únicamente medios precalentados a 37 °C para todos los pasos.
  2. Coloque un vial de células K562 congeladas en el baño de agua a 37 °C hasta que se descongele la mayor parte.
  3. Transfiera las células K562 semidescongeladas al medio completo, precalentado a 37 °C, en el tubo cónico de 15 ml. Lave el interior del vial criogénico con algunos medios precalentados y agregue el lavado al tubo de 15 ml.
  4. Centrifugar a 140 x g durante 7 min con el freno puesto. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 1 mL de medio completo.
  5. Alícuota una cantidad apropiada de suspensión celular para contar células usando un contador de células automatizado o un hemocitómetro.
  6. Ajustar la concentración a 1x10 5-2x105 células/mL y cultivar en una incubadora humidificada de CO2 al 5% a 37 °C durante al menos 2 días antes de su uso. Mantenga el cultivo en este rango de densidad durante no más de 3 meses, luego descongele una nueva alícuota. Nunca exceda una concentración celular de 1x106 células/mL en cultivo.
  7. Para su uso en el ensayo, mezcle bien el cultivo celular K562 con una pipeta serológica de 10 ml y extraiga una alícuota para contar y evaluar la viabilidad celular utilizando un contador celular automatizado o un hemocitómetro y tinción con azul de tripano.
    1. Si la viabilidad es inferior al 85%, proceda con los siguientes pasos de eliminación de células muertas.
      1. Agregue 15 mL de solución de gradiente de densidad a tubos cónicos de 50 mL, según sea necesario. Recoja todas las células del cultivo y superponga lentamente la suspensión celular sobre la solución de gradiente de densidad inclinando el tubo.
      2. Centrifugar a 650 x g durante 24 min con el freno desactivado. Recoja cuidadosamente la capa de células vivas en un nuevo tubo cónico de 15 ml. Lleve el volumen a 50 ml con PBS.
      3. Centrifugar a 450 x g durante 10 min con el freno puesto. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 1 mL de medio completo. Cuente las celdas y verifique la viabilidad de las celdas (como en 5.7).
      4. Cultivo en una incubadora humidificada con 5% de CO2 a 37 °C durante al menos 2 días antes de su uso.
  8. Recoja 5x105 células objetivo K562 y centrifuga a 140 x g durante 7 min. Aspire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet de la célula en 500 μL en medios con FBS al 1%.

6. Etiquetado de las células objetivo K562

NOTA: Asegúrese de que las celdas K562 estén bien resuspendidas antes de agregar la solución de trabajo CFSE.

  1. Pipetear 500 μL de la solución de trabajo CFSE a los 500 μL de células K562 para una concentración final de 0,5 μM. Usando la misma punta de 1000-1250 μL, mezclar inmediatamente pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo 3-5 veces.
  2. Incubar en el baño de agua a 37 °C o en una incubadora humidificada con 5% de CO2 a 37 °C durante 10 min en la oscuridad.
    NOTA: Dado que el tiempo de retraso de equilibrio de temperatura es más largo en la incubadora en comparación con el baño de agua, es posible que sea necesario ajustar el tiempo de incubación especialmente para volúmenes > 1 mL.
  3. Apague la reacción de etiquetado con 10 mL de medio completo durante 10 min en la oscuridad a temperatura ambiente.
  4. Centrifugar las células K562 marcadas a 140 x g durante 7 min. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender en 1 mL de medio completo.
  5. Cuente las células utilizando un contador de células automatizado o un hemocitómetro y lleve la concentración a 1x105 células/mL en medios completos.
  6. Coloque las células en una incubadora humidificada de CO2 al 5% a 37 °C hasta que estén listas para su uso. Las células pueden mantenerse a temperatura ambiente durante un máximo de 10 minutos, o en una incubadora deCO2 humidificada a 37 °C hasta que estén listas para su uso. No refrigerar.

7. Enchapado

NOTA: Si las células NK son limitantes, la concentración de las células K562 y NK puede reducirse a la mitad, de modo que la mitad de las células queden sembradas en el ensayo. El ensayo produce resultados comparables con la mitad de la cantidad de células (siempre que las proporciones se mantengan consistentes).

  1. Si se utilizan PBMC totales, etiquete una placa tratada con cultivo de tejidos de 96 pocillos, fondo en U, para las siguientes condiciones por pocillo: (1) Efector (E) : Objetivo (T) = 50 : 1 + IL-2 - control positivo para la citotoxicidad de las células NK; (2) E : T = 50 : 1; (3) E : T = 25 : 1; (4) E : T = 12,5 : 1; (5) E : T = 6,25 : 1; (6) T - solo células diana - control negativo para la muerte de K562; (7) E - células efectoras solamente; (8) T + Tween - Control positivo para la muerte de K562
  2. Si se utilizan células NK purificadas, etiquete una placa tratada con cultivo de tejidos de 96 pocillos, con fondo en U, para las siguientes condiciones por pocillo: (1) Efector (E) : Objetivo (T) = 5: 1 + IL-2 - control positivo para la citotoxicidad de las células NK; (2) E : T = 5 : 1; (3) E : T = 2,5 : 1; (4) E : T = 1,25 : 1; (5) E : T = 0,625: 1; (6) T - solo células diana - control negativo para la muerte de K562; (7) E - células efectoras solamente; (8) T + Tween - control positivo para la muerte por K562
  3. Añada 100 μL de medio completo a las condiciones 3, 4, 5, 6, 7. Para este y todos los pasos posteriores, (recomendado) utilice una pipeta multicanal.
  4. Añadir 100 μL de células efectoras (PBMC a 5x106 células/mL o células NK purificadas a 5x105 células/mL) a las condiciones 1, 2, 3. Agregue celdas efectoras para las condiciones 4-7 por dilución en serie. No cambie las puntas de una condición a otra.
    1. Mezcle la condición 3, tome 100 μL y transfiéralo a la condición 4.
    2. Mezcle la condición 4, tome 100 μL y transfiera a la condición 5.
    3. Mezclar la condición 5, tomar 100 μL y transferir a la condición 7; La condición 6 no tiene células efectoras.
  5. Añadir 100 μL de solución de trabajo preparada 2x 0,2% Tween a la condición 8 (concentración final: 0,1% Tween-20); la condición 8 no tiene células efectoras.
  6. Añadir 30 μL de solución de trabajo de IL-2 a la condición 1. La IL-2 debe añadirse a la suspensión de la célula efectora antes de la adición de la suspensión de la célula diana (concentración final: 27 UI/mL).
  7. Agregue 100 μL de células diana (células K562 marcadas a 1x105 células/mL) a las condiciones 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8. La condición 7 no tiene celdas objetivo.
  8. Mezclar todos los pocillos con una pipeta multicanal y centrifugar la placa a 120 x g durante 2 min.
  9. Incubar en una incubadora humidificada deCO2 a 37 °C durante 4 h. Al final de la incubación, coloque la placa en hielo y proceda a la tinción de viabilidad dentro de los 30 minutos.

8. Tinción para viabilidad y adquisición

  1. Prepare la tinción de células muertas (ver tabla de materiales) añadiendo 3 μL de la solución madre de 5 μM a 600 μL de PBS.
  2. Añada 50 μL de tinción de células muertas diluida a cada pocillo para obtener un volumen final de 250 μL y una concentración final de 0,005 μM. Mezclar bien con una pipeta multicanal.
  3. Proceda con el análisis de citometría de flujo. Usando un citómetro de flujo, recoja al menos 1.000 eventos en la puerta de la célula objetivo (Figura 2) para obtener resultados estadísticamente significativos.

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Resultados

Antes de establecer el ensayo, se recomienda evaluar contenido de células NK en la población de efector de elección. La figura 1 muestra una típica coloración CD56 antes (azul claro) y después de enriquecimiento de células NK (rojo). Las células NK constituyen hasta un 15% de PBMCs y deben ser por lo menos 80% de pureza después de enriquecimiento.

El análisis cytometric del flujo en este ensayo impl...

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Discusión

El método descrito aquí proporciona una alternativa sencilla y rentable para el ensayo de lanzamiento tradicionales 51Cr para evaluar la actividad citotóxica de células NK. Este método es sensible, reproducible y menos desperdiciador de tiempo que los anteriores métodos estándar, como CRA y puede ser utilizado para ambas clínicas y aplicaciones de investigación.

Mientras que el ensayo trabaja con total PBMCs y enriquecida de las células NK, la opción de usar PBMCs sin la necesidad d...

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Divulgaciones

Los autores no declaran conflictos de interés financiero.

Agradecimientos

Nos gustaría agradecer a Jill Narciso, centro de inmunogenética de UCLA, por su asistencia con la preparación del manuscrito.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Solución salina tamponada con fosfato (1x, sin Ca2+ y Mg2+)Corning (Cellgro)21-040-CM
Ficoll-Paque PLUSGE Healthcare17-1440-02
Tween-20SigmaBP337-100
RPMI 1640 MediaCorning (Cellgro)10-040-CV
Suero fetal bovino inactivado por calorOmega ScientificFB-02
Penicilina EstreptomicinaLife Technologies15140-163Solución madre a 10.000 U/mL
IL-2R& D Systems202-IL-050Liofilizado a partir de un 0,2 μ m solución filtrada en acetonitrilo y TFA con BSA como proteína transportadora. Reconstituir con 500 ul a 100 μ g/mL en ácido acético estéril de 100 mM que contiene al menos un 0,1% de albúmina sérica bovina (2,1x10E6 UI/ml)
Células K562ATCCCCL-243Línea celular cancerosa 
Matraces de cultivo celular T-75Corning431464
Kit de proliferación celular CFSELife Technologies (CellTrace)C34554Vial Reconstituir I con DMSO de 18 ul para preparar una solución madre de 5 mM. No congelar/descongelar.
de Sytox RedLife TechnologiesS34859se proporciona a las 5 μ M en 1 mL DMSO. La solución de DMSO puede someterse a múltiples ciclos de congelación-descongelación sin degradación del reactivo.
Tubos de extracción de sangre con heparina de sodio/litioBD02-687-95
Placa de 96 pocillos con fondo enU Pipetas
Falcon
Tubos de poliestireno de fondo redondo (5 ml)BD Falcon14959-5
50 mL tubo cónico de polipropilenoBD Falcon352070
15 mL tubo cónico de polipropilenoBD Falcon352097
Depósito de reactivosUSA Scientific2321-2230
Cóctel de enriquecimiento de células NKhumanas StemCell Technologies (RosetteSep)15065
La solución madre serológicas Corning CLS3897 BD

Referencias

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Erratum


Formal Correction: Erratum: A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity
Posted by JoVE Editors on 9/10/2017. Citeable Link.

An erratum was issued for: A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity. Figure 4 has been corrected to show background-corrected data.

Figure 4 was updated from:

Target cell death vs effector ratio graph; healthy donor vs patient comparison, percent cell death.

to:

Effector:Target cell death comparison graph, healthy donor vs patient, cytotoxicity analysis.

Etiquetas

C lulas Natural Killermonocitos sangu neos perif ricosseparaci n por gradiente de densidadmarcado de c lulas dianarelaci n efector dianatinci n de c lulas muertasc lulas diana K562
Un análisis de citotoxicidad basados en la citometría de flujo para la evaluación de la actividad de las células NK humanas
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