Aquí se muestra un método basado en la citometría de flujo para determinar cuantitativamente la actividad citotóxica de las células de asesino naturales humanas.
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Artículo de método
Un análisis de citotoxicidad basados en la citometría de flujo para la evaluación de la actividad de las células NK humanas
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Resumen
Resumen
Dentro del sistema inmune innato, los linfocitos efectores conocidos como células de naturales del asesinas (NK) juegan un papel esencial en la defensa del huésped contra las células aberrantes, especialmente eliminando tumoral y viralmente infectadas las células. Aproximadamente 30 defectos monogénicas conocidos, junto con una serie de otras condiciones patológicas, deficiencia funcional o clásico NK célula, que se manifiesta en reducción o ausencia de actividad citotóxica. Históricamente, se ha investigado la citotoxicidad con métodos radiactivos, que son engorrosos, costosos y potencialmente peligrosos. Este artículo describe un método basado en la citometría de flujo aerodinámico, clínicamente aplicable para cuantificar la actividad citotóxica de células NK. En este ensayo, las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) o preparaciones de células NK purificadas son co se incubó a relaciones diferentes con una línea de células de tumor objetivo sabida que es sensible a la citotoxicidad mediada por células NK (NKCC). Las células diana son las marcadas con un colorante fluorescente para permitir la discriminación de las células efectoras (células NK). Después del período de incubación, las células diana mataron son identificadas por una mancha de ácido nucleico, que impregna específicamente células muertas. Este método es susceptible de diagnóstico y aplicaciones de investigación y, gracias a las capacidades de múltiples parámetros de la citometría de flujo, tiene la ventaja añadida de que potencialmente permite un análisis más profundo del fenotipo de la célula NK y la función.
Introducción
Células de naturales del asesinas (NK) son un subconjunto sofisticado de linfocitos innatos humanos críticamente implicados en la eliminación de las células viralmente infectadas, las células transformadas y otras amenazas patógenas 1,2. Casa de gránulos líticos de la célula NK proteínas citotóxicas, como perforin y granzymes. Tras la activación, las células NK forman una interacción compleja con sus objetivos conocidos como sinapsis inmunológica, por el que estas moléculas citolíticas se liberan localmente, dando por resultado la lisis de la célula objetivo directo y apoptosis, junto con liberación de citoqui....
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Protocolo
Las muestras se recolectaron de acuerdo con las pautas éticas establecidas por el Programa de Protección de la Investigación Humana de UCLA y aprobadas por el IRB.
1. Preparación de reactivos
NOTA: A menos que se indique lo contrario, se debe permitir que todos los reactivos se equilibren a temperatura ambiente antes de su uso. Todos los reactivos deben permanecer estériles.
- Prepare una solución de trabajo 2 veces mayor de Tween-20 (es decir, 0,2%) añadiendo 10 μL de solución de Tween-20 a 5 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) sin calcio y magnesio con una pipeta p20.
- Dada la....
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Resultados
Antes de establecer el ensayo, se recomienda evaluar contenido de células NK en la población de efector de elección. La figura 1 muestra una típica coloración CD56 antes (azul claro) y después de enriquecimiento de células NK (rojo). Las células NK constituyen hasta un 15% de PBMCs y deben ser por lo menos 80% de pureza después de enriquecimiento.
El análisis cytometric del flujo en este ensayo impl.......
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Discusión
El método descrito aquí proporciona una alternativa sencilla y rentable para el ensayo de lanzamiento tradicionales 51Cr para evaluar la actividad citotóxica de células NK. Este método es sensible, reproducible y menos desperdiciador de tiempo que los anteriores métodos estándar, como CRA y puede ser utilizado para ambas clínicas y aplicaciones de investigación.
Mientras que el ensayo trabaja con total PBMCs y enriquecida de las células NK, la opción de usar PBMCs sin la necesidad d.......
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Divulgaciones
Los autores no declaran conflictos de interés financiero.
Agradecimientos
Nos gustaría agradecer a Jill Narciso, centro de inmunogenética de UCLA, por su asistencia con la preparación del manuscrito.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Solución salina tamponada con fosfato (1x, sin Ca2+ y Mg2+) | Corning (Cellgro) | 21-040-CM | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Tween-20 | Sigma | BP337-100 | |
| RPMI 1640 Media | Corning (Cellgro) | 10-040-CV | |
| Suero fetal bovino inactivado por calor | Omega Scientific | FB-02 | |
| Penicilina Estreptomicina | Life Technologies | 15140-163 | Solución madre a 10.000 U/mL |
| IL-2 | R& D Systems | 202-IL-050 | Liofilizado a partir de un 0,2 μ m solución filtrada en acetonitrilo y TFA con BSA como proteína transportadora. Reconstituir con 500 ul a 100 μ g/mL en ácido acético estéril de 100 mM que contiene al menos un 0,1% de albúmina sérica bovina (2,1x10E6 UI/ml) |
| Células K562 | ATCC | CCL-243 | Línea celular cancerosa |
| Matraces de cultivo celular T-75 | Corning | 431464 | |
| Kit de proliferación celular CFSE | Life Technologies (CellTrace) | C34554 | Vial Reconstituir I con DMSO de 18 ul para preparar una solución madre de 5 mM. No congelar/descongelar. |
| de Sytox Red | Life Technologies | S34859 | se proporciona a las 5 μ M en 1 mL DMSO. La solución de DMSO puede someterse a múltiples ciclos de congelación-descongelación sin degradación del reactivo. |
| Tubos de extracción de sangre con heparina de sodio/litio | BD | 02-687-95 | |
| Placa de 96 pocillos con fondo en | U Pipetas | ||
| Falcon | |||
| Tubos de poliestireno de fondo redondo (5 ml) | BD Falcon | 14959-5 | |
| 50 mL tubo cónico de polipropileno | BD Falcon | 352070 | |
| 15 mL tubo cónico de polipropileno | BD Falcon | 352097 | |
| Depósito de reactivos | USA Scientific | 2321-2230 | |
| Cóctel de enriquecimiento de células NK | humanas StemCell Technologies (RosetteSep) | 15065 |
Referencias
- Iannello, A., Debbeche, O., Samarani, S., Ahmad, A. Antiviral NK cell responses in HIV infection: I. NK cell receptor genes as determinants of HIV resistance and progression to AIDS. J Leukoc Biol. 84 (1), 1-26 (2008).
- Caligiuri, M. A. Human natural killer cells.
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Reimpresiones y permisos
Erratum
Formal Correction: Erratum: A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity
Posted by JoVE Editors on 9/10/2017. Citeable Link.
An erratum was issued for: A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity. Figure 4 has been corrected to show background-corrected data.
Figure 4 was updated from:
to:
