Este video muestra un procedimiento para la generación de cultivos neuronales a partir de finales de embriones y la corteza temprana de ratón postnatal. Estos cultivos pueden ser utilizados para inmunocitoquímica, la bioquímica, la electrofisiología, calcio y sodio de imagen y proporcionar una plataforma para estudiar el desarrollo neuronal de los animales transgénicos que portan una mutación del gen letal después del parto.
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Artículo de método
Preparación de los cultivos disociados ratón neuronas corticales
En este artículo
Resumen
Resumen
Este video lo guiará en el proceso de generación de cultivos de neuronas corticales de embrión tardío y temprano del cerebro del ratón postnatal. Estas culturas se pueden utilizar para una variedad de aplicaciones, incluyendo la inmunocitoquímica, la bioquímica, la electrofisiología, imágenes de calcio y sodio, proteínas y / o aislamiento de ARN. Estas culturas también proporcionan una plataforma para estudiar el desarrollo neuronal de los animales transgénicos que portan una mutación letal del gen embrionario tardío y postnatal. El procedimiento es relativamente sencillo, requiere de cierta experiencia en la técnica de cultivo de tejidos y no debe tardar más de dos o tres horas si está debidamente preparado. Cuidadosa separación de la corteza cortical del tracto de fibras tálamo-corticales se reducirá el número de embarazos no deseados células no neuronales. Para aumentar la producción de las células neuronales triturar las piezas del tejido cortical suavemente después de la etapa de incubación enzimática. Esto es imprescindible, ya que evita daños innecesarios a las células y la muerte prematura de las células neuronales. Debido a que estos cultivos se mantienen en ausencia de células alimentadoras glía, sino que también ofrecen una ventaja adicional de cultivos en crecimiento enriquecido en las neuronas.
Protocolo
Los preparativos antes del día de cultivo:
- Prepare una solución estéril de disección (DS).
- Prepare NBM/B27 (Mediom Neurobasal con suplementos B27).
- Autoclave ddH2O y esterilizar coversilps vidrio, si es necesario.
- Escudo platos de cultivo de tejidos o cubreobjetos de vidrio con poli-D-lisina.
Poli-D-lisina de revestimiento:
Preparar el día antes de cultivo en condiciones estériles.
- Descongele alícuota del PDL 10 veces y el lugar en el hielo.
- Añadir 9 ml estéril ultra filtrado de agua a 1 ml de PDL y mezclar bien (1X).
- Cubra ....
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 5-Fluoro-2’-deoxiuridina | Sigma-Aldrich | F0503 | |
| Cloruro de sodio | Sigma-Aldrich | S9625 | |
| Vibraslicer | Campden Instruments | ||
| Cloruro de potasio | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| Fosfato de sodio dibásico | Sigma-Aldrich | S0876 | |
| Fosfato de potasio monobásico | Sigma-Aldrich | P5379 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| D(+)-Glucosa | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Sacarosa | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Poli-D-lisina | Sigma-Aldrich | P7280 | |
| Suplemento B27 | Invitrogen | 17504-044 | |
| Medio Neurobasal (NBM) | Invitrogen | 21103-049 | |
| Ácido 2-amino-5-fosfonopentanoico | Sigma-Aldrich | A5282 | |
| Albúmina bovina | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| Inhibidor de tripsina | Sigma-Aldrich | T9253 | |
| Hidróxido de sodio, solución 1N | Fisher Scientific | SS266-1 | |
| L-Cisteína | Sigma-Aldrich | C7755 | |
| Agar Bacto | Difco Laboratories | 0140-01 | |
| Papaína | Worthington Biochemical | LS 03126 | |
| Filtro estéril para jeringa de 0,2 μm | Fisher Scientific | DDA02025S0 | |
| Cubreobjetos de vidrio, No1, 12 mm | Bellco Glass | 1943-00012 | |
| Medio Mínimo Esencial (MEM) | Invitrogen | 11090-081 | con sales de Earle’s sin L-glutamina, necesario para cultivar cultivos no neuronales |
| Penicilina/Estreptomicina | Invitrogen | 15070-063 | para cultivo no neuronal |
| Suero bovino fetal | Invitrogen | 16140-071 | necesario para cultivos no neuronales |
| Frascos de cultivo de tejidos Nunclon "Triple Flask" | Fisher Scientific | 12-565-25 | Utilizar para cultivos no neuronales. Estos frascos son muy convenientes para producir "medio Neurobasal/B27 enriquecido", aunque también se pueden usar otros frascos o placas de cultivo de tejidos. |
| Placas de vidrio para imágenes "Imaging dishes" | MatTek Corp. | P35G-1.5-10-C | Placas de cultivo de fondo de vidrio de 35 mm, ideales para imágenes de calcio o sodio cuando se utiliza un sistema de imagen invertido. ¡Pero son caras! |
Reimpresiones y permisos
