El objetivo de este protocolo es modificar la penetrancia de fenotipos mutantes esqueléticos letal en el pez cebra por cría selectiva. Mutantes letales no pueden cultivarse a la edad adulta y crían ellos mismos, por lo tanto este protocolo describe un método de seguimiento y selección de penetración a través de múltiples generaciones por prueba de progenie.
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Artículo de método
Cambio de penetrancia mutante esquelética letal de pez cebra por prueba de progenie
En este artículo
Resumen
Resumen
Pez cebra mutantes fenotipos son a menudo incompleto penetrantes, que se manifiesta sólo en algunas mutantes. Fenotipos interesantes que aparecen sistemáticamente pueden ser difíciles de estudiar y pueden conducir a la confusión de resultados. El protocolo descrito aquí es un paradigma de reproducción directa para aumentar y disminuir la penetrancia en mutantes esquelética letal pez cebra. Porque mutantes letales no pueden ser criados selectivamente directamente, se emplea la estrategia clásica cría selectiva de prueba de progenie. Este método también incluye protocolos para el pez cebra de Genotipado de Kompetitive alelo específico PCR (KASP) y coloración de larvas de pez cebra cartílago y hueso. Aplicación de la estrategia de cría descrita aquí puede aumentar la penetración de un fenotipo esquelético interesante que permite resultados más reproducibles en aplicaciones posteriores. Además, disminuye la penetrancia mutante a través de esta estrategia de cría selectiva puede revelar los procesos del desarrollo que requieren más crucial la función del gen mutado. Mientras que el esqueleto se considera específicamente aquí, proponemos que esta metodología sea útil para todas las líneas de pez cebra mutante.
Introducción
El pez cebra es un sistema potente para comprender el desarrollo del esqueleto. Variedades de pez cebra mutante, biólogos descifrar funciones de los genes durante la skeletogenesis. Sin embargo, pueden presentar fenotipos mutantes esqueleto de pez cebra con penetrance variable1,2,3,4 que puede dificultar el análisis del desarrollo y genéticos. El propósito de este método es triple. En primer lugar, generar líneas de pez cebra mutante que consistentemente producen fenotipos severos permite estudios desarrollo aguas abajo como grabación Time-l....
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Protocolo
todos los experimentos descritos en este protocolo se completaron en conformidad y cumplimiento de la Universidad de Colorado y la Universidad de Oregon institucional Animal Care y comités del uso (IACUC).
1. preparación de la población no seleccionados a partir de
- identificar portadores heterocigotos del alelo del mutante de interés por fin clip 11 y genotipado de un stock de animales hermano completo por el método de elección, tales como KASP 12 , 13 , 14. Este protocolo fue realizado con la cepa de pez ceb....
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Resultados
Este protocolo es una técnica de agricultura a largo plazo útil para mutantes esqueleto de pez cebra de comprensión (figura 1). La cría selectiva por pruebas de progenie debe generar un cambio en penetrancia total hacia abajo y hacia arriba en unas pocas generaciones (figura 2). En nuestro trabajo anterior, dos rondas de cría selectiva condujeron la penetrancia media hacia abajo de 17% a 3%1. Del mismo mod.......
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Discusión
Cría selectiva presenta sutilezas de funciones de los genes
Cambio de fenotipos mutantes para ser más o menos graves mediante la cría selectiva es una forma sencilla para obtener nuevos conocimientos sobre funciones de los genes. En comparación con los métodos estándar de cría seleccionada, el protocolo que presentamos puede producir una comprensión mucho más completa de los fenotipos mutantes. Específicamente, mediante la generación de cepas que son graves, puede ser revelada.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Nos gustaría agradecer a Chuck Kimmel para la dirección, John Dowd para ayuda en el desarrollo de esta estrategia de mejoramiento, Macie Walker por su trabajo en el perfeccionamiento de la mancha esquelética y Charline Walker y Bonnie Ullmann pez cebra útiles consejos. Este trabajo fue apoyado por DE024190 K99/R00 a JTN.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Paraformaldehído, granulado, sólido | Ted Pella Co. | 18501 | PFA granulado es una alternativa más segura al PFA en polvo |
| Cloruro de magnesio, sólido | Acros Organics | ||
| 10x PBS, acuoso | Fisher | BP3994 | |
| 190 prueba Etanol | |||
| azul alciano, sólido | Anatech Ltd. | 867 | Debe ser de Anatech |
| Alizarin Red, sólido | Sigma | A5533-25G | |
| Glicerol, líquido | Fisher | BP229 1 | |
| Peróxido de hidrógeno, líquido | Fisher | BP263500 | |
| Hidróxido de potasio, sólido | Fisher | P250 500 | |
| StepOnePlus Máquina de PCR en tiempo real | Applied Biosystems | ||
| Placa de reacción óptica rápida MicroAmp de 96 pocillos con código de barras (0,1 ml) | Applied Biosystems | 4346906 | |
| Sello 'B' BioRad | MSB1001 | ||
| KASP Master Mix, High ROX | LGC | KBS-1016-022 | |
| https://www.lgcgroup.com/products/kasp-genotyping-chemistry/#.WOPX41UrKUk KASP By Design Primer Mix | LGC KBS-2100-100 | ||
| Tris HCl, sólido | Fisher | BP153 500 | |
| cloruro de potasio, sólido | Fisher | BP366 500 | |
| Tween-20, líquido | Fisher | BP337 100 | |
| Nonidet P40 | ThermoFisher | 28324 | |
| Tricaine-S | Western Chemicals | ||
| Proteinasa K | Fisher | BP1700 100 | |
| T100 Termociclador | BioRad | 1861096 | |
| Gota Controlada Pasteur Pipets | Fisher | 13-678-30 | |
| Nanodrop | ThermoFisher | para la cuantificación de ADN |
Referencias
- Nichols, J. T., et al. Ligament versus bone cell identity in the zebrafish hyoid skeleton is regulated by mef2ca. Development. 143 (23), 4430-4440 (2016).
- Sheehan-Rooney, K., Swartz, M. E., Zhao, F., Liu, D., Eberhart, J. K.
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