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Artículo de método

Cambio de penetrancia mutante esquelética letal de pez cebra por prueba de progenie

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DOI:

10.3791/56200

⸱

1 de septiembre de 2017

 , 
1Department of Craniofacial Biology, University of Colorado Anschutz Medical Campus

En este artículo

Resumen

El objetivo de este protocolo es modificar la penetrancia de fenotipos mutantes esqueléticos letal en el pez cebra por cría selectiva. Mutantes letales no pueden cultivarse a la edad adulta y crían ellos mismos, por lo tanto este protocolo describe un método de seguimiento y selección de penetración a través de múltiples generaciones por prueba de progenie.

Resumen

Pez cebra mutantes fenotipos son a menudo incompleto penetrantes, que se manifiesta sólo en algunas mutantes. Fenotipos interesantes que aparecen sistemáticamente pueden ser difíciles de estudiar y pueden conducir a la confusión de resultados. El protocolo descrito aquí es un paradigma de reproducción directa para aumentar y disminuir la penetrancia en mutantes esquelética letal pez cebra. Porque mutantes letales no pueden ser criados selectivamente directamente, se emplea la estrategia clásica cría selectiva de prueba de progenie. Este método también incluye protocolos para el pez cebra de Genotipado de Kompetitive alelo específico PCR (KASP) y coloración de larvas de pez cebra cartílago y hueso. Aplicación de la estrategia de cría descrita aquí puede aumentar la penetración de un fenotipo esquelético interesante que permite resultados más reproducibles en aplicaciones posteriores. Además, disminuye la penetrancia mutante a través de esta estrategia de cría selectiva puede revelar los procesos del desarrollo que requieren más crucial la función del gen mutado. Mientras que el esqueleto se considera específicamente aquí, proponemos que esta metodología sea útil para todas las líneas de pez cebra mutante.

Introducción

El pez cebra es un sistema potente para comprender el desarrollo del esqueleto. Variedades de pez cebra mutante, biólogos descifrar funciones de los genes durante la skeletogenesis. Sin embargo, pueden presentar fenotipos mutantes esqueleto de pez cebra con penetrance variable1,2,3,4 que puede dificultar el análisis del desarrollo y genéticos. El propósito de este método es triple. En primer lugar, generar líneas de pez cebra mutante que consistentemente producen fenotipos severos permite estudios desarrollo aguas abajo como grabación Time-lapse y transplante de5 6. Este tipo de estudios puede paralizado al intentar estudiar fenotipos que sólo manifiestan constantemente. En segundo lugar, endogamia cepas de pez cebra puede disminuir la variación genética, fomentando así la reproducibilidad y consistencia experimental. Por ejemplo, todos en situ el análisis de hibridación en una cepa consanguínea selectivamente pueden reducir variabilidad confusión y reforzar conclusiones. En tercer lugar, generando severas y suaves cepas revelará toda la serie fenotípica que puede resultar de una mutación particular.

A primera vista, parece imposible la cría selectiva de los mutantes letales. ¿Cómo puede una raza de penetrancia cuando los animales que se anotaron para la selección están muertos? Afortunadamente, los métodos para la cría selectiva por selección de familia, específicamente la progenie pruebas, han demostrado eficacia en ganadería programas muchos años7,8. Estos programas se utilizan principalmente para la cría selectiva para caracteres que sólo están presentes en uno de los sexos, como la producción de leche en vacas o producción de huevos en gallinas. Los machos de estas especies no se anotó directamente, pero su progenie se anotó y luego se asigna un valor a los padres. Préstamos de esta estrategia, el protocolo presentado aquí consiste en anotar la descendencia mutante fija y teñida de un par de peces cebra que son heterocigotos para un gen mutante de interés. La penetrancia de un fenotipo en la descendencia mutante letal homocigótica se asigna a los padres al decidir que los individuos producen la próxima generación en la línea. Encontramos que este método es un medio eficaz de cambio de penetrancia en el pez cebra mutantes esquelética letal1.

Similar a otros estudios, este protocolo de cría selectiva toma bajo criterios de consideración como tamaño de la nidada, supervivencia de crías, desarrollo normal de los embriones y relación de sexo9. Sin embargo, estos factores se consideran en el contexto de un fondo de mutantes con el objetivo de desplazar la penetrancia mutante. Por lo tanto, este protocolo extiende anteriores paradigmas de crianza selectiva, ofreciendo un método para reforzar análisis mutantes del desarrollo así como aumentar la homogeneidad de fondo.

Este protocolo requiere extenso genotipado, así que es importante desarrollar un protocolo de genotipado fiable y rápida de antemano. Hay muchos protocolos de genotipado disponible10,11, sin embargo encontramos el KASP genotyping12,13,14 más rápido, es más coste eficiente y más confiable que los métodos basada en el clivaje enzimático de la restricción de secuencias amplificadas10. Por lo tanto, incluimos un protocolo KASP en este trabajo. Además, nos centramos en esqueléticos fenotipos mutantes en este protocolo e incluyen un procedimiento de Alcian azul/alizarina rojo tinción modificada de protocolos anteriores15.

El método descrito aquí es una estrategia sencilla para cambio de penetrancia mutante letal hacia arriba o hacia abajo. Si bien este protocolo se centra en esqueléticos fenotipos mutantes, creemos será una estrategia útil para la cría de todas las líneas de pez cebra mutante. De hecho, la utilidad de esta estrategia de cría probable se extiende más allá de pez cebra. Predecimos que este protocolo puede ser modificado para cambiar la penetración en una amplia gama de organismos. Cambio mortal penetrancia por pruebas de progenie puede ayudar a impulsar el progreso de cualquier genetista del desarrollo.

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Protocolo

todos los experimentos descritos en este protocolo se completaron en conformidad y cumplimiento de la Universidad de Colorado y la Universidad de Oregon institucional Animal Care y comités del uso (IACUC).

1. preparación de la población no seleccionados a partir de

  1. identificar portadores heterocigotos del alelo del mutante de interés por fin clip 11 y genotipado de un stock de animales hermano completo por el método de elección, tales como KASP 12 , 13 , 14. Este protocolo fue realizado con la cepa de pez cebra mef2ca b1086.
  2. Genotyping KASP
    Nota: Los iniciadores específicos de alelo de KASP están diseñados por la empresa que proporciona los reactivos (véase Tabla de materiales). Para obtener la concentración adecuada de 6-carboxilo-X-rodamina (ROX) tinte para la máquina específica de PCR en tiempo real visite el sitio web de la empresa.
    1. Lugar del tejido de la cola de pez cebra en 50 μl de tampón de lisis (10 mM tris (pH 8,3), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl 2, 0.3% de tensioactivo no iónico, 0.3% Octylpheny-polietilenglicol). Añadir 10 μl de proteinasa K 10 mg/mL por pocillo de una placa de PCR de 96 pocillos y digerir en un termociclador a 55 ° C para 2-5 h seguido por una etapa de inactivación de 94 ° C 20 minutos. Refrigerar el producto de la lisis después digestión.
      Nota: productos de lisis se pueden utilizar con éxito durante varios meses después de la preparación. Cuando tejido fue lisado usando 50 mM NaOH, las reacciones de KASP eran fracasadas. Estos resultados sugieren que el método de NaOH de la preparación de ADN genómico no es compatible con KASP.
    2. Cuantificar el DNA genomic usando un espectrofotómetro. Diluir la plantilla de la DNA genomic usando agua de grado biología molecular, para que cada reacción contiene aproximadamente 20-30 ng.
      Nota: Cuantificar las muestras de 4 o 5, de la piscina les y preparar diluciones de las muestras basadas en el promedio. Cuando se utiliza este protocolo para el tejido adulto de la cola, una dilución 1: 100 es a menudo suficiente. No se requiere la cuantificación precisa de la concentración de ADN de.
    3. Agregar 0.14 μl del primer KASP mezcla y 5 μl del master de KASP mezcle por muestra en el hielo en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y mezcle bien antes de centrifugar brevemente para recoger contenidos en la parte inferior del tubo de.
      Nota: Mix master KASP es calor luz sensible, guarde la acción en el hielo y evitar la luz directa.
    4. Pipeta de 5 μl del primer master mix solución en los pocillos de una placa PCR 96 pocillos óptico apto para la máquina PCR en tiempo real se utiliza.
    5. Pipeta de 5 μl del diluido (aproximadamente 5-7 ng/μL) muestras de la plantilla de ADN en cada bien y aspirar cuidadosamente con una pipeta mezclar.
    6. Añadir 5 μl de agua libre de nucleasa para 3 pozos para servir como plantilla de no controles (NTC) y añadir 5 μl del diluido confirmado homocigótica salvaje tipo, plantilla de ADN mutante heterozigótica y homocigótica para los controles positivos de.
    7. Colocar un film ópticamente claro sello sobre la placa asegurando que la película es completamente sellada en cada pocillo.
    8. Brevemente centrifugar la placa a 600 x g para recoger el contenido en la parte inferior y quitar burbujas de la mezcla de.
      Nota: Mantenga la placa de hielo y el escudo de la luz hasta que esté listo para proceder.
    9. Utilizar el programa de ciclismo se muestra en la tabla 1 para realizar la principal reacción de KASP.
    10. Ver el diagrama de dispersión resultante producido por el equipo de análisis. Una reacción exitosa mostrará 4 distintas agrupaciones de puntos en el diagrama ( figura 3): tres agrupaciones correspondientes a genotipo y una agrupación de los NTCs cerca el origen de la muestra. Los controles positivos deben segregar con la agrupación de la muestra apropiado.
    11. Si el programa no reconoce la trama de la agrupaciones como correspondientes a genotipos específicos, ciclismo conjuntos adicionales pueden ser necesaria (tabla 2). Repita el programa adicional hasta que el ordenador reconoce grupos apretados por genotipo.
    12. Exportar los resultados de genotipificación en un archivo de hoja de cálculo para facilitar su análisis y uso.
  3. Casa de los animales heterocigotos identificados juntos en el sistema principal de agua.

2. la primera ronda de progenie puntuación

  1. Cruz pares heterocigotos hermano
    1. después de que los animales recuperan del clip de aleta, de configurar pares intercrosses. Uso de separadores para los embriones son síncronos 16.
    2. Recoger los embriones y mantener a los padres pares aislados en jaulas de cría.
    3. Monitorear adultos aislados para que los peces agresivos pueden quedar separados o con cubierta (pescado triturado redes de trabajo muy bien). Peces deben ser alimentados y el agua cambiado siguiendo las directrices IACUC en aguas estáticas.
  2. Embriones cría
    1. etapa y los embriones de pez cebra a larvas bajo condiciones estándar 17.
    2. Recoger animales fenotípicamente normal con una pipeta de vidrio en día 5 o 6 cuando se infla la vejiga natatoria en el 75% del embrague. Colocar tipos silvestres fenotípicos en el vivero de grabación de que los padres les rindió.
      Nota: Con alelos mutantes son recesivos letales, lo cual es cierto de muchos mutantes esqueléticos, mutantes homocigóticos no forma vejigas natatorias 18 , 19. Por lo tanto, tipos silvestres fenotípicos se puede discernir fácilmente desde sus hermanos de mutante basadas en infladas vejigas natatorias.
  3. Alcian azul/alizarina rojo cartílago y hueso tinción
    1. anestesiar las larvas que no inflan sus vejigas natatorias con Metanosulfonato de 0,17 g/L-S en el medio de embriones. Recoger animales en tubos de microcentrífuga de 1,5 mL con una copa ancha pipeta Pasteur. Agregar no más de 100 larvas por tubo de.
    2. Quite agua de embrión de cada tubo y animales en 1 mL de paraformaldehído al 2% en PBS 1 x por el tubo.
      PRECAUCIÓN: PFA acuosa es combustible y causa grave irritación de la piel y los ojos. Usar equipo de protección personal como guantes y protección para los ojos y lávese bien las manos después del uso.
    3. De roca para 1 h; fijación más deteriora ósea tinción. Compruebe los tubos regularmente durante esta y las posteriores medidas oscilantes para no larvas se hayan pegado al lado o aglutinadas en la parte inferior del tubo de.
    4. Quite el fijador de tubos utilizando una pipeta de vidrio, agregar 1 mL de etanol al 50% y el rock durante 10 minutos
    5. Preparar fresco tinción solución añadiendo 20 μl de 0.5% premezcla de alizarina rojo por 1 mL de Alcian (0,04% de Azul Alciano/10 mM MgCl 2 / etanol 80%). Quitar 50% de etanol, agregar 1 mL de solución de cada tubo, y la coloración durante la noche. Las larvas pueden permanecer en la mancha hasta 5 días.
    6. Quitar la solución de tinción de los tubos y añadir 1 mL de etanol/10 mM MgCl 2 solución de 80% a cada tubo. Rock los tubos durante al menos 1 h; enjuague durante la noche puede producir una tinción de Azul Alciano más clara.
    7. Extraiga el 80% etanol/10 mM MgCl 2 solución de los tubos y agregar 1 mL de etanol al 50%; roca por 5 min
    8. Retirar la solución de etanol 50% de los tubos y agregar 1 mL de etanol al 25% y roca por 5 min
    9. Quitar la solución de etanol 50% de los tubos y agregue 1 mL preparado 3% H 2 O 2 /0.5% Solución decolorante de KOH. Deja el abierto de tapas y deje que los tubos de soporte un bastidor de tubo de micro durante aproximadamente 10 minutos o hasta que se aprecia una tenue coloración marrón en la parte superior de la solución.
      Nota: Una capa de forma de las burbujas encima de la solución. Cuidado de tiempo es necesario en este paso, como sobre blanqueo resultará en una pobre tinción doble.
    10. Retirar la solución de blanqueador y agregue 1 mL de 25% glycerol/0.1% KOH; rock durante 10 min a 1 h.
    11. Retire solución KOH glycerol/0.1% al 25% de los tubos, añadir 1 mL de solución de KOH glycerol/0.1% de 50% a cada tubo, rock durante 10 minutos hasta toda la noche.
    12. 50% solución de KOH glycerol/0.1% Quite los tubos y otra vez añada solución de KOH glycerol/0.1% de 50% a cada tubo. Balanceo durante la noche le ayudará a eliminar las burbujas de aire que se acumulan dentro de las larvas. Tienda manchado esqueléticos preparados a 4 ° C cuando no se usa.
  4. Fenotipo puntuación
    1. puntuación manchado descendiente mutante de la penetrancia del fenotipo seleccionado. En Nichols et al. 1 mutantes fueron anotados por cualquier ocurrencia de hueso ectópico.
      Nota: Porque los padres de pez cebra en aguas estáticas y la mancha de rojo de alizarina puede desaparecer con el tiempo, es importante anotar los esqueletos dentro de unos días de terminar la preparación esquelética.
    2. Penetrancia es la proporción de un genotipo que tiene un fenotipo. Calcular el por ciento penetrance mediante la siguiente fórmula:
      % penetrancia = (mutantes con fenotipo) / (número total de mutantes) × 100

3. Selección familiar

  1. elige dos alto penetrance y dos familias de baja penetrancia para la próxima generación. Además de penetrancia, es importante considerar la fecundidad y vigor al elegir que las familias se propaguen; ver la discusión para más detalles sobre esto.
  2. Dar a cada pareja parental un identificador común sub: familia.01,.02, etc.
  3. Casa de los padres pares en el sistema principal con varios sexo mixto ' compañero ' peces. Peces del compañero pueden ser cualquier línea de pez cebra con características distintivas permanentes, obvios, como la estructura alterada de pigmentación o aleta.
    Nota: Mientras que muchos investigadores mantienen con éxito sólo pares en un tanque de cría, resultados favorables se observan por pares con varios peces de compañero de vivienda. Este paso opcional permite que parejas de animales en escuelas más grandes reproductoras y obtenido fácilmente por lo que pueden ser repetidamente cruzados según sea necesario. Los padres pares pueden ser cruzados varias veces para generar familias completo hermano; esperar al menos una semana antes de repetir cruzando el mismo par parental.
  4. Sacrificar las familias larvas de paso 2.2.2. que no fueron seleccionados para la próxima generación.
  5. Etiqueta los tanques que contienen las larvas de tipo salvaje hermano de familias seleccionadas con la penetración de sus hermanos de mutante y elevar a la edad adulta normal.
  6. La próxima generación tendrá al menos cuatro familias completo hermano, dos para la línea hacia arriba y dos para la línea hacia abajo.
  7. Cuando las larvas alcanzan la madurez sexual, repetir el protocolo a partir de primer paso con la nueva generación.

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Resultados

Este protocolo es una técnica de agricultura a largo plazo útil para mutantes esqueleto de pez cebra de comprensión (figura 1). La cría selectiva por pruebas de progenie debe generar un cambio en penetrancia total hacia abajo y hacia arriba en unas pocas generaciones (figura 2). En nuestro trabajo anterior, dos rondas de cría selectiva condujeron la penetrancia media hacia abajo de 17% a 3%1. Del mismo mod...

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Discusión

Cría selectiva presenta sutilezas de funciones de los genes

Cambio de fenotipos mutantes para ser más o menos graves mediante la cría selectiva es una forma sencilla para obtener nuevos conocimientos sobre funciones de los genes. En comparación con los métodos estándar de cría seleccionada, el protocolo que presentamos puede producir una comprensión mucho más completa de los fenotipos mutantes. Específicamente, mediante la generación de cepas que son graves, puede ser revelada...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Nos gustaría agradecer a Chuck Kimmel para la dirección, John Dowd para ayuda en el desarrollo de esta estrategia de mejoramiento, Macie Walker por su trabajo en el perfeccionamiento de la mancha esquelética y Charline Walker y Bonnie Ullmann pez cebra útiles consejos. Este trabajo fue apoyado por DE024190 K99/R00 a JTN.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Paraformaldehído, granulado, sólidoTed Pella Co.18501PFA granulado es una alternativa más segura al PFA en polvo
Cloruro de magnesio, sólidoAcros Organics
10x PBS, acuosoFisherBP3994
190 prueba Etanol
azul alciano, sólidoAnatech Ltd.867Debe ser de Anatech
Alizarin Red, sólidoSigmaA5533-25G
Glicerol, líquidoFisherBP229 1
Peróxido de hidrógeno, líquidoFisherBP263500
Hidróxido de potasio,   sólidoFisherP250 500
StepOnePlus Máquina de PCR en tiempo realApplied Biosystems
Placa de reacción óptica rápida MicroAmp de 96 pocillos con código de barras (0,1 ml)Applied Biosystems4346906
Sello 'B' BioRadMSB1001
KASP Master Mix, High ROXLGCKBS-1016-022
https://www.lgcgroup.com/products/kasp-genotyping-chemistry/#.WOPX41UrKUk KASP By Design Primer MixLGC KBS-2100-100
Tris HCl, sólidoFisherBP153 500
cloruro de potasio, sólidoFisherBP366 500
Tween-20, líquidoFisherBP337 100
Nonidet P40ThermoFisher28324
Tricaine-SWestern Chemicals
Proteinasa KFisherBP1700 100
T100 TermocicladorBioRad1861096
Gota Controlada Pasteur PipetsFisher13-678-30
NanodropThermoFisherpara la cuantificación de ADN
223210010

Referencias

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