Cuantificación de la Quimiotaxis de monocitos humanos In Vitro y linfocitos murinos, tráfico en Vivo

Inmunidad sólida requiere la compleja coordinación temporal y espacial de una gran variedad de tipos de la célula para responder adecuadamente a la lesión, la infección y generar autotolerancia. Se han descubierto varios receptores del chemokine docena y sus correspondientes ligandos y mecanismos moleculares que caracterizado por que las células específicas pueden dirigirse en un tejido específico en un momento específico. Así, estudiar la quimiotaxis y migración es un componente indispensable de la investigación de la inmunología. De hecho, el ensayo descrito en vitro recientemente fue utilizado como una herramienta de detección para identificar quimiotáctico cofactor que acelera el quimiotactismo de las células T hacia C-C quimiocinas 19 y 21³. El propósito de los métodos descritos aquí son permitir evaluaciones cuantitativas de la Quimiotaxis de células inmunitarias en vitro y en vivo.

El análisis de la cámara de Boyden (migración celular e invasión) es un método rápido, barato y reproducible para evaluar la migración de la célula^4,5. En el ensayo estándar, la cámara superior es sembrada con células y está separada por una inserción porosa de una cámara inferior, en el cual las células migran. En el tiempo deseado, las células que han emigrado a la parte inferior de la inserción pueden ser fijo y manchadas para cuantificación por microscopia ligera. Sin embargo, estas mediciones restringen la recopilación de datos para un único punto de la final, que excluye la recolección de datos dinámica y pueden requerir extensa optimización para determinar el momento óptimo para el análisis. Aquí, se describen varias adaptaciones que permiten mediciones en tiempo real, cuantitativas y multiplexadas de quimiotaxis en vitro.

Estudios en vivo , se utiliza un punto funcional, es decir, la acumulación específica de células en un compartimento determinado tejido. Células de un donante previamente etiquetados se introducen animales receptores a través de transferencia adoptiva. Estas células del donante pueden identificarse posteriormente mediante citometría de flujo después de la cosecha de tejido receptor. También es una estrategia Co etiquetada que permite la determinación del tráfico de diferentes tipos de células dentro de un solo animal receptor. Este método elimina la variación entre animal de la inyección de células y representa la variabilidad entre animales fisiológica.

todos los procedimientos fueron aprobados por la Universidad de Rockefeller ' s cuidado de Animal institucional y Comité de uso. Todos los animales fueron alojados en condiciones libres de patógenos específicas.

1. quimiotaxis In Vitro

1. cultura THP-1 células ⁶ en Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) suplementado con 10% suero bovino fetal (FBS) y 4-(2-hidroxietil) -1- ácido-1-ácido (HEPES; 25 mM) (completar los medios), mantener la densidad entre 0.5-1.0 x 10 ⁶ células/mL.
2. Cultivo de células en un 35 mm plato, etiqueta 3.5 x 10 ⁵ THP-1 de células por condición con calceína acetoxymethyl (calceína-AM; 2.5 μm) u otro colorante fluorescente adecuado en medios completo a 37 ° C durante 30 minutos
   Nota: Tintes deben ser compatible con el etiquetado de células vivas y permeable a la membrana celular.
3. Pre-caliente un lector de placas a 37 ° C.
   Nota: Además del control de temperatura, funcionalidad de lectura de la parte inferior también es necesario. Ver paso 1.10.2 para una alternativa a un lector de placas para la cuantificación de la migración de las células.
4. Mientras que las células son etiquetas, preparar la placa de ensayo y la cámara baja. Placa de
   1. uso un cultivo de tejido de 24 pozos, con una condición por pozo. Realizar cada condición por triplicado.
   2. Añadir 750 μl de Hank ' s solución salina tamponada (HBSS) tamponado con 25 mM HEPES y 0,1% de seroalbúmina bovina (BSA) para la placa de 24 pocillos. Esto sirve como la condición basal de control.
      1. Uso otros pozos para las condiciones de comparación, manteniendo siempre el volumen total en la cámara inferior en 750 μl.
         Nota: En este ejemplo, humano monocito chemoattractant protein-1 (MCP-1) sirve como control positivo para quimiotaxis ⁷.
         1. Montar la mezcla de reactivo HBSS con 25 mM HEPES, BSA (0.1%) y MCP-1 (75 ng/mL). Utilizar suero bovino adulto (2,7% v / v) con MCP-1 como un control positivo adicional.
            Nota: Concentración de Chemokine y chemokine dependerá el eje quimiotáctico bajo estudio. Liofilizado de MCP-1 se resuspendió en agua destilada con BSA (0,1%) para hacer una solución con una concentración final de 50 μg/mL. Esto se puede diluir en agua a una solución de trabajo de 10 μg/mL. Añadir 5.6 μL de esta solución a la cámara baja.
   3. Una vez finalizada la composición de las cámaras inferiores, coloque una pieza porosa en cada pocillo, asegurando que alineen las lengüetas del inserto con las muescas de la placa.
      Nota: Elija el tamaño de poro adecuado para los insertos. Para monocitos y linfocitos, realiza bien un tamaño de poro de 3 μm. Algunos tipos de células o sistemas de chemokine pueden requerir una superficie revestida de matriz para la migración óptima. Por ejemplo, para la medición de la Quimiotaxis de monocitos THP-1 hacia la MCP-1, fibronectina o insertos recubiertos de colágeno se recomiendan. Para el lector de placas para la cuantificación, el inserto debe tener una capa luz impermeant, tales como tereftalato de polietileno, para evitar la detección de no-migrar las células en la parte superior del compartimiento ⁸.
5. Después de incubar las células por 30 min con calceína-AM, transferir la suspensión celular a un tubo cónico de 15mL. Centrifugar las células a 1.000 x g durante 2 minutos inspección visualmente las células para confirmar la absorción de calceína-AM ( figura 1).
6. Retire con cuidado el sobrenadante utilizando un aspirador de vacío. Lavar las células etiquetadas en 1640 RPMI sin suero suplementado con HEPES 25 mM. Centrifugar las células a 1.000 x g durante 2 min y descarte el sobrenadante.
Resuspender las células en suero RPMI 1640 suplementado con HEPES 25 mM
7. . Contar las células y ajustar el volumen para que las células están en una concentración final de 1.0-1.5 x 10 ⁶ células/mL.
8. Suministrar 250 μL de la suspensión de células en el inserto (cámara alta).
9. Después de las cámaras superiores se han llenado, suavemente Levante la placa e inspección la parte inferior la presencia de burbujas de aire que pueden interferir con la detección y la migración. Para quitar una burbuja, primero prueba a quitar entonces reposicionar el inserto. Si no lo consigue, use una aguja de 27 G a pinchar la burbuja y luego vuelva a colocar el inserto.
10. Coloque la placa en el lector de la placa con 37 ° C.
    1. Adquirir lecturas de fluorescencia desde el fondo a intervalos de 1-3 min. Cuando se utiliza calceína-AM, establece la fluorescencia longitudes de onda de excitación y emisión a 485 nm y 520 nm, respectivamente. Dependiendo del sistema de la tipo y quimioquinas de la célula, chemotaxis ocurre típicamente durante 1-4 h ( figura 2A).
    2. Como una alternativa a las mediciones continuas utilizando un lector de placas, imagen los pozos utilizando un microscopio fluorescente invertido ( figura 2B) capaz de excitación y detección de la luz a 485 nm y 520 nm, respectivamente. Usar una ampliación baja para capturar a la mayoría de la parte inferior de la inserción. Cuantificar las células mediante el procesamiento de imágenes ImageJ o software similar ⁹.

2. La transferencia adoptiva de linfocitos murinos

1. preparación de células de donante
   1. Anesthetize semana 8-12-viejos ratones C57BL/6J donante masculino usando un vaporizador de la anestesia isoflurano (1-3%). Confirmar la adecuada profundidad de la anestesia del dedo del pie-pizca.
   2. Colocar el ratón en la posición supina. Haga una incisión de línea media con un bisturí y localizar el bazo en el espacio peritoneal izquierdo superior. Suprimir el bazo entero y coloque en medio completo (RPMI suplementado con 10% FBS y 25 mM HEPES; 1 bazo mL) en hielo. Eutanasia a animales anestesiados donantes por degollación.
   3. Moler tejidos bazo suavemente a través de malla de nylon de 40 μm en medios completo (/spleen de 1 mL) con el extremo de un émbolo de la jeringa para hacer una suspensión unicelular y transferencia a un tubo cónico de 15 mL.
   4. Añadir 4 volúmenes de cloruro de amonio lisis de potasio (ACK) de búfer e incubar 5 min a temperatura ambiente para lisar eritrocitos.
   5. Centrifugar las células a 1.000 x g durante 2 min a temperatura ambiente y descartar el sobrenadante. Si los eritrocitos permanecen en el sedimento, resuspender en tampón de lisis ACK, incubar 5 min a temperatura ambiente, centrifugar las células a 1.000 x g durante 2 min y descartar el sobrenadante.
   6. Resuspender las células en medios de comunicación completa en una concentración de 2-5 x 10 ⁷ células/mL, luego cuele la suspensión de células a través de una malla de nylon de 40 μm para eliminar restos de células.
   7. Etiqueta de 1 x 10 ⁷ ratón de células/receptor con un colorante fluorescente compatible con vive las células y que se mantendrá con fijación posterior, como 5-chloromethylfluorescein diacetato (concentración final 2 μM) ¹⁰ . Incubar a 37 ° C por 30 minutos
      Nota: Para el seguimiento de más de una población celular, utilizar otros tintes fluorescentes con poblaciones celulares adicionales. Visualizador, una porción de células del donante puede ser etiquetada con 5-(and-6)-(((4-chloromethyl) benzoilo) amino) tetramethylrhodamine (concentración final 2 μM) ¹¹.
   8. 4 añadir volúmenes HBSS complementado con 25 mM HEPES, luego centrifugar a 1.000 x g durante 2 minutos y descartar sobrenadante. Resuspender el precipitado en HBSS suplementado con HEPES 25 mM para una concentración final de 1 x 10 ⁸ células/mL.
      1. Si utiliza más de un colorante fluorescente, mantener poblaciones celulares separadas hasta inmediatamente antes de la inyección.
      2. Transferir una pequeña alícuota (10 μL) de las células de cada color en una solución fijadora (1 mL) para compensación de citometría de flujo posterior.
2. Transferencia de linfocitos
   1. anestesiar 8-12 semanas-ratones viejo receptoras de machos C57BL/6J con isoflurano (1-3%) usando un vaporizador; confirmar la profundidad de la anestesia del dedo del pie-pizca. Aplique ungüento veterinario animal ' ojos s para prevenir la resequedad.
   2. Brevemente las células donantes de vortex (1 s) y la transferencia a la jeringa de inyección de 1 mL 27 g, 0,5 en aguja, combinando poblaciones de células marcadas diferencialmente, en su caso.
      1. Transferir una pequeña alícuota (10 μL) de las células mixtas con una solución fijadora (1 mL) para los análisis de citometría de flujo posterior.
   3. Lugar animales donadores en la posición propensa. Aplicar presión caudal suave sobre la piel dorsal a la vista, haciendo que el globo ocular sobresale un poco.
   4. Dirigir la aguja medialmente e inyectar 100 μl de suspensión de la célula donante retro-orbitally cada ratón receptor. Las células también pueden ser inyectadas a través de la vena de la cola.
   5. Poco a poco retirar la aguja de inyección y mouse solo en una jaula de recuperación. Animal del monitor hasta que ha recuperado la conciencia; una vez totalmente recuperado retorno del animal a la vivienda social.
3. Recogida y análisis de
   1. después de 1 h, anestesiar ratones receptores con anestesia isoflurano (1-3%) utilizando un vaporizador, confirmar la profundidad de la anestesia del dedo del pie-pizca. El bazo (u otro tejido de interés) de la cosecha (paso 2.1.2.) de cada lugar en medios completo (1 mL/destinatario) y ratón receptor. Eutanasia a animales anestesiados por degollación.
      Nota: Intervalos más largos antes de la cosecha de tejido aumentará la acumulación del tejido a través de al menos 24 h.
   2. Moler tejidos bazo suavemente a través de malla de nylon de 40 μm en completa comunicación con el extremo de un émbolo de la jeringa para hacer una suspensión unicelular y transferencia a tubo cónico de 15 mL.
   3. 4 añadir volúmenes de lisis ACK del almacenador intermediario e incuban 5 min a temperatura ambiente. Centrifugue la suspensión de células a 1.000 x g durante 2 min a temperatura ambiente y descartar el sobrenadante.
   4. Resuspenda cuidadosamente los eritrocitos de la tinción buffer (tampón fosfato salino suplementado con 1% FBS). Contar las células y ajustar a una concentración final de 3 x 10 ⁷ células/mL. Transferir 100 μl de la suspensión celular a un pozo 96 placa inferior redondo.
   5. Tinción de células para marcadores deseadas (véase tabla de materiales) para el análisis por citometría de flujo. Añadir anticuerpos conjugados fluoróforo (véase la tabla de materiales) contra los marcadores deseados e incubar a 4 ° C por 20 min en la oscuridad. Añada 100 μl tampón de tinción, centrifugar las células a 1.000 x g durante 3 min y descarte el sobrenadante.
   6. Resuspender el pellet en 200 μL tampón de tinción, centrifugar las células a 1.000 x g durante 3 min y descarte el sobrenadante.
   7. Resuspender el pellet en la tinción de 125 μl tampón y adquirir muestras utilizando un citómetro de flujo utilizando procedimientos estándar de.
      Nota: El tinte verde es excitado por un láser 488 y la emisión se detecta con los filtros dicroicos 505 y 530/30. El tinte anaranjado es excitado por un 561 nm y la emisión se detecta por un filtro dicroico 582/15.
      1. Uso salvo las células de 2.1.8.2 para compensar cada colorante fluorescente.
         Nota: Utilizando compensación de grano con fluoróforos que empareja la excitación y espectros de emisión de los tintes Etiquetadoras dará lugar a indemnización subóptima.
      2. Utilizar las células entradas guardadas desde el paso 2.2.2.1 para determinar con precisión la relación de marcado diferencialmente células de entrada si utiliza más de una población marcada ( figura 3). Calcular la migración específica de tejido basada en la relación de etiquetado a las células sin etiqueta ( figura 4).

Cuando se usa tinte de calceína-AM, inspección visual de las células confirmará absorción de etiqueta (figura 1). Lecturas de fluorescentes automatizadas seguimiento migración como tránsito de las células en la parte inferior del parte movible en el tiempo. Estos datos muestran claramente una inducción de la migración celular hacia la MCP-1, así como un aumento de esta respuesta por el suero (figura 2A). Dependiendo de la fuerza del estímulo migratorio, hay un desfase de al menos 15 minutos antes de un aumento en la señal. La señal fluorescente puede máximo y luego disminuir gradualmente. Esto representa una disminución neta en el número de células adheridas a la parte inferior de la inserción como células pasan en solución en la cámara baja a un ritmo más rápido que el de las células que migran desde la cámara superior. Estímulos migratorios más fuertes suelen provocar una) inicio anterior de un aumento en los valores de fluorescencia; b) rapidez de aumento de fluorescencia; y c) los valores de fluorescencia de pico más altos. Representante de imágenes obtenidas por microscopía de fluorescencia invertido también se muestran (figura 2B), con la cuantificación de los recuentos de células (figura 2).

En vivo estudios utilizando más de una etiqueta fluorescente, es importante cuantificar la proporción relativa de poblaciones celulares en el material de entrada. Esto explica la variación en la mezcla de poblaciones de la célula para la inyección (figura 3). En este caso, la relación de las células de verde y naranja fluorescente fue 0.97:1. Por lo tanto, para tener en cuenta este desequilibrio leve, verde fluorescente recuento estaban dividido por 0.97 para indexar sus números en proporción el material de entrada. Después de cuantificar las células marcadas por citometría de flujo, tráfico puede cuantificarse la cantidad de células marcadas recuperados dividido por el número total de células recuperadas.

Estos resultados demuestran la ventaja de usar la estrategia de doble color, que elimina el efecto de la eficacia de inyección variable; Aunque hay variación considerable de las células recuperadas entre animales, para cualquier animal dado que la proporción de células fluorescentes verde a naranja fluorescente es aproximadamente igual a (figura 4). Se espera que estos resultados, como la célula dos poblaciones fueron tratadas idénticamente, pero varias perturbaciones se pueden probar su efecto en homing de linfocitos. Desviación de la línea de identidad indicaría diferentes capacidades migratorias de las poblaciones celulares específicas. Además, varios subconjuntos de la célula se pueden determinar por la coloración de las células recuperadas para las proteínas deseadas. Aquí, las células T, indicadas por la coloración del CD3 y células B, indicadas por la coloración de CD19 también se recuperan con iguales proporciones de células de verde a naranja fluorescente.

Figura 1: la célula etiquetado. Inspección visual de la pelotilla de la célula después de etiquetar confirma la adecuada absorción de la tintura fluorescente (izquierda), en contraste con antes de etiquetado (derecha). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Cuantificación de en vitro la migración. (A) datos representativos (media ± error de estándar) en tiempo real desde un lector de placas de comparar las 3 condiciones: medios (control), quimioquinas (MCP-1, 75 ng/mL) o chemokine con suero (MCP-1, 75 ng/mL y bovino suero, 2.7% v/v en búfer). Las lecturas fueron adquiridas por la parte inferior de la placa cada 3 minutos con una longitud de onda de excitación de 485 nm y detección de onda de 520 nm. Micrografías representativas (B) de 4 X aumento de la parte inferior del parte movible en 1 h, que permite la visualización directa de la migración de las células. Barras de escala = 500 μm (amarillo). (C) la cuantificación del número de células por campo de baja potencia (LPF; 4 X) usando el software ImageJ. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: teñido de células entradas. Parcela de citometría de flujo mostrando la relación entre los dos diferenciales había manchada poblaciones de células en la entrada de la célula inyectada de paso 2.2.2.1. La relación determinada a partir de esta trama sirve para corregir la varianza introducida durante la mezcla inicial de las dos poblaciones y se utiliza para ajustar las cuentas de célula durante el análisis de datos downstream. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: relación de células marcadas se recuperó de bazos de receptores animales. Las proporciones de células fluorescentes verde o naranja fluorescente se presentan como un porcentaje de los esplenocitos recuperados total, con cada punto de datos que representan un solo animal receptor. El total marcado las células son muestra (triángulo), así como los subconjuntos que también mancharon el positivos para los marcadores de superficie celular CD19 (cuadrado) o CD3 (círculo). Línea de trazos es la línea de identidad donde la relación entre los colores es igual a 1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los autores no tienen nada que revelar