Cuantificación de la Quimiotaxis de monocitos humanos In Vitro y linfocitos murinos, tráfico en Vivo

Resumen

Protocolos para la evaluación cuantitativa de la migración y Quimiotaxis de linfocitos son herramientas importantes para la investigación de la inmunología. Aquí, se describe un protocolo en vitro que permite en tiempo real, multiplexado evaluación de migración celular, así como un complementario en vivo técnica que permite seguimiento de células nativas del bazo.

Resumen

Quimiotaxis es la migración a lo largo de un gradiente químico específico¹. Quimiocinas son citocinas quimiotácticas que promueven el tráfico celular con especificidad anatómica y temporal². Chemotaxis es una función crítica de los linfocitos y otras células inmunes que pueden ser cuantitativamente evaluaron in vitro. Este manuscrito describe métodos que permiten la evaluación de la quimiotaxis, en vitro y en vivo, para tipos de diversas células incluyendo líneas celulares y células nativas. El en vitro, formato basado en la placa permite la comparación de varias condiciones simultáneamente en tiempo real y puede terminar dentro de 1-4 h. In vitro ensayo condiciones pueden manipularse para introducir agonistas y antagonistas, como así como diferenciarse quimiotaxis chemokinesis, que es el movimiento al azar. En vivo tráfico evaluaciones, las células inmunes pueden ser marcadas con colorantes fluorescentes múltiples y utilizan para la transferencia adoptiva. El etiquetado diferencial de células permite que las poblaciones de mezclado de la célula se introduce en el mismo animal, lo que disminuye la varianza y reducir el número de animales requeridos para un experimento estadístico adecuado. Migración en el tejido linfoide ocurre en tan poco como 1 h, y múltiples compartimentos de tejido pueden ser muestreados. Citometría de flujo después de la cosecha de tejido permite un análisis rápido y cuantitativo de los patrones migratorios de múltiples tipos de células.

Introducción

Inmunidad sólida requiere la compleja coordinación temporal y espacial de una gran variedad de tipos de la célula para responder adecuadamente a la lesión, la infección y generar autotolerancia. Se han descubierto varios receptores del chemokine docena y sus correspondientes ligandos y mecanismos moleculares que caracterizado por que las células específicas pueden dirigirse en un tejido específico en un momento específico. Así, estudiar la quimiotaxis y migración es un componente indispensable de la investigación de la inmunología. De hecho, el ensayo descrito en vitro recientemente fue utilizado como una herramienta de detección para identificar quimiotáctic....

Protocolo

todos los procedimientos fueron aprobados por la Universidad de Rockefeller ' s cuidado de Animal institucional y Comité de uso. Todos los animales fueron alojados en condiciones libres de patógenos específicas.

1. quimiotaxis In Vitro

1. cultura THP-1 células ⁶ en Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) suplementado con 10% suero bovino fetal (FBS) y 4-(2-hidroxietil) -1- ácido-1-ácido (HEPES; 25 mM) (completar los medios), mantener la densidad entre 0.5-1.0 x 10 ⁶ células/mL.
2. Cultivo de células en un 35 mm plato, etiqueta 3.5 x 10 ⁵ THP-1 de células po....

Resultados

Cuando se usa tinte de calceína-AM, inspección visual de las células confirmará absorción de etiqueta (figura 1). Lecturas de fluorescentes automatizadas seguimiento migración como tránsito de las células en la parte inferior del parte movible en el tiempo. Estos datos muestran claramente una inducción de la migración celular hacia la MCP-1, así como un aumento de esta respuesta por el suero (figura 2A). Dependiendo de la fuerza .......

Discusión

Cuantificación de la migración de células inmunes puede lograrse usando simple y rápido de ensayos tanto in vitro como in vivo. Demostramos en vitro la Quimiotaxis de monocitos humanos en respuesta a un gradiente de MCP-1 y aumento por el suero. In vivo, esplenocitos murinos donantes fueron etiquetados diferencialmente y tras transferencia adoptiva, fueron recuperados de los animales receptores.

Usando un lector de placa tiene la ventaja de varios puntos del.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
RPMI-1640	Thermo Fisher Scientific	11875-093
HEPES	Thermo Fisher Scientific	15630-080
Suero fetal bovino	ATCC	30-2020
Matraz de cultivo celular	Corning	353136
Calcein AM	Thermo Fisher Scientific	C1430	Excitación: 485 nm, Emisión: 520 nm
Célula placa de cultivo	Corning	1007
placa de 24 pocillos	Corning	353504
Fluoroblok Inserto de fibronectina	Corning	CB354597
tubo cónico de 15 mL	Corning	352097
Bovine Albúmina sérica	Tecnología de señalización celular	9998S
Humano Recombinante MCP-1	Peprotech	300-04
Bovino adulto Suero	Sigma	B9433
HBSS con calcio y magnesio; sin rojo fenol	Thermo Fisher Scientific	14025-092
SpectraMax M2e	Molecular Devices
Microscopio de fluorescencia invertida Olympus IX71	Olympus
Isothesia	Henry Schein salud animal	11695-6776-2	Anestesia con isofluorano
Colador de células 40um nylon	Falcon Corning	352340
ACK tampón de lisado	Calidad Biológica	118-156-101
CellTracker Naranja CMTMR Tinte	Thermo Fisher Scientific	C2927	Excitación: 541 nm, Emisión: 565 nm
CellTracker Verde CMFDA Tinte	Thermo Fisher Scientific	C2925	Excitación: 485 nm, Emisión: 520 nm
Jeringa de 5 ml	Jeringa BD	309646
jeringa TB de 1 ml Jeringa	BD	309625
línea celular THP-1	ATCC	TIB-202
Brilliant Violet 421 anti-ratón Anticuerpo CD3	Biolegend	100228	Excitación: 405 nm, Emisión: 421 nm
Violeta brillante 605 anti-ratón CD19 Anticuerpo	Biolegend	115540	Excitación: 405 nm, Emisión: 603 nm
Placa inferior redonda de 96 pocillos	Corning	353077
LSRII	BD Biosciences	Citómetro

lector de placas de flujo