La falta de herramientas para medir las propiedades del material y parámetros tensional en vivo impide validar sus papeles durante el desarrollo. Se emplean microscopía de fuerza atómica (AFM) y nanopartículas de seguimiento para cuantificar características mecánicas en la célula de yema de embrión intacto de pez cebra durante epiboly. Estos métodos son fiables y ampliamente aplicables evitando intervenciones intrusivas.
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Artículo de método
AFM y Microrheology en la celda de yema de embrión de pez cebra
En este artículo
Resumen
Resumen
Dilucidar los factores que dirigen la organización espacio-temporal de la evolución de los tejidos es uno de los objetivos primordiales en el estudio del desarrollo. Varias proposiciones afirman han sido contribuciones importantes a la comprensión de las propiedades mecánicas de las células y tejidos en su organización espacio-temporal en los diferentes procesos morfogenéticos y de desarrollo. Sin embargo, debido a la falta de herramientas fiables y accesibles para medir las propiedades del material y parámetros tensional en vivo, validación de estas hipótesis ha sido difícil. Aquí presentamos métodos empleando microscopía de fuerza atómica (AFM) y rastreo con el fin de cuantificar las propiedades mecánicas de la célula de yema de embrión de pez cebra intacto durante epiboly de partículas. Epiboly es un proceso conservado principios cuyo estudio es facilitada por la transparencia del embrión. Estos métodos son fáciles de implementar, fiable y ampliamente aplicable ya que superan las intervenciones intrusivas que pueden afectar la mecánica del tejido. Se aplicó una estrategia simple para el montaje de especímenes, grabación de AFM e inyecciones de nanopartículas y seguimiento. Este enfoque hace que estos métodos fácilmente adaptable a otras épocas del desarrollo u organismos.
Introducción
Los principios físicos subyacentes el control biomecánico de procesos morfogenéticos son en gran parte indefinidos. Mientras que estudios biomecánicos en el nivel molecular y celular están cobrando impulso considerable, la exploración de los parámetros biomecánicos en el nivel de tejido/organismo está en su infancia. Hidrodinámica de la regresión1 o Video microscopia de la fuerza2 permiten a los investigadores distinguir fuerzas activas y pasivas, mientras que el láser microcirugía3, o el menos intrusiva microscopía de fuerza atómica (AFM) de células disociadas4 o en vi....
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Protocolo
Todos los pasos del Protocolo se describen a continuación siguen las pautas de cuidado de los animales de nuestras instituciones.
1. pez cebra cultura
- Criar y mantener el pez cebra adulto en condiciones normales.
Nota: AB y TL tipo salvaje embriones se utilizaron para este estudio. - Recoger embriones y cultivarlas a 28,5 ° C en el E3 embrión media24. Etapa según la morfología descrita19.
2. microscopía de fuerza atómica
- Manualmente en dechorionate escena embriones de pez cebra (de diferentes edades según los intereses individual....
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Resultados
Mediciones de tensión cortical
Para cada punto de medición, cinco curvas de fuerza-desplazamiento (F-z) fueron adquiridas por AFM por rampa del cantilever en 1 Hz con una amplitud pico a pico de 5 μm (velocidad = 10 μm/s) hasta una muesca máxima de ~ 2 μm. Este procedimiento fue tomando menos de 20 minutos y no fue afectado por la progresión de epiboly. Cada condición experimental se probó en embriones de al menos 5.
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Discusión
Aquí nos muestran que las propiedades del material y algunos parámetros biomecánicos de la célula de yema de huevo de pez cebra durante epiboly pueden ser fácilmente estimadas por AFM y nanopartículas de microrheology.
Mientras que AFM se ha empleado para recuperar características reológicas de las células y tejidos en condiciones fisiológicas4,5,25,28, aquí hemos de.......
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Divulgaciones
Los autores declaran no intereses financieros que compiten u otros conflictos de intereses.
Agradecimientos
Agradecemos a Amayra Hernández-Vega y Philippe Alexandre Pouille por participar en la creación de la base de estos protocolos. También agradecemos a la plataforma de proyección de imagen Molecular IBMB-PCB, Xavier Esteban y los miembros del laboratorio de apoyo continuo. El programa de grupos consolidados de la Generalitat de Catalunya y DGI y becas Consolider del Ministerio de economía y competitividad de España OE y DN apoya esta labor.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Microscopio óptico invertido | Nikon | TE2000 | Visualización de la muestra y el voladizo de AFM |
| Microscopio de fuerza atómica (AFM) | Hecho a | medida-Se | puede emplear cualquier AFM comercializado |
| Microscopio confocal invertido | Zeiss | LSM780 | Recopilación de datos de nanorreología |
| Agarosa D1 Low EEO | Conda | 8016.00 | Fundición de |
| embrionesUltrapure LMP Agarosa (bajo punto de fusión) | Invitrogen | 16520-100 | Aseguramiento de embriones |
| Pez cebra Moldes de microinyección y trasplante | World Precision | Instruments Z-MOLDS | Fundición de embriones. Hecho a medida con las dimensiones originales, también se puede emplear |
| Dumont 5 Pinzas | FST | 11251-20 de | 1,5 mm de diámetro |
| Si3N4 voladizo | Novascan | PT. GS | Medición del embrión por AFM. Punta esférica: 4.5 y micro; m de diámetro y k=0,01 N/m |
| Nanopartículas fluorescentes | Life Technologies | FluoSpheres F8811,Para | el seguimiento de la nanorreología |
| Extractor de micropipetas | Sutter Instruments | P-2000 | Fabricación de microagujas a medida |
| Vidrio capilar de borosilicato | Warner Instruments | G100TF-4 | Fabricación de microagujas a medida |
| Micromanipulador | Narishige | MN-153 | Manipulación de la micropipeta |
| Microinyector | Eppendorf | FemtoJet Express | Control del tiempo y la presión |
| de inyección Microscopio estereoscópico | Leica | DFC365FX | Visualización de los embriones durante la inyección Software de |
| análisis | MathWorks | Matlab | Análisis de AFM y datos de seguimiento de partículas |
| Pez cebra | AB y TL tipo salvaje | - | Cepas empleadas para la recolección de embriones |
| Placas inferiores de vidrio | Mat Tek | P35G-0.170-14-C | Montaje de embriones para la recopilación de datos de nanorreología |
| Micrómetro de etapa | FST | 29025-02 Medición del | volumen de inyección |
Referencias
- Hernandez-Vega, A., et al. Polarized cortical tension drives zebrafish epiboly movements. EMBO J. 36, 25-41 (2017).
- Brodland, G. W., et al. Video force microscopy reveals the mechanics of ventral furrow invagination in Drosophila. Proc....
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Reimpresiones y permisos
