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Artículo de método

AFM y Microrheology en la celda de yema de embrión de pez cebra

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DOI:

10.3791/56224

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29 de noviembre de 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Instituto de Biología Molecular de Barcelona, Consejo Superior de Investigaciones Científicas, 2Institute for Bioengineering of Catalonia, Universitat de Barcelona and CIBER Enfermedades Respiratorias

En este artículo

Resumen

La falta de herramientas para medir las propiedades del material y parámetros tensional en vivo impide validar sus papeles durante el desarrollo. Se emplean microscopía de fuerza atómica (AFM) y nanopartículas de seguimiento para cuantificar características mecánicas en la célula de yema de embrión intacto de pez cebra durante epiboly. Estos métodos son fiables y ampliamente aplicables evitando intervenciones intrusivas.

Resumen

Dilucidar los factores que dirigen la organización espacio-temporal de la evolución de los tejidos es uno de los objetivos primordiales en el estudio del desarrollo. Varias proposiciones afirman han sido contribuciones importantes a la comprensión de las propiedades mecánicas de las células y tejidos en su organización espacio-temporal en los diferentes procesos morfogenéticos y de desarrollo. Sin embargo, debido a la falta de herramientas fiables y accesibles para medir las propiedades del material y parámetros tensional en vivo, validación de estas hipótesis ha sido difícil. Aquí presentamos métodos empleando microscopía de fuerza atómica (AFM) y rastreo con el fin de cuantificar las propiedades mecánicas de la célula de yema de embrión de pez cebra intacto durante epiboly de partículas. Epiboly es un proceso conservado principios cuyo estudio es facilitada por la transparencia del embrión. Estos métodos son fáciles de implementar, fiable y ampliamente aplicable ya que superan las intervenciones intrusivas que pueden afectar la mecánica del tejido. Se aplicó una estrategia simple para el montaje de especímenes, grabación de AFM e inyecciones de nanopartículas y seguimiento. Este enfoque hace que estos métodos fácilmente adaptable a otras épocas del desarrollo u organismos.

Introducción

Los principios físicos subyacentes el control biomecánico de procesos morfogenéticos son en gran parte indefinidos. Mientras que estudios biomecánicos en el nivel molecular y celular están cobrando impulso considerable, la exploración de los parámetros biomecánicos en el nivel de tejido/organismo está en su infancia. Hidrodinámica de la regresión1 o Video microscopia de la fuerza2 permiten a los investigadores distinguir fuerzas activas y pasivas, mientras que el láser microcirugía3, o el menos intrusiva microscopía de fuerza atómica (AFM) de células disociadas4 o en vivo 5 o nanopartículas microrheology6 permite la anticipación de respuestas y propiedades mecánicas de los tejidos.

AFM es una técnica topográfica tridimensional de alta resolución atómica resolución de rugosidad de la superficie y el cumplimiento de la desviación de consejos de voladizo al entrar en contacto con una superficie sondeado7. Se han desarrollado diferentes metodologías con AFM para investigar propiedades de superficie, incluyendo medición de fricción, fuerzas de adhesión y propiedades viscoelásticas de materiales diversos. Recientemente, AFM ha emergido como una potente herramienta para recuperar información sobre las propiedades mecánicas de muestras biológicas. En particular, AFM puede extraer forma no invasiva el módulo de corte complejo de las células aplicando sangrías oscilatorias con una punta micro conectada a un voladizo de la constante flexión conocido8. Esto nos permite inferir las fuerzas resultantes. Sin embargo, AFM no es único y diferentes metodologías permiten extraer datos de reología y propiedades mecánicas de las células individuales (p. ej., micropipeta aspiración9, magnético de torsión citometría (MTC)10o uniaxial extensible prueba11).

Sin embargo, la aplicación de estas metodologías novedosas en complejos procesos morfogenéticos no es sencilla. Los principales desafíos que enfrentan al determinar las propiedades mecánicas de los tejidos embrionarios son los pequeños (μm a mm), suave (en el 102 - 104 gama de Pa) y la naturaleza visco-elástica (dando lugar a fenómenos dependientes del tiempo) de los materiales12. Por lo tanto, es importante adaptar los métodos empleados para la determinación de propiedades mecánicas (rigidez, viscosidad, adherencia) para el caso concreto de los embriones y organismos en desarrollo. Dos cuestiones importantes deben tenerse en cuenta al analizar los métodos reológicos para el estudio de desarrollo: para evitar interferencia intrusa y proporcionar accesibilidad. En este escenario, aspiración de la micropipeta, MTC y ensayos de tracción presentan limitaciones. En el primer caso, la alta deformación que sufre una célula podría alterar sus propiedades fisiológicas y mecánicas9. En el segundo caso, la necesidad de adherirse firmemente el tejido experimental a un sustrato para que las tensiones aplicadas deforman el citoesqueleto localmente también puede introducir efectos en el estado de activación de las células y, por lo tanto, en sus características mecánicas10 . Últimos enfoques extensibles uniaxiales están limitados por la geometría de desarrollar organismos y accesibilidad11.

AFM parece ser más adecuado para el estudio de procesos de desarrollo ya que permite el estudio de muestras biológicas directamente en su ambiente natural sin ninguna preparación engorrosa. Por otra parte, como la disociación de los tejidos embrionarios es generalmente difícil, el reducido tamaño de sondas de AFM proporciona un alto grado de versatilidad sin limitación en la elección del tipo de medio (acuoso o no acuoso), temperatura de la muestra o producto químico composición de la muestra. AFM es suficientemente versátil para ser aplicada a grandes dominios y escalas de tiempo y se ha empleado para recuperar propiedades de los materiales de los tejidos en distintas etapas de desarrollo o en condiciones fisiológicas. Conjunto nativos tejidos como las arterias13 o huesos14 han sido estudiados desde un punto de vista topográfico y en algunos casos, como la esclerótica, propiedades mecánicas han sido obtenido15. Topografía se ha explorado también en embriones vivos permitiendo la visualización de, por ejemplo, cambio de celular durante la morfogénesis en Xenopus16. Protocolos de preparación de muestra última y completa se han desarrollado para determinar parámetros mecánicos durante diferentes procesos de desarrollo. Se han generado mapas de nanoindentación en secciones de tejido interpretaciones nativas para la chica tubo digestivo embrionario11; propiedades adhesivas y mecánicas obtenido por ectodermo, mesodermo y endodermo progenitoras células individuales aisladas de embriones de pez cebra gastrulating4; mediciones de rigidez para el epiblasto y la línea primitiva en explantes de embriones aviar17; y un patrón distinto de gradientes de rigidez definida directamente en el cerebro embrionario de Xenopus5.

Un salto cualitativo importante para la aplicación de AFM para explorar desarrollo embrionario puede provenir de acercarse a procesos morfogenéticos acceso sencillos. Pez cebra epiboly es un evento esencial y conservado, en el que diferentes tejidos coordinarán en un espacio esférico restringido para dirigir la expansión del blastoderm en pocas horas. En el inicio de pez cebra epiboly (etapa esférica), una capa superficial de células, la capa envolvente (EVL), cubre una tapa semiesférica de blastómeros centrado en el polo animal del embrión sentado en una célula sincicial yema masiva. Epiboly consiste en la expansión de la cortical ward vegetal de la Vet, las células profundas (DCs) del blastoderm y la capa externa de la célula sincicial yema (E YSL) alrededor de la yema. Epiboly termina con el cierre de la Vet y los controladores de dominio en el polo vegetal18,19,20. Cómo y donde las fuerzas se generan durante el epiboly y cómo se juntan a nivel mundial todavía no está claro de1,21.

Aquí describimos en detalle cómo aplicar AFM para inferir propiedades mecánicas pasivas del tejido durante la progresión del epiboly en la yema de huevo de pez cebra de la célula en vivo. Para ello, empleamos pequeñas microesferas atadas AFM voladizos como sondas. Esto permite la recuperación de información local precisa dentro de la superficie de la célula de yema no uniforme y gradientes tensionales y su dinámica en el tiempo. AFM alternativo enfoques tales como utilizando ménsulas de cuña22, serán datos locales no render que es bastante precisos. La técnica de cuña, que requiere habilidades de manipulación muy cuidadosa para pegar una cuña más grande que el tamaño de la muestra en el extremo del voladizo, no está bien adaptada para sondear el embrión (~ 2 más grande que la longitud del voladizo) mecánica.

Modelado y caracterización de las propiedades viscoelásticas de las células de manera cualitativa y cuantitativa permiten una mejor comprensión de su biomecánica. Desde un punto de vista biomecánico, es esencial entender epiboly y no sólo demanda conocimiento de las medidas corticales de tensión y dinámica, que puede ser extraído por AFM; por lo tanto hay necesidad de información sobre las propiedades biofísicas del tejido. Para extraer esta información, se han desarrollado una variedad de técnicas de reología celular durante los años para caracterizar diversos tipos celulares bajo diferentes condiciones fisiológicas23. Incluyen AFM, MTC y pinzas ópticas (OT). Estos métodos, sin embargo, se ha demostrado insuficientes para análisis mesoscópica en la escala de embriones o de los órganos. Como alternativa, nos hemos adaptado con éxito seguimiento de nanopartículas microrheology6 para en vivo las medidas reológicas. Esta técnica analiza los desplazamientos browniano de las partículas individuales y deduce propiedades locales micromechanical.

Junto microrheology AFM y nanopartículas permiten la definición de cortical tensional dinámica y propiedades mecánicas internas de la yema durante epiboly. Esta información apoya plenamente un modelo en el que tensión anisotrópica se desarrolla como consecuencia de las diferencias en la respuesta de deformación de la Vet y la capa citoplasmática de yema de huevo (YCL) a la contracción isotrópica actomyosin de la corteza E YSL es esencial para el movimiento neto direccional del EVL y epiboly progresión1.

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Protocolo

Todos los pasos del Protocolo se describen a continuación siguen las pautas de cuidado de los animales de nuestras instituciones.

1. pez cebra cultura

  1. Criar y mantener el pez cebra adulto en condiciones normales.
    Nota: AB y TL tipo salvaje embriones se utilizaron para este estudio.
  2. Recoger embriones y cultivarlas a 28,5 ° C en el E3 embrión media24. Etapa según la morfología descrita19.

2. microscopía de fuerza atómica

  1. Manualmente en dechorionate escena embriones de pez cebra (de diferentes edades según los intereses individuales). Quitar chorions con dos pinzas finas y afiladas (véase Tabla de materiales).
    1. El corion usando un fórceps de agarre y hacer un rasgón en ella con las otras pinzas. Luego, sosteniendo el corion en una región opuesta a la de la lágrima, empuje el embrión suavemente a través de la abertura.
    2. Realizar la dechorionation bajo un estereomicroscopio disección con un rango ajustable de aumento entre 8 X y 50 X.
  2. Montar los embriones para AFM
    1. Preparar una solución de agarosa al 2% en medio del embrión y llenar un plato de Petri de 35 mm con esto. Dejar solidificar. Hacer agujeros pequeños de 1.5 mm de diámetro (dos veces el tamaño del embrión) y aproximadamente 350 μm profundidad (la mitad del tamaño de embriones) con unas pinzas finas en la cama de agarosa.
    2. Coloque los embriones en las estocadas en la capa de agarosa y asegurar que derriten en lugar esparciendo alrededor de una solución de 0,5% bajo agarosa en medio embrión. Vierta esta solución alrededor de sólo los embriones para garantizar en los agujeros.
    3. Antes de la agarosa de bajo punto de fusión se solidifica a temperatura ambiente, gire los embriones de tal manera que la región de interés a ser sondeado por AFM hacia arriba (figura 1A).
  3. Examinar los embriones por AFM
    1. Localice y los embriones en la placa de Petri con un objetivo de 20 X en un microscopio de fuerza atómica invertida de la imagen (véase Tabla de materiales25) a temperatura ambiente (23-24 ° C).
      Nota: Los embriones se mantienen vivos inmerso en medio del embrión y atado a la cama de agarosa.
    2. Sonda de la superficie de la célula de yema de huevo de embriones casted empleando granos esféricos del poliestireno de 4,5 μm de diámetro conectado a un voladizo con una constante de resorte nominal 0,01 N/m. fijar la amplitud de pico a pico de la oscilación voladiza a 5 μm y su frecuencia de 1 Hz.
    3. Recopilar datos para cada región a probarse en diferentes posiciones y en varios embriones, como una rutina, para un promedio de datos.
      Nota: Un buen punto de partida es sonda cinco posiciones situados en el centro y en las esquinas de un cuadrado de μm 10 μm x 10 controlando la posición de voladizo con los actuadores piezoeléctricos XY del microscopio AFM. Colección de imágenes y datos tomó alrededor de 20 min por embrión. Grabación de datos en diferentes regiones de la superficie de células de yema de embrión, por ejemplo, el polo vegetal o diferentes regiones cerca de la margen de las células EVL (figura 1B y 1C), sólo es posible mediante el empleo de distintas muestras orientadas de manera diferente.
  4. Calcular las fuerzas
    1. Medir el desplazamiento vertical de la micropalanca AFM (z) con sensores del calibrador de tensión acompañados a actuadores piezoeléctricos y su desviación (d) mediante un fotodiodo de cuadrante mediante el método de la palanca óptica con el software de control de microscopio (véase Tabla de materiales 25).
    2. Utilizar la pendiente de una curva de d z obtenida de los datos recogidos de una región pelada de un cubreobjetos de vidrio para calibrar la correlación entre la señal del fotodiodo y la deflexión del cantilever (d).
      Nota: El desplazamiento vertical medido es igual a la deflexión del cantilever y la pendiente representa la sensibilidad de deflexión de la palanca óptica26.
    3. Deducir que la constante de resorte voladizo (k) de las fluctuaciones térmicas como se ha descrito27.
    4. Calcular la muesca de la muestra (h) como:
      h = (z - zc) -(d - dde)          (1)
      Nota: Aquí zc es la posición del punto de contacto y dfuera es el desplazamiento del fotodiodo.
    5. Calcule la fuerza (F) en el voladizo como:
      F = k · d (2)
  5. Calcular la tensión de la corteza en términos de un modelo de globo de líquido compuesto por una capa cortical tensión Tc que encierra un líquido viscoso. En este modelo, para marcas pequeñas (en comparación con el tamaño del embrión), fuerza aumenta proporcionalmente4,28 como:
    F = 4π Tc[(Rb / Re) + 1)] h (3)
    Nota: Aquí Rb es el radio del talón y e de la R es el radio del embrión. Para el embrión de pez cebra, como el radio del embrión (400 μm) es dos órdenes de magnitud más grandes que el del grano (2,25 μm), esta ecuación se puede aproximar como:
    F = 4π Tc h (4)
    1. Calcular la fuerza de tensión-sangría (F-h) punto de curvas en cada región de célula de yema de embrión para cinco diferentes medidas.
    2. Calcular la Tc para cada F-h curva por mínimos cuadrados no lineal apropiado. Para el análisis estadístico, la tensión de la cortical Tc computada debe un promedio de las diferentes F-h curvas.
  6. Medir las propiedades viscoelásticas (reología) de la corteza mediante la aplicación de baja amplitud (100 nm) oscilaciones de multifrecuencia en AFM compuesto de ondas sinusoidales de diferentes frecuencias25.
    1. Calcular un módulo complejo efectivo g*(ƒ) en el dominio de la frecuencia de las curvas de indentación de fuerza como:
      g * (f) = [F(f) / h(f)]- ifb (5)
      aquí i es la unidad imaginaria y F(f) y h(f) son los espectros de frecuencia (f) de la fuerza y sangría. b es la corrección para el arrastre viscoso en el voladizo extraído de las oscilaciones que se aplica sobre la superficie.
    2. Separado g*(ƒ) en partes real e imaginarias como:
      g * (Ƒ) = g' (f) + ig'' (f)          (6)
      em > g'(f) es el módulo elástico y es una medida de la energía elástica almacenada y recuperada por ciclo de oscilación. g'' (f) es el módulo viscoso que representa la energía disipada.
    3. Calcular la tangente de la pérdida, que proporciona un índice del sólido-como (< 1) o líquido (> 1) comportamiento del material, como:
      g'' (f) / g' (f)          (7)
      Nota: Con este tipo de medición, es posible extraer parámetros indicando cómo viscoso y elástico como es el material sondeado. Aunque b un poco depende de la distancia del extremo del voladizo a la superficie, dados los muy bajos valores de g´´ exhibida por la yema de la célula (véase más abajo la Figura 2D ), pequeñas variaciones en b tienen un impacto insignificante en medidas29.

3. partículas seguimiento Microrheology

  1. Realizar la microinyección de partículas en la célula de yema de huevo
    1. Fabricar a medida microneedles usando un extractor de micropipeta horizontal y del borosilicate capilar (véase Tabla de materiales).
      1. Preparar microneedles que tienen un diámetro exterior de 1,00 mm, un diámetro interno de 0,58 mm y una longitud de 10 cm tirador parámetros: presión: 500; Calor: 510; Pull: 65; Velocidad: 25; Tiempo: 50.
    2. Preparar una placa de Petri de inyección mediante la creación de carriles de hendidura recta en una agarosa al 1% en la cama medio embrión empleando moldes hechos personalizados (véase Tabla de materiales).
      1. Ponga los moldes boca abajo y coloque en la parte superior del gel de agarosa líquida y retirar los moldes una vez que el gel se ha solidificado. Pipetear los embriones en los surcos hechos por el molde en la agarosa bajo un estereomicroscopio disección con 1,2 aumentos.
        Nota: El ancho y el diseño de los moldes permiten los embriones alinear el auto.
    3. Antes de la inyección, eliminar casi completamente el medio para facilitar la inyección (la tensión superficial impide que el embrión/corion pegado a la aguja al retirar después de la inyección).
    4. Microinject de nanopartículas fluorescentes (radio a = 100 nm, véase Tabla de materiales) diluido en agua (1:1, 000) en la parte vegetal de la célula de yema de embrión (Figura 3A).
    5. Ajustar la micropipeta con micromanipuladores precisión e inyecte los granos con una microinyectora automática con controles de tiempo y presión (véase Tabla de materiales). Ajustar la presión entre 10 y 20 psi.
    6. Antes de inyectar la solución grano, calibrar el volumen a inyectar (0,5 nL) midiendo el tamaño de la gotita entregado por la microinyectora con un micrómetro de 1 x 0.01 m m (véase la Tabla de materiales).
    7. Emplear un aumento de 1.6 X en el estereomicroscopio disección para visualizar los embriones durante las inyecciones, que se realizan a temperatura ambiente.
  2. Evaluar el comportamiento viscoelástico de la yema mediante el registro de las fluctuaciones térmicas
    1. Dechorionate los embriones microinyectados en paso 2.1 e incrustarlos en una baja de 0,5% derretir la agarosa de punto en la solución de medio de embrión a 30 ° C. Luego, transferirlos a las placas de fondo de cristal (véase Tabla de materiales) y Oriente y empujarlos hacia el cubreobjetos cuando la agarosa es líquido inmóvil.
      Nota: Cuando la agarosa se solidifique a temperatura ambiente, los embriones están listos para ser reflejada.
    2. Coloque los embriones montados en las placas de fondo de cristal en el escenario de un microscopio confocal invertido 2 h después de la microinyección. Capturar imágenes de las nanopartículas para 26 s a una frecuencia de muestreo de 25 Hz con un objetivo X 63 a temperatura ambiente en un microscopio confocal invertido empleando el software del microscopio comerciales estándar (tamaño de pixel = 166 nm, imágenes capturadas cada 40 ms).
    3. Calcular la posición de los centroides de las partículas y definir sus trayectorias en el tiempo con el plugin TrackMate de la open source software ImageJ (figura 3B).
    4. Calcular el desplazamiento de media cuadrada bidimensional (MSD) de cada partícula con software a la medida6,30 como:
      < Δr2 (τ) > = < [x(t + τ) - x(t)]2 + [y(t + τ) - y(t)]2>           (8)
      Nota: Aquí t es el tiempo transcurrido y el desfase de tiempo. En un líquido viscoso puro, MSD aumenta inversamente con viscosidad (ν) según la relación de Stokes-Einstein:
      < Δr2 (τ) > = 4kB Tτ/ 6πνa,          (9)
      donde T es la temperatura absoluta.

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Resultados

Mediciones de tensión cortical
Para cada punto de medición, cinco curvas de fuerza-desplazamiento (F-z) fueron adquiridas por AFM por rampa del cantilever en 1 Hz con una amplitud pico a pico de 5 μm (velocidad = 10 μm/s) hasta una muesca máxima de ~ 2 μm. Este procedimiento fue tomando menos de 20 minutos y no fue afectado por la progresión de epiboly. Cada condición experimental se probó en embriones de al menos 5.

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Discusión

Aquí nos muestran que las propiedades del material y algunos parámetros biomecánicos de la célula de yema de huevo de pez cebra durante epiboly pueden ser fácilmente estimadas por AFM y nanopartículas de microrheology.

Mientras que AFM se ha empleado para recuperar características reológicas de las células y tejidos en condiciones fisiológicas4,5,25,28, aquí hemos de...

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Divulgaciones

Los autores declaran no intereses financieros que compiten u otros conflictos de intereses.

Agradecimientos

Agradecemos a Amayra Hernández-Vega y Philippe Alexandre Pouille por participar en la creación de la base de estos protocolos. También agradecemos a la plataforma de proyección de imagen Molecular IBMB-PCB, Xavier Esteban y los miembros del laboratorio de apoyo continuo. El programa de grupos consolidados de la Generalitat de Catalunya y DGI y becas Consolider del Ministerio de economía y competitividad de España OE y DN apoya esta labor.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Microscopio óptico invertidoNikonTE2000Visualización de la muestra y el voladizo de AFM
Microscopio de fuerza atómica (AFM)Hecho amedida-Sepuede emplear cualquier AFM comercializado
Microscopio confocal invertidoZeissLSM780Recopilación de datos de nanorreología
Agarosa D1 Low EEOConda8016.00Fundición de
embrionesUltrapure LMP Agarosa (bajo punto de fusión)Invitrogen16520-100Aseguramiento de embriones
Pez cebra Moldes de microinyección y trasplanteWorld PrecisionInstruments Z-MOLDSFundición de embriones. Hecho a medida con las dimensiones originales, también se puede emplear
Dumont 5 PinzasFST11251-20 de1,5 mm de diámetro
Si3N4 voladizoNovascanPT. GSMedición del embrión por AFM. Punta esférica: 4.5 y micro; m de diámetro y k=0,01 N/m
Nanopartículas fluorescentesLife TechnologiesFluoSpheres F8811,Parael seguimiento de la nanorreología
Extractor de micropipetasSutter InstrumentsP-2000Fabricación de microagujas a medida
Vidrio capilar de borosilicatoWarner InstrumentsG100TF-4Fabricación de microagujas a medida
MicromanipuladorNarishigeMN-153Manipulación de la micropipeta
MicroinyectorEppendorfFemtoJet ExpressControl del tiempo y la presión
de inyección Microscopio estereoscópicoLeicaDFC365FXVisualización de los embriones durante la inyección Software de
análisisMathWorksMatlabAnálisis de AFM y datos de seguimiento de partículas
Pez cebraAB y TL tipo salvaje- Cepas empleadas para la recolección de embriones
Placas inferiores de vidrioMat TekP35G-0.170-14-CMontaje de embriones para la recopilación de datos de nanorreología
Micrómetro de etapaFST29025-02 Medición delvolumen de inyección
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Referencias

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