Aquí, presentamos un protocolo usando RNA-seq para controlar los niveles de mRNA con el tiempo durante la respuesta hipóxica de las células de S. cerevisiae . Este método puede adaptarse para analizar la expresión génica durante cualquier respuesta celular.
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Artículo de método
Medición de los niveles de mRNA con el tiempo durante la levadura S. cerevisiae por respuesta hipóxica
En este artículo
Resumen
Resumen
Complejos cambios en la expresión génica normalmente median una gran parte de la respuesta celular. Cada gen puede cambiar la expresión cinética única como el gen es regulado por el calendario particular de uno de los muchos estímulos, señalización de vías o efectos secundarios. Para capturar el gene entero de expresión ante la hipoxia en la levadura S. cerevisiae, RNA-seq análisis fue utilizada para supervisar los niveles de mRNA de los genes en momentos específicos después de la exposición a la hipoxia. Hipoxia fue establecida por cultivo de células en ~ 100% N2 gas. Lo importante, a diferencia de otros estudios hipóxicos, ergosterol y ácidos grasos insaturados no agregaron a los medios de comunicación ya que estos metabolitos afectan la expresión génica. Puntos de tiempo fueron elegidos en el intervalo de 0 - 4 h después de la hipoxia porque ese período captura los principales cambios en la expresión génica. En cada momento, las células hipóxicas registros medio fueron rápidamente filtrado y congelado, limitar la exposición a los cambios2 y concomitante O en la expresión génica. ARN total fue extraído de las células y utilizado para enriquecer de mRNA, que luego se convierte a cDNA. De este cDNA, se crearon bibliotecas multiplexores y ocho o más muestras se secuenciaron en un carril de un secuenciador de última generación. Una tubería de la secuencia se describe, que incluye ajuste de base de calidad, leer cartografía y determinar el número de lecturas por gene. DESeq2 en el ambiente estadístico de R fue utilizado para identificar los genes que cambian significativamente en alguno de los puntos del tiempo hipóxico. El análisis de tres réplicas biológicas reveló alta reproducibilidad, genes de diferenciación cinética y un gran número de esperan O2-regulada de los genes. Estos métodos pueden ser utilizados para estudiar cómo las células de diferentes organismos responden a la hipoxia con el tiempo y adaptados para el estudio de expresión génica durante otras respuestas celulares.
Introducción
Muchos organismos responden a la hipoxia, o baja O2, alterando gene expression 1,2,3. Esta respuesta ayuda a las células frente a la falta de un sustrato crítico para la respiración aeróbica y para varias reacciones biosintéticas, pero también con un cambio de estado de redox 4. Varios estudios de microarray en S. cerevisiae muestran que los niveles de mRNA de cientos de genes cambian en respuesta a hipoxia 5,6,7,
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Protocolo
1. inducción de hipoxia
- Un día o más antes del curso de tiempo de hipoxia: preparar la incubadora, celular filtrado sistema de vacío, tanque de gas, frascos, tapones, tubos de vidrio y tubos, como en la Tabla de materiales.
- Coloque el tanque de2 N, incubadora, sistema de aspiración y filtración en proximidad cercana, a habilitar el procesamiento rápido de las células.
- Preparar medio YPD líquido estéril (1% Extracto de levadura, 2% peptona, 2% glucosa) mezclando los componentes en una botella de vidrio y autoclave.
- Plan de diseño de frascos en la incubadora.
Nota: El tanque de2 N, el prim....
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Resultados
El curso del tiempo de hipoxia y RNA-seq análisis fueron realizados independientemente tres veces. Para examinar la reproducibilidad de las tres repeticiones, datos de expresión genética para todos los genes se analizan mediante análisis de componentes principales (ACP). La figura 2 muestra cómo cambian las muestras durante los dos primeros componentes principales, que en conjunto representan el 58.9% de la variabilidad. Este análisis indicó que cada curso de.......
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Discusión
En este estudio, se midió los niveles de mRNA de los genes durante la hipoxia en la levadura S. cerevisiae. El objetivo era analizar cómo global gene expresión cambios debido al crecimiento en un entorno controlado cerca-anóxica. Varias medidas fueron tomadas para asegurar que el método descrito aquí fue cuidadosamente controlada y reproducible. En primer lugar, las células fueron expuestas a un ambiente hipóxico precisamente definido: 99.999% N2 en medios enriquecidos (YPD). Otros estudios de hipoxia.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos el Instituto Lewis Sigler integradora genómica instalaciones centrales para secuenciación en la Universidad de Princeton para asesoramiento técnico y preparación de biblioteca de RNA y secuenciación. Este trabajo fue financiado por becas de la Universidad de Rowan y NIH NIGMS R15GM113187 a M.J.H.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Incubadora seca cerrada | Thermo Scientific | MaxQ 4000 | Set a 30 °C. Modifique la puerta para permitir la entrada de un tubo Tygon. Alternativamente, use la incubadora New Brunswick G25, que contiene un puerto de tubo. No utilice un agitador de agua al aire libre, ya que la condensación se acumulará en los tubos entre los matraces, posiblemente contaminando los cultivos. |
| Portafiltros de microanálisis | Millipore | XX1002530 | 25 mm de diámetro, soporte de acero inoxidable, n.º 5 soportes de tapón de silicona perforada en matraz filtrante estándar de 125 ml |
| Fuerte vacío | Edwards | E-LAB 2 | El " casa" El vacío puede ser demasiado débil. Alternativamente, use una bomba de vacío portátil de energía eléctrica como la que se enumera aquí. |
| 1.000 mL | para actuar como trampa de vacío. | ||
| ~ 2 pies de longitud de tubo de vacío de pared gruesa, diámetro interior de 3/8 pulgadas, diámetro exterior 7/8 pulgadas | Tygon | 38TT | Dos piezas: la primera conecta la aspiradora a la trampa y la segunda conecta la trampa al sistema de filtro. |
| de gas N2 de alta presión | con una pureza del 99,999%, >1.000 psi, con regulador y controlador de flujo de gas | ||
| Matraz | Abertura cubierta con papel de aluminio. Uno para cada cepa de levadura. | ||
| de 250 mL esterilizados en autoclave | Aberturas cubiertas con papel de aluminio. Uno para cada punto de tiempo más dos para las trampas de agua. | ||
| Tapones de matraz (tamaño 6, dos orificios de 5 mm de diámetro) | Esterilizados con etanol al 70%. Uno para cada matraz. | ||
| Tubo de vidrio, longitud 9 cm o 17 cm, diámetro interior 2 mm, diámetro exterior 5 mm | Esterilizado con etanol al 70%. Dos tubos para cada matraz. Coloque en los agujeros de cada tapón. Consulte la Figura 1 para la colocación de tubos de 9 frente a 17 cm. | ||
| ~25 cm de longitud de tubo de plástico, diámetro interior 5 mm | Tygon | E-3603 | Una pieza para cada matraz. Esterilizado con etanol al 70%. |
| Discos filtrantes estériles | Millipore HAWP02500 | 25 mm de diámetro, 0,45 y micro; m tamaño de poro, uno para cada punto de tiempo | |
| Estéril dH2O (~100 mL) | |||
| Cubetas | Para medir OD600 (es decir, concentración celular) | ||
| 50 mL tubos de centrífuga estériles | Uno para cada punto de tiempo | ||
| Pinzas limpias y estériles | |||
| Nitrógeno | Para congelar células | ||
| cuentas lavadas con ácido | Sigma | G8772 | Mantener a 4 & grados; C para células de lisis |
| Qiagen RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | Para la purificación de la columna de ARN |
| Tampón | Prepare agregando 10 y micro; L de β-Mercaptoetanol por 1 mL de tampón RLT, mantener a 4 °C. | ||
| Tubos colectores de 2 | mL Qiagen | incluidos en el Qiagen Rneasy Mini Kit | |
| Buffer RPE | Qiagen | incluido en el Qiagen Rneasy Mini Kit | |
| Buffer RW1 | Qiagen | incluido en el Qiagen Rneasy Mini Kit | |
| DNase I stock y soluciones de trabajo | Qiagen | 79254 | La enzima DNasa I se presenta en forma de polvo liofilizado en un vial de vidrio. Con una aguja y una jeringa estériles, inyecte 550 µ L de agua libre de RNasa (incluida en el kit Qiagen) en el vial. Mezcle invirtiendo suavemente la botella. Para evitar la desnaturalización de la enzima, no haga vórtice. Con una pipeta, retire esta solución madre del vial y guárdela en el congelador (-20 ° C) en alícuotas de un solo uso (80 y micro; L cada uno). La solución madre no debe descongelarse ni volver a congelarse. |
| Tampón RDD | Qiagen | incluido en el kit Qiagen DNase | |
| Tubos helados de 2 ml con tapón de | Para lisar células durante la extracción de ARN | ||
| homogeneizador de molino de bolas | Biospec Mini-Beadbeater-24 | 112011 | Mantener en cámara frigorífica |
| Bacto Peptona | BD | DF0118 | para medios líquidos YPD |
| Extracto de levadura Bacto BD | DF0886 | para líquido Medios YPD | |
| glucosa | Fisher | D16 | para medios YPD líquidos |
| Tubos de ensayo Qubit | Thermo Fisher | Q32856 | para medir la concentración de ácidos nucleicos |
| Quant-iTTM dsDNA BR Kit de ensayo | Thermo Fisher | Q32853 | para medir la concentración de ácidos nucleicos |
| Quant-iTTM Kit de ensayo de ARN | Thermo Fisher | Q32855 | para medir la concentración de ácidos nucleicos |
| Fluorímetro Qubit | Thermo Fisher | Q33216 | para medir la concentración de ácidos nucleicos |
| Sistema de electroforesis comercial | Agilent | Bioanalyzer 2100 | para medir la calidad de los ácidos nucleicos |
| Secuenciador de última generación | Illumina | HiSeq 2500 | para bibliotecas de secuenciación |
| sistema automatizado de manipulación de líquidos | Wafergen | Apollo 324 | para crear bibliotecas de secuenciación |
| PrepX PolyA mRNA Isolation Kit | Wafergen | 400047 | para aislar el ARNm del ARN total |
| PrepX RNA SEQ para Illumina Library Kit | Wafergen | 400039 | para crear bibliotecas de secuenciación específicas de hebra a partir de ARN total |
| Divisor | de código de barrashttps://toolshed.g2.bx.psu.edu/repository?repository_id=7119c4f7a89efa57&changeset_revision=e7b7cdc1834d | ||
| Samtools, que incluye el comando | http://www.htslib.org/download/ | ||
| Trimmomatic | http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic | ||
| Bowtie2 (instalado antes de TopHat) | http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml | ||
| TopHat | https://ccb.jhu.edu/software/tophat/index.shtml | ||
| HTSeq | http://www-huber.embl.de/HTSeq/doc/overview.html | ||
| R (instalado antes de R Studio) | https://cran.rstudio.com | ||
| R Studio (versión gratuita) | https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/ |
Referencias
- Semenza, G. L. Oxygen sensing, homeostasis, and disease. New Eng. J Med. 365 (6), 537-547 (2011).
- Butler, G. Hypoxia and gene expression in eukaryotic microbes. Annu. Rev. Micro. 67, 291-312 (2013).
- Ratcliffe, P. J.
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Reimpresiones y permisos
