Rápido Chip para Cruz-reactivity-libre y observador de tiro multiplexado inmunoensayos de Sandwich

Resumen

Demostramos una tecnología de chip de complemento para realizar inmunoensayos sandwich multiplexados Cruz-reactivity-free simplemente chasquear dos diapositivas. Un aparato de presión se utiliza para transferir confiablemente reactivos de microarray de microarrays. El chip del broche de presión puede utilizarse reacciones bioquímicas que requieren colocalización de diferentes reactivos sin contaminación cruzada.

Resumen

Análisis de la proteína multiplexada ha demostrado una sensibilidad diagnóstica superior y precisión frente a las proteínas solo. Microarrays de anticuerpos permiten miles de micro escala inmunoensayos realizados simultáneamente en un solo chip. Formato de ensayo sándwich mejora la especificidad del ensayo mediante la detección de cada destino con dos anticuerpos, pero sufre de reactividad cruzada entre reactivos lo que limita su capacidad de multiplexación. Microarray de colocalización de anticuerpo (ACM) ha sido desarrollado para la detección de proteína multiplexados Cruz-reactivity-free, pero requiere un costoso observador in situ para la fabricación de microarrays durante los ensayos. En este trabajo, demostramos una tecnología de chip de snap que transfiere reactivo de microarrays para microarrays por simplemente encaja a presión juntos, que así no observador es necesario durante la incubación de la muestra y posterior aplicación de anticuerpos de detección (dAbs) con dos fichas almacenamiento de portaobjetos previamente manchados, disociando la preparación de los portaobjetos de la ejecución del ensayo. Ambos métodos de transferencia individuales y dobles se presentan para lograr la alineación exacta entre los dos microarrays y la fabricación de la diapositiva para ambos métodos se describen. Resultados muestran que < 40 μm alineación se ha conseguido con la doble transferencia, alcanzando una densidad de matriz de 625 puntos/cm². Un inmunoanálisis de 50 plexed se ha realizado para demostrar la utilidad de la viruta del complemento en el análisis de la proteína multiplexados. Límites de detección de proteínas de 35 están en la gama de pg/mL.

Introducción

Puede proporcionar un panel de biomarcadores que comprende múltiples proteínas de más alta sensibilidad y especificidad que un único biomarcador en el diagnóstico de enfermedades complejas como cáncer^1,2. El análisis enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA) ha sido la tecnología estándar utilizada en laboratorios clínicos alcanzar un límite de detección bajo pg/ml en plasma, sino límites a un destino por ensayo^3,4,5. Microarrays de anticuerpos se han desarrollado para albergar miles de ensayos miniaturizados llevó a c....

Protocolo

1. fabricación y almacenamiento de snap chips

1. método de transferencia simple ( Figura 1a)
   1. punto cAb soluciones que contengan 400 μg/mL anticuerpos y 20% de glicerol en solución salina tamponada con fosfato (PBS) sobre una nitrocelulosa (o un vidrio funcionalizado) diapositiva de ensayo con una de inyección de tinta microarray observador ¹³ en una humedad relativa de 60% (1.2 nL para cada punto) con espaciamiento de centro a centro de 800 μm. Asegúrese de que la diapositiva es fijada sobre la cubierta del observador según un ángulo (aquí, la esquina inferior izquierda fue utilizada).
   2. I....

Resultados

El procedimiento del ensayo de single y doble métodos de transferencia se muestra en la figura 1. En una transferencia, los taxis son vistos directamente en la diapositiva de ensayo y los lenguados se transfieren en la diapositiva de ensayo al uso en forma de espejo de los taxis (Figura 1a). Procedimiento de solo transferencia se requiere, pero este método sufre de desalineación entre los dos microarrays, causada principalmente p.......

Discusión

En este trabajo, hemos presentado una tecnología de chip de complemento que hace las immunoassays multiplex Cruz-reactivity-free ampliamente disponible para los investigadores con configuración experimental básica. A diferencia de los microarrays de anticuerpos, ningún observador de microarrays es necesario para los usuarios finales. Se demuestran solo y métodos de transferencia de doble, y doble transferencia ofrece exactitud de la alineación superior a ~ 40 μm para los puntos del 98%, con el desalineamiento mayor de 63.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tableta de solución salina tamponada con fosfato	Fisher Scientific	5246501EA
Cy5 conjugada con estreptavidina	Rockland	s000-06
Tween-20	Sigma-Aldrich	p1379
Albúmina sérica bovina	Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc	001-000-162
Glicerol	Sigma-Aldrich	G5516
Solución de bloqueo: Estabilizador de microarrays StabilGuard Choice sin BSA	SurModics, Inc	SG02
Portaobjetos recubiertos de nitrocelulosa	Grace Bio-Laboratories, Inc	305116
portaobjetos recubiertos de aminosilano	Schott North America	1064875
Snap Device	Parallex BioAssays Inc.	PBA-SD01
Observador de microarrays de inyección de tinta	GeSiM	Nanoplotter 2.0
Junta de módulo	deslizante Grace Bio-Laboratories, Inc	204862
Perlas de estabilización de humedad	Parallex BioAssays Inc.	PBA-HU60
Software Array-Pro Analyzer Media	Cybernetics	Versión 4.5
Escáner de microarrays de fluorescencia	Agilent	SureScan Microarray
Software de bioestadística	Software GraphPad	Prisma 6
Captura de endoglin de anticuerpos	R& D Systems	MAB10972
Proteína Endoglin	R& D Systems	1097-ES
Detección de endoglina anticuerpo	R& D Systems	BAF1097
IL-6a (véase la Tabla 1)	R& D Systems
IL-6b (ver Tabla 1)	Invitrogen

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