Artículo de método

Imágenes en vivo de la migración de células epiteliales de mama después del agotamiento transitorio de TIP60

DOI:

10.3791/56248

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7 de diciembre de 2017

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1Cancer Science Institute of Singapore, National University of Singapore, 2Department of Biochemistry, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore

En este artículo

Resumen

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Aquí, presentamos el seguimiento en tiempo real de la migración de la célula en un ensayo de cicatrización utilizando células epiteliales de mama MCF10A TIP60-agotado. La aplicación de técnicas de imagen de células vivas en nuestro protocolo nos permite analizar y visualizar sola célula movimiento en tiempo real y a través del tiempo.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La cicatrización es eficiente y una de las maneras más económicas para el estudio de la migración celular in vitro. Convencionalmente, se toman imágenes al principio y al final de un experimento usando un microscopio de contraste de fase, y se evalúan las capacidades de migración de las células por el cierre de heridas. Sin embargo, movimiento celular es un fenómeno dinámico, y un método convencional no permite rastrear movimiento unicelular. Para mejorar el actuales análisis de cicatrización, utilizamos técnicas de imágenes de células vivas para controlar la migración de la célula en tiempo real. Este método permite determinar la tasa de migración de la célula basada en una sistema de seguimiento de la célula y proporciona una distinción más clara entre la migración celular y proliferación celular. Aquí, se demuestra el uso de imágenes de células vivas en la cicatrización de ensayos para el estudio de las capacidades diferentes de la migración de células epiteliales de mama por la presencia de TIP60. Como la motilidad celular es altamente dinámica, nuestro método ofrece más ideas en los procesos de cicatrización que una instantánea del encierro de la herida con las tradicionales técnicas de imagen utilizadas para los ensayos de la cicatrización.

Introducción

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Proteína VIH Tat interactivo 60 kDa (TIP60) es una lisina acetiltransferasa que puede acetylate histonas y proteínas no histonas1,2. Sus funciones se encuentran que tienen implicaciones en múltiples vías de señalización, incluyendo transcripción, reparación del daño de la DNA y apoptosis1,3,4,5,6, 7 , 8. Además, TIP60 es a menudo o en casos de cáncer y su regulación a la baja se correlaciona con la metástasis de cáncer y supervivencia pobre precios9,10,11,12, 13,14. Metástasis tumoral es la principal causa de muerte relacionada con cáncer. Es un proceso multi-step, y el paso inicial de la metástasis implica la migración y la invasión de células tumorales en los tejidos adyacentes15,16. Para ello, las células del tumor primero deben separar de la masa del tumor primario, ya sea en la forma de una hoja de células colectivamente invasores o como independiente de las células17. Durante este proceso, las células del tumor a menudo se someten a epitelial de transición mesenquimal (EMT), resultando en cambios en la morfología y la célula adherencia capacidad17,18.

Se han desarrollado algunas técnicas para estudiar la migración y capacidad de invasión del tumor de las células en vitro. Entre ellos, la cicatrización es más eficiente y económico19. En primer lugar, este método implica la creación de un espacio artificial en una monocapa confluente de células, lo que permite a las células migrar y cerrar la brecha. En segundo lugar, se pueden capturar imágenes de los espacios al principio y al final del experimento. Por último, una comparación de cierre de brecha se utiliza para determinar la tasa de migración de la célula. Un microscopio de contraste de fase se utiliza generalmente para capturar imágenes para los ensayos convencionales de cicatrización. Otra de las ventajas del ensayo de cicatrización es que en parte se asemeja en vivo la migración celular tumoral. Del mismo modo a metástasis de tumor en vivo , migración celular en la cicatrización de los ensayos muestra la migración colectiva de hojas epiteliales y la migración de las células individuales separadas.

Sin embargo, la migración celular es conocida por ser dinámico y es necesario documentar el movimiento de las células en tiempo real. Por ejemplo, un ensayo de cicatrización convencional no permite un investigador analizar sola célula movimiento. Por otro lado, las células cultivadas para los ensayos de cicatrización suelen ser sediento de suero para inhibir la proliferación celular. Esto se hace para descartar la posibilidad de cierre de la brecha debido a la proliferación celular. Sin embargo, todavía habrá algunos proliferación y muerte celular e imágenes de contraste de fase tomadas antes y después del experimento son incapaces de distinguir entre ellos.

La técnica de imágenes de células vivas dirige a esta limitación de ensayos convencionales de cicatrización. Utilizando un microscopio de proyección de imagen en vivo combinado con un incubador de CO2 y control de la temperatura adecuada, los investigadores pueden medir el tamaño de la brecha y su velocidad de cierre en el tiempo mientras que rastrear el movimiento de migración activa de células ubicadas en las puntas de los frente invasivo. Por lo tanto, la aplicación de células vivas para controlar la migración de células de la proyección de imagen no sólo proporcionará el mejor visualización de la migración de la célula, pero también permite la posibilidad de diferenciar entre la migración celular y proliferación celular, proporcionando así más Análisis fiable de la migración de la célula.

En este estudio, las células epiteliales de la mama MCF10A fueron utilizadas para demostrar la combinación de la cicatrización análisis y proyección de imagen para estudiar el papel de TIP60 en migración celular con células vivas. El agotamiento de los TIP60 resultados en habilidades de aumento de la migración de células MCF10A.

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Protocolo

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1. preparación

  1. Preparar medio de cultivo MCF10A: modificado Eagle Medium (DMEM de Dulbecco) F12 (1:1) con 5% caballo suero 20 ng/mL del factor de crecimiento epitelial, hidrocortisona 0.5 mg/mL, la toxina del cólera 100 ng/mL e insulina de 10 μg/mL.
  2. Preparar medio libre de suero: DMEM/F12 (1:1) con 20 ng/mL del factor de crecimiento epitelial, hidrocortisona 0.5 mg/mL, la toxina del cólera 100 ng/mL e insulina de 10 μg/mL.
  3. Utilice la siguiente secuencia de siRNA:
    siControl:
    Forward: 5'-CGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT-3'
    Reverso: 5'-UCGAAGUAUUCCGCGUACGdTdT-3'
    siTIP60:
    Forward: 5'-UGAUCGAGUUCAGCUAUGAdTdT-3'
    Reverso: 5'-UCAUAGCUGAACUCGAUCAdTdT-3'
  4. Utilice platos de cultivo celular de 10 cm y placas de 24 pocillos.

2. transitorio agotamiento del siRNA usando TIP60

  1. El día 1, alícuotas de 15 μl de reactivo de transfección (p. ej., Lipofectamine RNAiMAX) y 2 mL de reducción medio de suero (por ejemplo, Opti-MEM) y mezclan con 10 μl de cada siRNA (10 μm de valores), respectivamente.
  2. Incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 20 minutos.
  3. 1 x 106 MCF10A células junto con 3 mL de medio de cultivo en un plato de 10 cm de la semilla. Contar las células usando un hemocitómetro.
  4. Agregar la mezcla de siRNA gota a gota en el plato de 10 cm.
  5. Agite el plato para asegurarse de que las células se distribuyen igualmente antes de poner en la incubadora de 37 ° C.
  6. Después de 6 h de incubación, sustituir el medio que contiene siRNA con 8 mL de medio de cultivo fresco.
  7. Día 2, preparar otra tanda de mezclas de siRNA e incubar a temperatura ambiente durante 20 minutos.
  8. Aspire a 8 mL de medio de cultivo añadido el día 1 y reemplazarlo con 3 mL de medio de cultivo fresco.
  9. Añadir el segundo lote de la mezcla de siRNA a los platos gota a gota. Agite los platos para asegurar que los reactivos se mezclan completamente antes de ponerlos en la incubadora.
  10. Después de 6 h, sustituir el medio que contiene siRNA con 8 mL de medio de cultivo fresco.

3. semillas células para el ensayo de cicatrización

  1. El día 3, deseche el medio y las células una vez con 2 mL de tampón fosfato salino (PBS) tampón de lavado. Desechar el tampón de PBS.
  2. Trypsinize las células tratadas con siTIP60 y siControl añadiendo 1 mL de 1 x de buffer de tripsina-EDTA a la placa. Vuelva a colocarlo en la incubadora durante 20 minutos.
  3. Añadir 4 mL de medio de cultivo completo a cada plato, resuspender las células mediante pipeteo y transferirlos a un tubo de 15 mL.
  4. Centrifugue a 200 g durante 5 minutos y retirar el sobrenadante.
  5. Resuspenda las células con 5 mL de medio sin suero y contar las células usando un hemocitómetro.
  6. Preparar una suspensión de 6 x 105 células/mL de siControl y siTIP60; Asegúrese de que las células estén bien mezcladas. Añadir 500 μl de la suspensión celular a un pozo de una placa de 24 pocillos para garantizar 100% de confluencia. Semillas 5 a 6 pozos cada siControl y siTIP60.
  7. Agitar suavemente la placa hacia adelante y hacia atrás y lateralmente para asegurar incluso la distribución. Evitar un movimiento circular. Dejar la placa en la incubadora durante 24 h.
  8. Las células restantes para comprobar la eficacia de la precipitación de TIP60 de la cosecha. Para ello, centrifugar la suspensión de células restantes a 200 g durante 5 minutos y retirar el sobrenadante.
  9. Aislar RNA usando un reactivo comercial, siguiendo el protocolo del fabricante y proceder a la polimerización en cadena cuantitativa en tiempo real para evaluar la eficacia de la precipitación.

4. crear la herida

  1. Ver bajo un microscopio de contraste de fase para asegurar que las células están completamente contactadas. Observar las células bajo el microscopio (4 X, 10 X y 20 aumentos) para asegurar que las células se unen totalmente que ha formado una monocapa confluente de células.
    Nota: las células siControl generalmente fije mejor que las células siTIP60. Se espera porque el agotamiento de TIP60 hace que las células mesenquimales como mas20. Aquí, se utiliza un microscopio de contraste de fase de luz blanca de mesa normal.
  2. Para generar la herida, raye suavemente una línea recta por el centro del pozo con una pipeta de 200 μL; la longitud de la herida generada es igual que el diámetro del pozo. Repita este paso para todos los pozos restantes. Utilice una nueva pipeta para cada pozo.
  3. Suavemente Lave bien cada uno 5 veces con suero medio para eliminar las células separadas.
  4. Añadir 1 mL de medio sin suero a cada pozo y proceder a la proyección de imagen de células vivas.

5. configuración de las imágenes de células vivas

  1. Encienda el microscopio y la temperatura de control al menos 1 h antes de configurar células vivas imágenes para asegurar que la temperatura en la cámara alcanza los 37 ° C.
  2. Encienda el suministro de gas de dióxido de carbono (CO2) antes de iniciar la proyección de imagen de células vivas. Fijar el CO2 concentración al 5%.
  3. Coloque la placa de 24 pocillos sobre la platina del microscopio y seleccione el objetivo con 10 aumentos para la proyección de imagen. Directa de la luz emitida a los oculares en vez de la cámara y ajustar el enfoque para localizar la herida y las células alrededor de él.
    Nota: en este caso, se utilizó luz blanca con contraste de fases.
  4. Utilice un sistema observador de células vivas para marcar la posición de la herida en cada pozo.
    Nota: La etapa automatizada del sistema de proyección de imagen de células vivas permite la adquisición de imágenes en múltiples posiciones. Imágenes son tomadas en cada posición marcada una vez cada intervalo.
  5. Establecer la condición de tiempo: 1 h intervalo y duración 72 h; Según esta configuración, el sistema tomará fotos en cada posición marcada cada hora durante 72 h. configurar cualquier intervalo de tiempo deseado y período de seguimiento.
    Nota: Aquí, una duración de 72 horas es mejor ya que estas células empiezan a morir después de 72 h en medio libre de suero.

6. seguimiento de movimiento de unicelular

  1. Exportar los datos después de 72 h. exportar los datos como imágenes en formato JPEG y vídeos en formato AVI.
    Nota: Esto es importante porque el software ImageJ puede reconocer solamente vídeos en formato AVI. Las velocidades de migración diferentes célula entre las células siTIP60 y siControl pueden observarse claramente en el video.
  2. Abrir el video AVI en el software ImageJ.
  3. Abrir el plugin de MTrackJ (el plugin debe ser descargado e instalado por separado): Plugins > MtrackJ.
  4. Añadir una pista para las células elegido en el video haciendo clic en la opción "Agregar" en la barra de herramientas de MtrackJ. Seleccione una celda en el extremo del frente del invasor y una célula que puede migrar por cuenta propia (migración unicelular). Seguir el movimiento de las células solicitadas en el video y trazarlos usando MtrackJ.
  5. Medir la distancia de movimiento haciendo clic en la pestaña de "medida" en la barra de herramientas.
    Nota: Aquí, casi no hay células en el siControl movido como las células, lo que dificulta medir sola célula movimiento, considerando que muchas de las células siTIP60 se trasladó como células individuales. Sin embargo, el movimiento de células situadas en el frente invasor puede todavía remontar y calcula en células siControl y siTIP60.
  6. Guardar el vídeo con las pistas en formato AVI.

7. cuantificación de la capacidad de la migración celular

  1. Para la cuantificación, seleccione imágenes en 0 h y h "n", donde "n" se refiere al punto de tiempo cuando las células siTIP60 o siControl han cerrado totalmente la herida.
    Nota: Aquí, 48 h fue elegido, como las heridas en las células siTIP60 se cerraron casi por completo.
  2. Cuantificar la migración por ciento con ImageJ utilizando la siguiente fórmula: (área de la herida a las 0 h - zona de la herida en "n" h) / área de la herida 0 h x 100.

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Resultados

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Esquema general del ensayo de migración de células vivas basadas en la proyección de imagen de células
Figura 1A es un esquema de este protocolo. MCF10A células transfected con siControl demostrada morfología epitelial típica. Después de la depleción de TIP60, células MCF10A eran más mesenquimales comparado a las células control (figura 1B).

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Discusión

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Se sabe que en el proceso de migración de la célula, las células pueden cualquiera movimiento en forma de fichas de adherentes; racimos flojos; o células individuales, aisladas. El modo y la dinámica de invasión celular pueden variar de un estado a otro, y el fenotipo puede cambiar dentro de las horas. El ensayo de cicatrización tradicional se basa en fotografías instantáneas de un microscopio con un intervalo de tiempo, tales como de 12 o 24 horas. Esto hace difícil de capturar la dinámica de cierre de la herida y el pa...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos a los miembros del laboratorio Jai por su útil discusión y comentarios. S.J. fue apoyado por subvenciones de la Fundación Nacional de investigación de Singapur y el Ministerio de Educación de Singapur en sus centros de investigación de la iniciativa de excelencia al cáncer la ciencia Instituto de Singapur (R-713-006-014-271), los médicos nacionales Consejo de investigación (CBRG-NIG; BNIG11nov001 y CS-IRG; R-713-000-162-511), el fondo de investigación del Ministerio de Educación (MOE AcRF nivel 1 T1-2012 Oct -04). Y.Z. G.S.C. y C.Y.T. fueron apoyados por una beca de postgrado otorgada por el Instituto de ciencia cáncer de Singapur, Universidad Nacional de Singapur.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Célula MCF10AATCCCRL-10317TMCélula epitelial de mama
Medios DMEM/F12 (1:1)Gibco11330-032 Medios decultivo MCF10A
Factor de crecimiento epitelial (EGF)PeprotechAF-100-15Suplementos para medios de cultivo MCF10A Toxina
cóleraSigma-AldrichC-8052Suplementos para medios
de cultivo MCF10AHidrocortisonaSigma-AldrichH-0888Suplementos para medios de cultivo MCF10A
InsulinaSigma-AldrichI-1882Suplementos para medios de cultivo MCF10A
Suero domésticoGibco16050-122Suplementos para medios de cultivo MCF10A
TripsinaGibco25200-056para MCF10A desprender de la placa
HemacitómetroFisher Scientific267110Para célula de recuento
Opti-MEM medios de suero reducidosGibco31985-070Para mezcla de siRNA
Lipofectamine RNAiMAXInvitrogen/Life Technologies56532Reactivo Transfect
Reactivo TrizolInvitrogen/Life Technologies15596-026Para extracción de ARNm
iScript Kit de síntesis de ADNcBio-Rad170-8891Para ADNc generación
iTaq Universal SYBR Green SupermixBio-Rad172-5125Para qPCR en tiempo real
7500 Sistema de PCR rápido en tiempo realBiosystemsMecanismo de qPCR en tiempo real
Plato de 10 cmGreiner bio-one664160Para experimento de derribo
placa de 24 pocillosCellstar662160Para ensayo de cicatrización de heridas
siControl siRNASelf diseñadopor propioCGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT
siTIP60 siRNAAutodiseñadoDiseño propioUGAUCGAGUUCAGCUAUGAdTdT
Observador de células vivasZeissZeiss Observador de células invertidas para experimentos con células vivas
del

Referencias

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