El pez cebra es un popular modelo animal para estudiar mecanismos de degeneración/regeneración retiniana en vertebrados. Este protocolo describe un método para inducir lesiones localizadas interrumpir la retina externa con mínimo daño a la retina interna. Posteriormente, hacemos un seguimiento en vivo la morfología retiniana y la respuesta de la glía de Müller durante la regeneración retiniana.
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Artículo de método
Activación de la célula de Müller glía en un modelo de regeneración en el pez cebra y degeneración retiniana inducida por láser
En este artículo
Resumen
Resumen
Una fascinante diferencia entre Teleosteos y mamíferos es el potencial de toda la vida de lo teleósteos retina retina neurogénesis y regeneración después de daño severo. Investigar los caminos de la regeneración en el pez cebra podría traer nuevas ideas para desarrollar estrategias innovadoras para el tratamiento de enfermedades degenerativas de la retina en los mamíferos. En este documento, nos centramos en la inducción de una lesión focal en la retina externa en pez cebra adulto por medio de un láser de diodo de 532 nm. Una lesión localizada permite investigar los procesos biológicos que tienen lugar durante la degeneración retiniana y regeneración directamente en el área de daño. Usando la tomografía de coherencia óptica no invasivos (OCT), hemos sido capaces de definir la ubicación de la regeneración posterior área y monitor dañada en vivo. De hecho, la proyección de imagen OCT produce imágenes de alta resolución, transversales de la retina de pez cebra, proporcionando información que antes sólo estaba disponible con análisis histológicos. Para confirmar los datos de OCT en tiempo real, se realizaron cortes histológicos y la respuesta regenerativa después de la inducción de la lesión retiniana fue investigado por immunohistochemistry.
Introducción
La visión es probablemente el sentido más esencial del ser humano y su deficiencia tiene un alto impacto socio-económico. En el mundo industrializado, enfermedades degenerativas de la retina responsables de la mayoría de la pérdida de la visión y ceguera entre la población adulta1. Retinitis pigmentosa (RP) es la causa hereditaria más común de ceguera en personas entre las edades de 20 y 60 años, que afecta a aproximadamente 1,5 millones de personas en todo el mundo2,3. Es una familia heterogénea de enfermedades hereditarias de retinales caracterizada por la pérdida progresiva de los fo....
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Protocolo
todos los experimentos se adhirió a la declaración para el uso de animales en investigación de visión de la Asociación para la investigación en visión y Oftalmología (ARVO) y oftálmica y respetar las normas relacionadas de las autoridades gubernamentales.
1. animales
- TgBAC mantener (gfap:gfap-GFP) pez cebra 167 tensión de (AB) de edades comprendidas entre 6-9 meses en condiciones normales en el agua con una temperatura de 26,5 ° C y 14/10 h luz/oscuridad 18.
- Siga las pautas de cuidado de los animales de las instituciones involucradas para los experimentos con animales después de la aprobación p....
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Resultados
OCT en tiempo real: para analizar el papel de MCs en reparación retiniana, utilizamos un modelo de lesión láser induce una zona bien delimitada de daño en la retina de pez cebra. El sitio de daño era reflejado por medio de OCT en vivo por primera vez (día 0) en 60 minutos después de la lesión (figura 3). Para compensar la óptica del ojo de pescado, una lente de contacto a medida se puso en la córnea. Inmediatamente después del tratam.......
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Discusión
Regeneración, degeneración retiniana en el pez cebra ha sido investigada por diferentes enfoques como de muerte celular mediada por la citotoxina22, lesión mecánica23y lesiones térmicas24. Se empleó un 532 nm diodo láser para dañar la retina de pez cebra. Por lo tanto, nuestro modelo ofrece varias ventajas. Por ejemplo, creamos rápidamente un área bien definida de lesión localizada en la retina externa, específicamente en la capa de PRs. Además, este.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos a Martin Zinkernagel, MD, PhD y Miriam Reisenhofer, PhD por su aportación científica a establecer el modelo y Federica Bisignani su excelente asistencia técnica.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Solución ácida de hematoxilina | Sigma-Aldrich, Buchs, Suiza | 2852 | |
| Albúmina | Sigma-Aldrich, Buchs, Suiza | A07030 | |
| Albúmina sérica bovina (BSA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Suiza | 5470 | |
| Dako Pen | Dako, Glostrup, Danmark | S2002 | |
| Medio de montaje DAPI | Vector Labs, Burlingame, CA, EE. UU. | H-1200 | |
| Eosina G solución acuosa 0.5% | Carl Roth, Arlesheim, Suiza | X883.2 | |
| Etanol | Sigma-Aldrich, Buchs, Suiza | 2860 | |
| Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Suiza | ED | |
| Eukitt | Sigma-Aldrich, Buchs, Suiza | 3989 | |
| Cabra anti-conejo IgG H& L Alexa Fluor® 488 | Life Technologies, Zug, Suiza | A11008 | |
| IgG antiratón de cabra H& L Alexa Fluor® 594 | Life Technologies, Zug, Suiza | A11020 | |
| Suero normal de cabra | Dako, Glostrup, Danmark | X0907 | |
| Lente de contacto de hidrogel | Johnson & Johnson AG, Zug, Suiza | n.a.1-Day | Acuvue |
| Hidroxipropilmetilcelulosa húmeda 2% | OmniVision, Neuhausen, Suiza | n.a.Methocel | 2% |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich, Buchs, Suiza | A5040 | Tricaína, MS-222 |
| Visulas 532s | Carl Zeiss Meditec AG, Oberkochen, Alemania | n.a.532 | nm |
| láser Ratón anticuerpo monoclonal anti-GS | Millipore, Billerica, MA, EE. UU | MAB302 | |
| HRA + OCT | Heidelberg Engineering, Heidelberg, Alemania | n.a.Spectralis | |
| Heidelberg Eye Explorer | Heidelberg Engineering, Heidelberg, Alemania | n.a.Versión | 1.9.10.0 |
| Paraformaldehído (PFA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Suiza | P5368 | |
| Solución salina tamponada con fosfato (PBS) | Sigma-Aldrich, Buchs, Suiza | P5368 | |
| Anticuerpo policlonal anti-GFAP para conejos | Invitrogen, Waltham, MA, EE. UU | 180063 | |
| Soporte de alfileres de silicona | Huco Vision AG Switzerland | n.a.Cortado | a mano a partir de la estera de silicona de la bandeja de esterilización en consecuencia. |
| Lámpara de hendidura BM900 | Haag-Streit AG, Koeniz, Suiza | n.a.Adaptador | |
| lámpara de hendidura | Iridex Corp., Mountain View, CA, EE.UU | N.A.Portaobjetos | |
| de vidrio Superfrost Plus | Gehard Menzel GmbH, Braunschweig, Alemania | 10149870 | |
| TgBAC (gfap:gfap-GFP) zf167 (AB) strain | KIT, Karlsruhe, Alemania | 15204 | http://zfin.org/ZDB-ALT-100308-3 |
| Solución salina tamponada Tris (TBS) | Sigma-Aldrich, Buchs, Suiza | P5912 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich, Buchs, Suiza | P1379 | |
| 78D lente de lámpara de hendidura sin contacto | Volk Optical, Mentor, OH, EE. UU. | V78C | |
| Xileno | Sigma-Aldrich, Buchs, Suiza | 534056 | |
| Lente láser de fondo de ojo | Ocular Instruments, Bellevue, WA, EE. UU. | OFA2-0 | |
| 2100 Retriever | Aptum Biologics Ltd., Southampton, Reino Unido | R2100-EU | Vapor |
Referencias
- Haddad, S., Chen, C. A., Santangelo, S. L., Seddon, J. M. The genetics of age-related macular degeneration: a review of progress to date. Surv. Ophthalmol. 51 (4), 316-363 (2006).
- Stefano Ferrari, S., Di Iorio, E., Barbaro, V., Ponzin, D., Sorrentino, F. S., Parmeggiani, F. Retin....
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Reimpresiones y permisos
