Method Article

Aplicación de Micro-la irradiación del Laser para la examinación de Single y doble filamento romper reparación en células de mamíferos

DOI:

10.3791/56265

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September 5th, 2017

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1Department of Oncologic Sciences, University of South Alabama Mitchell Cancer Institute

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Confocal de la fluorescencia microscopía láser micro-irradiación oferta herramientas y para inducir daño en el ADN y control de la respuesta de proteínas de reparación del ADN en áreas seleccionadas de las nucleares. Esta técnica ha avanzado significativamente nuestro conocimiento de detección de daño, las señales y reclutamiento. Este manuscrito muestra estas tecnologías para examinar reparación de rotura de filamento solo y doble.

Abstract

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Vías de reparación del ADN altamente coordinadas existen para detectar, suprimir y reemplazar dañado DNA bases y coordinar la reparación de roturas del filamento de ADN. Mientras que las técnicas de biología molecular han aclarado la estructura, funciones enzimáticas y cinética de las proteínas de reparación, todavía hay una necesidad de comprender cómo es coordinada dentro del núcleo. Micro-la irradiación del laser ofrece una poderosa herramienta para inducir daño al ADN y supervisar el reclutamiento de proteínas de reparación. Inducción de daño al DNA por micro-la irradiación del laser puede ocurrir con una gama de longitudes de onda, y los usuarios pueden inducir confiablemente solo filamento se rompe, las lesiones de la base y doble filamento se rompe con un rango de dosis. Aquí, micro-la irradiación del laser se utiliza para examinar la reparación de single y doble strand breaks inducidas por dos longitudes comunes de láser confocal, 355 nm y 405 nm. Se describe otra, correcta caracterización de la dosis de láser aplicada para la inducción de mezclas de daño específico, por lo que los usuarios pueden realizar reproducible adquisición de datos de micro-irradiación de láser y análisis.

Introduction

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Microscopía fluorescente se ha convertido en una técnica poderosa para visualizar la arquitectura celular, examinar la localización de la proteína y monitorear las interacciones proteína-proteína y proteína-DNA. Usando microscopia fluorescente para estudiar las respuestas de daño de ADN después de la aplicación del ADN global dañando agentes como luz ultravioleta (UV), radiación ionizante, oxidantes químicos o agentes alquilantes y quimioterapia ha proporcionado una nueva visión la iniciación, la señalización y la captación de ADN reparación de proteínas a los sitios de daño de DNA1,2. Sin embargo, estos global y dañar eventos asincrónicos están limitando, si información detallada sobre la orden de reclutamiento, cinética de asociación o disociación, y se buscan las relaciones entre proteínas clave de reparación de ADN. Afortunadamente, los avances en microscopios confocales de escaneo láser, amplia disponibilidad de inducir daño longitudes de onda láser y mejoras en proteínas fluorescentes en los últimos 25 años han proporcionado los investigadores con herramientas mejoradas para examinar estos aspectos de ADN reparación, a través de la inducción de daño de ADN específica.

Irradiación de células con microhaces de láser para estudiar las funciones celulares y subcelulares es una herramienta bien establecida en la biología de célula y radiación3. Aplicación de esta técnica al estudio de la reparación del ADN surgió cuando Cremer y colaboradores utilizan UV altamente enfocado (257 nm) sistema de microhaz láser para inducir daño de la DNA sobre un 0.5 μm en ovario de hámster chino (CHO) las células4 y estableció la inducción de Photolesions de ADN por este sistema5. Mientras que ofrece mejoras significativas sobre métodos de microhaz de UV en el tiempo, la adopción de este daño a sistema fue limitado debido a su configuración especializada y su incapacidad para generar doble cadena rompe (distritales)6. La investigación subsecuente de una variedad de UV-B (290-320 nm) y UV-A longitudes de onda (320-400 nm) por un número de grupos revelaron que photoproducts de UV, oxidativos basan de lesiones, solo filamento rompe (SSBs), y distritales podrían ser inducidas depende de la longitud de onda de láser y energía aplicada4,7,8,9,10 (revisado en 3). Además, combinaciones de estos rayos UV-B y UV A longitudes de onda con la sensibilización de los agentes, como psoralen, bromodeoxiuridina (BrdU) y colorantes Hoechst, también fueron encontrados para inducir daño en el ADN depende de la longitud de onda, potencia y duración de la exposición, aunque el poder necesario para inducir daño a menudo se reduce en presencia de estos agentes11,12,13,14,15. Estos avances expandió el uso de micro-irradiación, aunque había cañizos técnicos todavía a abordar para la adopción más amplia de estos métodos.

Cremer y colaboradores avanzaron significativamente el campo de la micro-irradiación concentrándose precisamente el microhaz UV para aplicar energía dañina sobre un área muy localizada en la célula. Como sistemas de Microdisección láser y microscopios confocales avanzaron, bien enfocada la luz fue más ampliamente accesible; sin embargo, acoplamiento de fuentes de UV a ámbitos y hacer frente a las aberraciones cromáticas que indujo todavía presentan importantes desafíos a más usuarios3,6,16. Como tintes UV aumentaron en popularidad a lo largo de la década de 1990, óptica capaz de enfocarse y captura fluorescencia UV-emocionado se convirtió más ampliamente disponibles16, y mejoras en el escaneo láser ofrecieron los usuarios la habilidad de crear altamente enfocado UV puntos de excitación dentro de las células6,17. Sin embargo, no fue hasta la década de 2000 que se sintió el impacto real de esta combinación de vigas firmemente enfocadas con láseres de intensidad mayor, cuando numerosos informes demostrando que se podían inducir roturas del filamento de ADN con y sin sensibilizadores en la Rango UV-A6,10,18,19,20, 405 nm21,22,23,24, 25,26e incluso en más visibles longitudes de onda como 488 nm27. Estos avances permitidos la adopción más generalizada de la técnica de micro-irradiación en un número de sistemas comerciales. Paralelamente a estos desarrollos, técnicas de dos fotones, también surgieron que precisa inducción de daño del ADN; Aunque estos avances no se discutirán aquí, hay una serie de artículos de revisión sobre estas metodologías9,28,29,30.

Con la accesibilidad actual de microscopios confocales capaces de ofrecer luz UV altamente focalizada y la disponibilidad extensa de proteínas fluorescentes para permitir el seguimiento en tiempo real de proteínas de reparación del ADN, se han convertido en técnicas de micro-irradiación potentes herramientas para examinar vías de respuesta y reparación del daño de ADN. Sin embargo, los usuarios necesitan ser conscientes de que la generación de daños en el ADN es altamente dependiente en la longitud de onda del láser y la tensión en la región sub nuclear. Uso de UV-C (~ 260 nm) longitudes de onda permiten la excitación directa del DNA y alta selectividad para la inducción de UV photoproducts7,8. UV-B y UV A longitudes de onda producen mezclas de daño en el ADN (lesión base SSBs y distritales), depende de la potencia aplicada y el fondo celular utilizado7. Photosensitizers endógenos y los niveles de antioxidantes en las células apuntadas pueden influir en las mezclas de daño de ADN producidas por estas longitudes de onda. Además, el uso de exógenos photosensitizers (BrdU, etc.) puede ayudar a reducir la energía necesaria para la inducción de daño en el ADN. Sin embargo, estos agentes pueden inducir daño en el ADN por sí mismos, y puede alterar el ciclo celular y la estructura de la cromatina, por lo que su uso puede producir efectos no deseados que deben ser considerados por el usuario. Por lo tanto, antes de usar micro-irradiación para el estudio de reparación y respuesta del daño de ADN, cuidadosa de la vía de reparación del ADN de interés, las longitudes de onda disponibles para su uso y la mezcla de daño de ADN creado es necesario.

Aquí, micro-la irradiación del laser se realiza en dos longitudes de onda utilizadas, 355 nm y 405 nm, sin sensibilizadores para demostrar las mezclas de lesión del ADN inducida por estas longitudes de onda y las influencias que estas mezclas de daños tienen en el examen de la reparación deSSBs y distritales. los usuarios deben ser conscientes que estas longitudes de onda no creen una sola especie de filamento se rompe o lesiones de la base. Para discriminar entre vías de reparación del ADN, los usuarios deben cuidadosamente controlar la potencia aplicada sobre una región específica del núcleo y caracterizar el daño inducido con múltiples marcadores de rotura del filamento y anticuerpos de lesión del DNA. Si bien aplicado y caracterizado, micro-la irradiación del laser puede enriquecer algunas especies de daño de la DNA, permitiendo a los usuarios evaluar la reparación de lesiones de base y SSBs o distritales, con cierta especificidad. Por lo tanto, hemos proporcionado un método que permite a los usuarios realizar micro-la irradiación del laser reproducible, caracterizan las mezclas de daño de ADN inducidas por la dosis de láser aplicada y realizar análisis de datos.

Protocol

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1. cultivo de células y la generación de células estables

  1. células CHO-K1 crecer en medio mínimo esencial suplementado con suero bovino fetal 10%. Mantener las células en una incubadora humidificada con 5% CO 2 a 37 ° C.
  2. CHO-K1 transfectar las células con 1 μg de ADN de plásmido que contiene humano XRCC1 con un C-terminal verde etiqueta de la proteína fluorescente (GFP) usando un reactivo de transfección comercial siguiendo el fabricante ' instrucciones s.
  3. CHO-K1 selecciona células estable expresan la fusión de GFP XRCC1 humana usando 800 μg/mL geneticin y enriquecer la población expresa GFP XRCC1 usando fluorescencia asistida celular clasificación (FACS).
  4. Las células de la placa al ser micro-irradiado en recipientes de cultivo con fondos de cubreobjetos, por lo que alcanzan aproximadamente el 75% o confluencia mayor al día siguiente. Algunos espacios entre las células son deseables, especialmente si utiliza registro para volver al campo mismo de la imagen (descrito en la sección 3.2).

2. Configuración del microscopio

  1. seleccionar un sistema de escaneo láser confocal microscopio equipado con convenientes láseres y óptica y software de control para micro-irradiación/fotoestimulación. Presenta experimentos uso un laser microscopio confocal que ha sido modificado para incluir un 355 nm láser, fibra-juntado a un miniscanner de fotoactivación del galvanómetro y controlar con el fabricante ' software de control y análisis. Este sistema puede realizar micro-irradiación en una región designada por el usuario de interés (ROI) mediante la miniscanner de fotoactivación (láser de 355 nm) o el estándar galvanómetro confocal (405 nm láser).
  2. Seleccionar la longitud de onda para micro-irradiación, asegurando que todos los componentes ópticos en el micro-irradiación lightpath son adecuados para la longitud de onda solicitada.
    Nota: El sistema presentado utiliza un objetivo de inmersión de aceite de 40 × C-Apochromat (apertura numérica (NA) 1.2) junto con un cubo de filtro UV para micro-irradiación de 355 nm y un objetivo seco de 20 × C-Apochromat (NA 0.75), usando el estándar lightpath confocal para micro-irradiación de 405 nm. El objetivo de × 20 utilizado en el programa de instalación no es compatible con la longitud de onda nm 355; por lo tanto, se utilizó el × 40 de 355 nm solamente. Usando el objetivo seco de daños permite protocolos de inmunofluorescencia aplicar aguas abajo sin limpieza de aceite de inmersión, que es por eso que utilizamos este objetivo siempre que sea posible.
  3. Configurar el microscopio para el experimento de micro-irradiación. Para mantener la coherencia entre experimentos, designar una configuración estándar de los componentes del microscopio a utilizar para cada tipo de micro-irradiación. Guardar estos ajustes como un ajuste preestablecido en el microscopio ' s operativo software, si es posible.
    Nota: En el sistema presentado, las células son irradiadas por micro y reflejada usando análisis unidireccional, resolución de 1024 x 1024 píxeles con 1 x y zoom de exploración, exploración a una velocidad de 8 fotogramas por segundo (fps) y con el poro a aproximadamente 4 unidades luminosas (AU), como determinado para el láser de 488 nm (69 μm). Este ajuste del agujero de alfiler abierto fue elegido para maximizar la cantidad de luz capturada en cada imagen, permitiendo el uso de imágenes láser poderes inferiores y la reducción de fotoblanqueo.

3. Láser micro-irradiación

plato de cultura
  1. lugar los preparados, que contienen las células de interés, en la platina del microscopio y ajústelos firmemente en su lugar.
    1. Si está disponible, colocar cámara diapositiva en una incubadora de la etapa superior y mantener a 37 ° C con 5% CO 2 durante la inducción de daño. Este paso es muy importante para las células vivas timelapse de imágenes o imágenes largas sesiones. De lo contrario lugar células en el microscopio de la etapa y realizar irradiación a temperatura ambiente (~ 25 ° c) y luego volver rápidamente las células en una incubadora a 37 ° C con 5% CO 2.
  2. Registro de campos de la imagen para permitir que el investigador volver a la misma ubicación después de realizar la fijación, tinción u otros procedimientos. Realizar registro de los campos dañados usando una platina del microscopio codificado, automatizado o recipientes de cubreobjetos de cultivo con una cuadrícula grabada o marcada de puntos XY de la célula.
    1. Si usando el software registro de imagen, seleccione una característica reconocible de la vasija de la cultura (es decir, la esquina del cubreobjetos o barrera entre pozos), recoger una imagen y grabar la ubicación XY. Esto permitirá la alineación y el registro de las ubicaciones de XY de campos seleccionados tras preparación de la muestra.
    2. Si utiliza el registro manual, registrar rejilla o ubicaciones grabadas para cada campo manualmente, teniendo cuidado de registrar la orientación y la colocación del plato en el escenario.
    3. Si no hay señas de los recipientes de cultivo celular están disponibles, identificar campos dañados por inspección visual de la morfología celular y densidad. Tenga cuidado de seleccionar campos con características lo suficientemente distintas para ser reconocibles en imágenes más adelante.
      Nota: Esto puede ser desperdiciador de tiempo para llevar a cabo a menos que la orientación y el área de la nave de cultura está estrechamente restringida.
  3. Seleccionar un campo para micro-irradiación y enfocar la muestra. Para las células que expresan proteínas fluorescencia marcadas, seleccione el plano focal de la máxima sección nuclear en el canal de fluorescente de interés. Para que las células no expresan etiquetado proteínas, o para aquellos sin localización nuclear claro, contraste de fase o interferencia diferencial (DIC) de contraste la proyección de imagen puede utilizarse para encontrar el plano focal correcta.
    ​ Nota: una característica útil de contraste de fases y la proyección de imagen de DIC es el hecho de que, como el plano focal se desplaza a través de la muestra, la misma característica puede aparecer claro u oscuro dependiendo del plano focal relativa.
    1. Selecciona una función clara dentro del núcleo, como un nucleolo y el plano focal hacia arriba y hacia abajo mientras observa este cambio en la apariencia. El verdadero plano focal se acuesta dentro de la transición de luz a oscuridad. Para enfocar la muestra, seleccione el plano focal en el cual la función seleccionada tiene el más agudo contraste.
  4. Registrar la posición del campo de interés. Crea un cuadrado de 3 x 3 píxeles ROI dentro del software del microscopio, coloque este ROI sobre el núcleo de una célula a dañarse y establezca este ROI ser daño ROI.
  5. Recoge una imagen de los daño, incluyendo la posición del daño ROI.
    1. Para experimentos que no utilizan las proteínas fluorescentes, adquirir una fase-ponga en contraste o diferencial de interferencia (DIC) brightfield imagen identificar y registrar los núcleos de los daños.
    2. Para experimentos de células vivas mediante proteínas fluorescentes, adquirir una imagen que contiene brightfield y el canal de la fluorescencia de la proteína de interés (es decir, láser línea 488 nm para la excitación de GFP, láser línea 561 nm para la excitación de la RFP). En experimentos utilizando el CHO-K1 XRCC1-GFP, excitados por la línea de láser de 488 nm fluorescencia recogió simultáneamente con el canal de transmisión de brightfield DIC.
  6. Iniciar daños de láser.
    1. En el sistema presentado, control la dosis de láser por el tiempo total pasado escaneo el daño, el retorno de la inversión. Debido a que el galvanómetro para el 355 nm láser funciona a una velocidad de escaneo fijo, dosis de láser es controlado por el tiempo de exploración repetidamente los daños seleccionados ROI: los datos presentados aquí, micro-irradiación en 355 nm se realiza de 2 a 10 segundos.
    2. En cambio, la dosis de láser 405 nm de control modulando la frecuencia de barrido y realizar un análisis de los daños los ROI. En los datos pAquí se resintió, utilice 8 y fps 0,5 micro-irradiación a 405 nm. Una velocidad de lectura de 8 fps proporciona una dosis más baja de laser que 0,5 fps, porque el láser pasa menos tiempo en cada píxel durante la exploración. Ambos láseres funcionan al 100% de potencia. Ver sección 3.7 para obtener instrucciones sobre la medición de energía láser directamente.
      Nota: Cada sistema de microscopio individuales puede diferir en cómo energía del laser se entrega a un ROI designado, similar a cómo los 355 nm y 405 nm difieren en el sistema actual. Los usuarios tendrán que determinar este procedimiento para su sistema de microscopio y reportar estos parámetros dentro de sus secciones métodos.
    3. Para la proyección de imagen de células vivas, realizar timelapse adquisición de imágenes de canales brightfield y de fluorescencia. Ajustar la duración y frecuencia de lapso de tiempo para optimizar la recogida de datos, idealmente captura la acumulación de la proteína fluorescente en los daños ROI y su disociación a lo largo del tiempo del experimento. Experimentos usando GFP XRCC1 recogió imágenes cada 30 segundos durante 20 minutos.
      ​ Nota: la frecuencia de la proyección de imagen de lapso de tiempo puede ser limitada por photobleaching del fluoróforo, que complica el análisis de la acumulación y la disociación. Fotoblanqueo puede evaluarse observando células intactas durante el lapso de tiempo y ajustando las condiciones de adquisición para minimizar la pérdida de la señal fluorescente en estas células intactas. Algunos photobleaching puede ser inevitable, por lo que los usuarios pueden compensar la pérdida de señal por normalizar la intensidad fluorescente de células dañadas a las de las células intactas en cada fotograma de lo timelapse.
      1. Una vez finalizado el curso de tiempo, seleccione un nuevo campo de las células de los daños o reparar células dañadas para su posterior análisis, como se describe en la sección 4.
      2. Continuar micro-irradiación y lapso de tiempo hasta que se alcanza el número deseado de células dañadas de la proyección de imagen.
        ​ Nota: recomendamos dañando un total de 10-25 células por condición seleccionada para evaluar la heterogeneidad de célula a célula en respuesta al daño inducido. Aunque la mayoría de los sistemas confocales permite a los usuarios a dañar más de una célula durante la irradiación de cada micro, esto introduce tiempos de iniciación daño escalonadas, que pueden complicar el análisis de tiempo de reclutamiento máximo sobre un número grande de células o el tiempo de disociación para eventos rápidos. En algunos sistemas, inducción de daño simultáneo sobre varios ROIs puede reducir la dosis de láser recibida por cada ROI independiente. Por lo tanto, a menos que estas cuestiones de sincronización/alimentación están dirigidas directamente por el usuario, se recomienda que las células se daña individualmente.
    4. Para análisis por inmunofluorescencia (IF), realizar daños y o corregir inmediatamente las células, como se describe en sección 4, o permitir que las células para la reparación de las incrementos de tiempo (es decir, 1, 5, 10 o 20 min). Después de transcurrido el tiempo deseado, fijar y teñir las células, como se detalla en la sección 4.
      1. Para aumentar el número total de células para análisis si, dañar campos adicionales en el recipiente de cultivo para generar un curso de tiempo múltiples campos de la respuesta de daño posteriores. Anote la ubicación XY de cada campo y el momento en que se produjo el daño. Después de la total deseada transcurre el tiempo de reparación, fijar y teñir las células tal como se detalla a continuación.
  7. Después de observar de reclutamiento de la proteína en dosis seleccionadas, láser dosis medida e informe láser potencia los niveles posteriores de la fibra y después objetivo caracterizar con precisión y informe. Utilizamos un medidor de potencia digital compacto y dos cabezas del sensor fotodiodo diferentes; uno acoplado directamente a la fibra de láser para medir la salida de la fibra, y el otro colocado sobre la platina del microscopio para medir la salida de post-objective.
    1. Para medir la energía del laser, coloque el sensor en la configuración deseada (la fibra o post-objective) y realizar micro-irradiación como se describe anteriormente, durante la grabación de las mediciones efectuadas por el medidor de energía. Ten en cuenta que la frecuencia de muestreo de la central de medida puede no ser lo suficientemente rápida para capturar eventos de micro-irradiación muy rápidos, así que puede ser necesario ejecutar iteraciones múltiples del experimento para asegurar que el medidor de potencia detecta con precisión la dosis aplicada.
      Nota: Para el láser 355, medimos un promedio pico de potencia de fibra después de aproximadamente 5 mW y aproximadamente 19 MW posterior objetivo. Para los 405 nm láser, micro-irradiación fue realizada en lazos de 30 iteraciones para superar la tasa de muestreo máxima de 0,01 s del medidor de potencia y potencias de pico promedio de 1.5 mW y 2.4 mW fueron medidos utilizando velocidades de barrido de 0,5 y 8 fotogramas por segundo , respectivamente. Cada medidor de energía es diferente. Los usuarios tendrán que determinar la operacionales longitudes de onda y frecuencias de muestreo para su medidor de potencia individuales.

4. Procedimientos de tinción de inmunofluorescencia

  1. análisis inducción de rotura de filamento manchando de IF. Formaldehído
    1. fijar las células con 3,7% (PRECAUCIÓN) en fosfato tampón salino (PBS) para 10 minutos solución de formaldehído de aspirado y lavado 3 veces con PBS. El protocolo se puede detener aquí por poner PBS en las células y las células pueden almacenarse a 4 ° c hasta 1 semana.
      PRECAUCIÓN: El formaldehído es tóxico y cancerígeno. Use equipo de protección personal adecuado y disponer de la sustancia tóxica según las instrucciones de procedimientos institucionales de salud y seguridad ambientales.
    2. Permeabilizar las células usando 0.25% Tritón X-100 en PBS durante 10 minutos a temperatura ambiente (RT) y luego lavar 3 veces con PBS.
    3. Enlace con anticuerpos no específicos bloque por incubar durante 30 min en PBS con 1% albúmina sérica bovina (BSA) a TA.
    4. Incubar primaria del anticuerpo policlonal contra 53BP-1 diluido 1:750 en PBS con 1% de BSA durante 1 h a temperatura ambiente y luego lavar 3 veces con PBS y primaria monoclonal antibody contra γH2AX.
    5. Incubar las células con Alexa 488 cabra anti-ratón y Alexa 546 cabra anti-conejo tanto diluido 1: 2000 en PBS con 1% de BSA durante 1 h a temperatura ambiente y luego lavar 3 veces con PBS.
    6. Tinción de ADN nuclear con una solución de 10 mg/mL de DAPI (4 ', 6-Diamidino-2-Phenylindole, PRECAUCIÓN) diluido a 1: 5000 en PBS por 5 min, o tinte nuclear comparable de uso y luego lavar 3 veces con PBS.
      PRECAUCIÓN: DAPI es tóxico y mutágeno. Usar equipo de protección personal adecuado y eliminar la sustancia tóxica por procedimientos ambientales institucionales de la salud y seguridad.
    7. Lugar PBS o PBS + 0.1% de azida sódica (PRECAUCIÓN) en las células. Protocolo puede detenerse aquí y las células almacenaron a 4 ° c por varios días, o proceden a la adquisición de la imagen en la sección 5.
      ​ PRECAUCIÓN: azida sódica es tóxica. Usar equipo de protección personal adecuado y eliminar las sustancias tóxicas por procedimientos ambientales institucionales de la salud y seguridad.
  2. Analizar la inducción de lesiones de base o ADN aductos manchando de IF.
    1. Fijar y permeabilizar células en metanol helada (PRECAUCIÓN) por 20 min a -20 ° C.
      PRECAUCIÓN: El metanol es tóxico e inflamable. Usar equipo de protección personal adecuado y eliminar la sustancia tóxica por procedimientos ambientales institucionales de la salud y seguridad.
    2. Aspirar la methanol y permitir que la muestra se seque completamente durante 15 min protocolo puede detenerse aquí y células almacenadas a-20 ° c en seco hasta por 3 días.
    3. Rehidratar las células en PBS durante 15 min.
    4. Desnaturalizar el ADN usando ácido clorhídrico 2 N (PRECAUCIÓN) por 45 min a RT y lavado 3 veces con PBS.
      PRECAUCIÓN: el ácido clorhídrico es corrosivo. Usar equipo de protección personal adecuado y eliminar la sustancia corrosiva por procedimientos ambientales institucionales de la salud y seguridad.
    5. Neutralizar en 50 mM Tris-HCl de pH 8.8 durante 5 minutos seguido de 3 lavados con PBS.
    6. Incubar las células en solución amortiguadora de bloqueo hecho con suero de cabra normal 5% y 0,1% Tritón X-100 en PBS durante 1 h a TA.
    7. Incubar con anticuerpos primarios para la 8-oxo-2´-desoxiguanosina (8-oxodG, 1: 400) o dímero de pirimidina ciclobutano (CPD, 1:1, 000) en la cabra suero solución amortiguadora de bloqueo por 1 h a RT y luego lavar 3 veces con PBS.
    8. Incubar las células con Alexa 488 cabra anti-ratón en una proporción de 1: 2000 en la cabra suero solución amortiguadora de bloqueo durante 1 hora a temperatura ambiente y lavar 3 veces con PBS.
    9. Mancha ADN nuclear usando 1: 5000 DAPI (10 mg/mL) en PBS durante 5 minutos y lavar 3 veces con PBS.
    10. Si usando cámaras cubreobjetos, colocar PBS o PBS + 0.1% de azida de sodio en las células. Protocolo puede detenerse aquí y las células almacenaron a 4 ° c por varios días, o proceden a la adquisición de la imagen en la sección 5.
    11. Alternativamente, Monte las células en el medio de montaje preferido, si un cubreobjetos adicionales pueden colocarse en la parte superior del recipiente de la cultura. Una vez curado, las células montadas pueden almacenarse a 4 ° c durante largos periodos de tiempo.

5. Imagen de adquisición para los experimentos de inmunofluorescencia

  1. limpiar la parte inferior del cubreobjetos de la vasija de la cultura con etanol y colóquela sobre la platina del microscopio confocal. Asegúrese de que la orientación y posición del barco en el escenario corresponde a la orientación y posición registrada cuando se indujo daño. Garantizar el vaso de la cultura para asegurar el óptimo registro y proyección de imagen de.
  2. Campos de localización previamente reflejada mediante la técnica de registro seleccionan (descrita en 3.2).
    1. Para registro manual usando un cubreobjetos con una cuadrícula grabada, incorporar la rejilla de enfoque y encontrar marcas de identificación. Luego uso registrado coordenadas XY para localizar las células dañadas.
    2. Para registro automatizado basado en la imagen, busque la característica estructural usada como referencia en el paso 3.2.1 y luego alinear la vista de microscopio directo actual lo más cerca a la imagen grabada como sea posible. Una vez alineados, medir la ubicación actual de etapa de microscopio XY y compararlo con la situación de XY de la imagen de referencia. La distancia lineal entre las dos ubicaciones que define el desplazamiento X e Y. Este desplazamiento se aplican a cada ubicación XY registrada para identificar los campos de la imagen que contiene la celda irradiada. Esta función offset puede ser automatizada en el software de control de microscopio o ejecutar de forma manual.
    3. Si no hay puntos de registro apropiado podrían ser identificados, manualmente localizar células por exploración de la corredera y la localización de las características previamente identificadas de la célula.
  3. Adquirir imágenes con ajustes de microscopio apropiado para recoger objetivos todo manchados, incluyendo una imagen de brightfield (configuración en la sección 2.3 y centrándose en la sección 3.3). En los experimentos presentados, imágenes multicanales se recopilaron utilizando las siguientes líneas de láser de excitación y fluoróforos: 405 nm (DAPI), 488 nm (Alexa 488 y transmisión DIC brightfield) y 561 nm (Alexa 546). Todos los láser pasan a través de un único filtro sintonizable acusto-óptica control de la transmisión de láser longitud de onda y potencia.

6. Análisis de la imagen del celular del reclutamiento de proteínas fluorescentes a sitios irradiados micro en vivo

  1. abierto adquiere imágenes en una aplicación de análisis de imagen (es decir, elementos de NIS o ImageJ). Si es necesario, combinar la imagen de la irradiación con imágenes de lapso de tiempo para generar una secuencia de imágenes individuales de inducción de daño pre y post. Los usuarios pueden mostrar reclutamiento mediante la medición de cambios en la intensidad fluorescente sobre el área irradiada comparado con la intensidad de fluorescencia medida a través del núcleo entero (ver representante resultados figura 1 B. ).
  2. Para que cada celda que se medirá, en primer lugar generar una retorno de la inversión que representa el núcleo de referencia. Utilizar un algoritmo de umbral de la señal fluorescente que contiene los píxeles que componen el núcleo y luego convertir esta zona en un retorno de la inversión. Si es necesario, el ROI puede ser dibujado manualmente utilizando el brightfield como referencia. Ajustar el ROI en el transcurso del tiempo para el área nuclear está cubierto con precisión por el ROI y reportar la intensidad de fluorescencia media de la señal fluorescente dentro de este ROI para cada marco.
  3. Para cada celda medir crea un 6 x 6 píxeles ROI y colóquelo sobre el daño ROI para cada fotograma del curso del tiempo. Este retorno de la inversión más grande es ahora el daño ROI para el análisis. Informe de la intensidad de fluorescencia media de ROI para cada marco de.
    Nota: Software de análisis de imagen más comercial contiene módulos para el seguimiento del objeto en 2D, y hay una serie de macros de usuario desarrollado para ImageJ o FIJI que facilitan el flujo de trabajo más rápido y un mayor rendimiento (ver https://imagej.nih.gov/ij/plugins/).
  4. Normalizar la intensidad de fluorescencia media daño ROI al de referencia correspondiente ROI en cada fotograma de lo timelapse. Aquí, la intensidad media de fluorescencia nuclear se utiliza como la referencia ROI (véase representante resultados figura 1). normalización puede realizarse restando la referencia media intensidad de fluorescencia de ROI de la media intensidad de fluorescencia de ROI de dañar, o dividiendo la media daño ROI intensidad de fluorescencia por la referencia de media intensidad de fluorescencia de ROI.
    Nota: Normalización por división puede producir resultados impredecibles, si se utiliza en situaciones con valores de intensidad muy baja referencia.
  5. Repetir para todas las células dañadas, así como para el control de al menos dos, las células intactas. Resultados del control de la célula se pueden utilizar para más normalización, si es necesario.
  6. Gráfico normalizado a valores de intensidad con el tiempo a mostrar cambios en la dinámica de reclutamiento en función del tratamiento experimental.

7. Análisis de reclutamiento de la proteína detectado por inmunofluorescencia de imágenes

imágenes previas y post-daños
  1. abierto en una aplicación de análisis de imagen. Las imágenes de pre-daños contengan el daño ROI(s) utilizado para micro-irradiación. La ROI(s) de copiar y pegar en las imágenes de daños posteriores para identificar células apuntadas.
  2. Generar un pixel de 6 x 6 ROI para el análisis de reclutamiento de la proteína y colocar este retorno de la inversión en la ubicación de los daños, el retorno de la inversión. Este retorno de la inversión más grande es ahora el daño ROI para el análisis. Informe de los daños de media intensidad de fluorescencia de ROI.
  3. Normalizar la intensidad de fluorescencia media daño ROI al de referencia correspondiente ROI. Aquí, la intensidad media de fluorescencia nuclear de la célula dañada se utiliza como la referencia ROI (véase representante resultados figura 1). Generar la referencia ROI usando un algoritmo de umbral en la señal de la DAPI para definir el núcleo y después convertir esta zona en un retorno de la inversión. Informe de la referencia media intensidad de fluorescencia de ROI. Normalización puede realizarse restando la referencia media intensidad de fluorescencia de ROI de los daños de media intensidad de fluorescencia de ROI, o dividiendo el daño de media intensidad de fluorescencia de ROI por la referencia de media intensidad de fluorescencia de ROI.
    Nota: Normalización por división puede producir resultados impredecibles, si se utiliza en situaciones con valores de intensidad muy baja referencia.
  4. Repita para todas las células dañadas y realizar el mismo análisis en las células del control por lo menos dos, como se describe arriba.
  5. Gráfico normalizado a valores de intensidad para cada evento micro-irradiación mide contra el tiempo para mostrar cambios en el reclutamiento de proteínas o el tipo de daño de la DNA como una función de tratamiento experimental.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Caracterización del daño del ADN inducido
Inducción de lesiones de base y el filamento se rompe es dependiente de la dosis de láser aplicada al área nuclear seleccionada y el microambiente celular del modelo de celular utilizado7. Proteínas fluorescentes fundidas para reparar las proteínas, como la XRCC1, 53BP1, Ku70 o Rad51, proporcionar útil solo y doble filamento romper marcadores para establecer la energía mínima necesaria para ver la acumulación de una proteína fluorescente en un daño del ROI por encima del fluorescencia de fondo9,19,31. Una vez que se encuentran las condiciones que inducen una respuesta, es fundamental para caracterizar la mezcla de daño inducida por esa determinada longitud de onda y dosis. Atenuación de la dosis y la duración de la longitud de onda utilizada permite al usuario minimizar la formación de mezclas complejas de daño. Dosis de láser de baja en el rango UV-A se han demostrado para producir predominante SSBs y una pequeña cantidad de lesiones de base, adecuadas para el estudio de SSBR y BER vías10,28. Aumentar la dosis crea lesiones más complejas de base, oxidativas y UV inducida e induce a un número más significativo de distritales7,10. Mientras que la inducción de una sola especie de daño de la DNA es deseable para el examen de vías específicas de reparación de ADN, es más probable que los usuarios están induciendo una mezcla de lesiones del ADN, con una lesión específica como SSBs siendo mucho más frecuente que las lesiones de base o consejos escolares distritales. Esto es similar a las mezclas de daño de ADN inducidos por agentes químicos como el peróxido de hidrógeno (H2O2) o metil Metanosulfonato (MMS)32. Los usuarios deben ser conscientes cuando se reportan resultados que dañar mezclas de pueden ocurrir, y caracterización cuidadosa de las lesiones en el sitio de daño inducido y dosis son necesarias para garantizar la reproducibilidad y la comparabilidad de sus resultados.

En los estudios de micro-irradiación, XRCC1-GFP es utilizado como un marcador para la inducción de lesiones de base y SSBs9,28. XRCC1 es una proteína que desempeña un papel importante en la reparación SSB (SSBR) y supresión base reparar (BER) y también participa en otras vías de reparación, como nucleotide excisión repair (NER)33,34,35 . Juega un importante papel de coordinación en la reparación del ADN, interactuando con una serie de proteínas clave, incluyendo ribosa polimerasa 1 (PARP-1), ADN polimerasa β (Pol β) y ADN ligasa III. Utilizamos XRCC1-GFP estable expresado en células CHO-K1 para determinar las dosis de láser necesarias para generar SSBs y distritales. Primero identificamos la mínima dosis necesaria para inducir un reclutamiento observable de XRCC1-GFP para cada longitud de onda (figura 1). 355 nm longitud de onda, un 2 tiempo de permanencia de s sobre los daños definidos ROI genera una señal fluorescente creciente dentro de ese retorno de la inversión, indicando que la inducción de daño en el ADN que era perceptible sobre el fondo (figura 1A). Para 405 nm, una velocidad de lectura de 8 fps fue necesario para generar un reclutamiento observable el daño ROI (figura 1A). Luego se incrementó la dosis (10 s 355 nm y 0,5 fps para 405 nm) para crear un más intenso daño ROI (figura 1A).

Contratación y retención de XRCC1-GFP en el sitio de daño inducido entonces fue supervisada por proyección de imagen de timelapse. Retención de la proteína en el sitio de daño de la DNA puede indicar la reparación del ADN en curso, mientras que la disociación de la proteína desde el sitio de daño inducido a menudo se considera un marcador para terminar de BER o SSBR. Sin embargo, ha habido evidencia clara a la disociación de XRCC1 de sitios de daño de DNA inducida por láser con la terminación de la reparación. Reclutamiento de la proteína en el sitio de daño se mide por la divulgación la intensidad media de la señal fluorescente en el ROI dañado sobre la señal fluorescente media medida por el núcleo entero (figura 1B). Este tipo de normalización ayuda a fluctuaciones de intensidad de dirección de la señal nuclear, aunque pueden emplearse otras técnicas de normalización según la distribución celular de la proteína de interés. Aquí, XRCC1 se localiza en el compartimiento nuclear, para medidas de normalización en el área nuclear la redistribución de la señal para el retorno de la inversión del daño. Luego se registra la intensidad fluorescente media ROI para cada imagen en el lapso de tiempo, incluyendo la imagen de los daño y graficó en función del tiempo (figura 1C).

A continuación caracterizamos más el daño inducido por las dosis de láser seleccionado dos para examinar la formación de lesiones de base de ADN. En primer lugar, formación de CPD, una voluminosa lesión UV-inducida, fue sondada por inmunofluorescencia como marcador para las lesiones NER tipo (figura 2A). Entonces, la base lesion8-oxodG oxidativamente inducido fue sondeado como marcador de lesiones de tipo BER (figura 2B). No se observó ningún aumento significativo en las lesiones de la CPD en la exposición de dosis baja para dos longitudes de onda (2 s 355 nm y fps 8 para 405 nm), mientras que las altas dosis de tratamiento en dos longitudes de onda (10 s 355 nm y 0,5 fps para 405 nm) mostró un aumento significativo en fluorescentes señal observada dentro de los daños ROI (figura 2A). Un diagrama de dispersión del CPD ROI media intensidad para cada célula dañada muestra heterogeneidad en la formación de daños y detección en longitudes de onda y dosis, lo que indica que un nivel bajo de lesiones CPD puede estar presente en las dosis más bajas, pero la carga no puede ser significativamente detectada hasta que se aplica una dosis mayor. El diagrama de dispersión también sugiere la ineficiencia en la detección de anticuerpos que puede limitar la cuantificación exacta de las mezclas de daño.

Esto destaca aún más en la detección de lesiones de ADN oxidativamente inducidas por el marcador de 8-oxodG. No hay claro aumento señal fluorescente dentro de los daños ROI se observó para el 8-oxodG en longitud de onda láser o dosis utilizada (figura 2B). El anticuerpo utilizado para este trabajo es consistente con anteriores publicaciones9,10,36; sin embargo, debe señalarse que puede haber limitaciones en la observación de la formación de 8-oxodG con anticuerpos37,38. También se recomienda confirmación de la falta de lesiones oxidativamente inducidas por un segundo marcador, como reclutamiento de 8-Oxoguanine ADN glicosilasa (OGG1), la enzima responsable de la eliminación de 8-oxodG del ADN10. No observamos OGG1 contratación a nuestros sitios de daño del ADN; sin embargo, la formación de niveles bajos de oxidativamente inducida por daño en el ADN no se puede descartar totalmente.

Por último, se examinó la formación de consejos escolares distritales con dos marcadores, γH2AX y 53BP-1, en el selectedosis de láser d por inmunofluorescencia (figura 3 & 4). ΓH2AX es comúnmente usado como un marcador de rotura de filamento, pero su especificidad para distritales ha sido cuestionada en una serie de informes39,40. Además, es un evento de fosforilación que se propaga desde el sitio de rotura del filamento, por lo que la localización de la señal a una rotura de filamento puede ser limitada debido a la propagación de esta señal. Por lo tanto, combinando γH2AX con 53BP-1 permite una evaluación más precisa de la formación de DSB en el daño, el retorno de la inversión.

La respuesta de γH2AX y 53BP-1 micro-irradiación es longitud de onda y dosis dependiente. La dosis baja (2 s) estimulación a 355 nm no obtiene ninguna respuesta en 5 y 20 min y la una respuesta débil y variable 10 min post irradiación (figura 3A) para ambos marcadores. La dosis alta (10 s) de 355 nm micro-irradiación induce una señal fluorescente creciente dentro de los daños ROI en 5, 10 y 20 minutos post irradiación que se reduce en 40 minutos (figura 3B). Estos resultados indican que cuidadosa titulación de la dosis de nm 355 es necesaria para minimizar la Cruz-estimulación de vías de reparación, como lo demuestra la menor detección de la rotura de doble cadena marcador γH2AX en los primeros momentos (< 20 min) en dosis baja aplicado.

Experimentos similares fueron realizados usando baja (8 fps) y estimulación alta dosis (0,5 fps) 405 nm láser (figura 4). En esta longitud de onda se observó acumulación significativa de intensidad fluorescente dentro el daño ROI 53BP-1 y γH2AX independientemente de la dosis aplicada, lo que indica que estas dosis generan casi una mezcla compleja de roturas del filamento solo y doble inmediatamente después de la inducción de daño del ADN (figura 4). Además, las elevadas dosis de 405 ver nm un aumento en la tinción de γH2AX pan-nuclear dentro de 10 min de la inducción de daño (figura 4B, parte inferior) dificulta la detección del daño ROI al informe, mientras que la acumulación de 53BP-1 es más dentro de los daños, el retorno de la inversión.

Estos resultados demuestran claramente que 405 nm micro-irradiación no es apropiado para la vigilancia SSBR o BER, y que múltiples marcadores de ADN aductos y roturas del filamento debe ser empleado para caracterizar completamente las lesiones inducidas y las respuestas de reparación de ADN.

Alteración dependiente de la dosis en la contratación y retención de XRCC1-GFP
Una vez que se ha caracterizado el daño de ADN inducido, micro-la irradiación del laser puede ser una plataforma ideal para el estudio de la dinámica de proteínas de reparación del ADN. La cinética de disociación y retención de la GFP XRCC1 muestra una dependencia de la dosis (figura 1), que no es inesperada dada la inducción de mezclas diferentes de daño por cada longitud de onda. Las dosis de irradiación más alta (10 s y 0,5 fps) muestran un mayor reclutamiento de la intensidad de XRCC1-GFP en relación con las dosis más baja y mayor retención de la XRCC1-GFP en el sitio de daño en el transcurso de tiempo de 20 minutos (figura 1C). Esto indica que el daño de la DNA en dosis más altas para 355 y 405 nm es probable no resueltos durante el curso del experimento, que es consistente con la apariencia y retención de OSD marcadores, γH2AX y 53BP-1 (figuras 3 & 4 ).

Curiosamente, las dosis más bajas de daño (2 s y 8 fps) muestran rápida contratación de XRCC1-GFP a los sitios de daño y disociación de XRCC1-GFP en el transcurso del tiempo experimental a niveles de irradiación previa (figura 1C). Sin la caracterización completa de la mezcla de daño, esto puede llevar a la conclusión de que SSBs y las lesiones de base son totalmente resueltas estas condiciones perjudiciales. Sin embargo, la presencia de γH2AX y 53BP-1 en el minuto 40 de 355 nm y a 5 min de la 405 nm puede dar lugar a interpretaciones diferentes. Para la dosis de s nm 2 355, la mezcla de daños puede ser predominantemente SSBs, por lo que la aparición de marcadores DSB en 40 min puede indicar que algunas lesiones rupturas pueden ser distritales o la que se reparan distritales generados por esta energía en una escala de tiempo más largo. Las diferencias de escala de tiempo entre SSBR y OSD reparación han sido previamente reportados28,41,42. Del mismo modo, la disociación de dosis baja (8 fps) 405 nm puede indicar un bajo nivel de SSBs o un agrupamiento de SSBs que rápidamente se convierten en distritales, que se ha caracterizado por el alto daño DNA micro-irradiación y otros agentes de daño previamente43, 44 , 45.

Juntos estos resultados destacan la importancia de la caracterización de las mezclas de daño inducido y utilizando múltiples ADN reparación de proteínas y marcadores para la interpretación de la contratación y retención de ADN reparación de proteínas en los sitios de daño inducido.

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Figura 1 . Láser micro-irradiación induce reclutamiento de XRCC1-GFP. 
(A) las células CHO-K1 estable expresando GFP XRCC1 fueron irradiadas y reflejadas antes e inmediatamente después de la inducción de daño. Las flechas indican la ubicación del micro-dosis y barra de escala es 10 μm. (B) reclutamiento se mide determinando la intensidad fluorescente media dentro de los daños ROI y normalizando la intensidad fluorescente media del núcleo entero. (C) dinámica de reclutamiento puede ser medido para cada imagen de timelapse. Los gráficos son representativos de dos experimentos independientes con barras de error que representa el SEM (n = 24). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-2
Figura 2 . Láser micro-irradiación induce daños de nucleótido. 
Células CHO-K1 fueron sometidas a micro-la irradiación del laser y se fija inmediatamente después de la inducción de daño. Se realizó inmunofluorescencia para la detección de CPD y aductores de 8-oxodG. (A) arriba, diagrama de dispersión de la fluorescencia media ROI intensidades observadas en las células dañadas después de la tinción de CPD. Abajo, imágenes representativas de coloración del CPD. Las flechas indican la ubicación de la micro-irradiación y la barra de escala es 10 μm (n = 12). (B) imágenes representativas para la tinción de 8-oxodG. Flechasindicar Ubicación del micro-irradiación y la barra de escala es 10 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-3
Figura 3 . Marcadores de rotura de doble cadena de ADN responden a 355 nm micro-irradiación de una manera dependiente de dosis. 
Las células CHO-K1 fueron sometidas a irradiación de micro y fija en la estimulación posterior indicado tiempo puntos. Se realizó inmunofluorescencia para el OSD marcadores γH2AX y 53BP-1. (A) dispersión parcela de daños normalizada ROI significa intensidades de fluorescencia medidos para las células intactas y dañadas. Barras de error son representativos del SEM (n = 12). (B) representativas imágenes para γH2AX y la tinción de 53BP-1. Las flechas indican la ubicación de la micro-irradiación y la barra de escala es 10 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-4
Figura 4. Marcadores de rotura de doble cadena de ADN responden enérgicamente a 405 nm micro-irradiación.
Las células CHO-K1 fueron sometidas a irradiación de micro y fija en el tiempo puntos indicada post estímulo. Inmunofluorescencia para la DSB marcadores γH2AX y 53BP-1. (A) dispersión parcela de daños normalizada ROI significa intensidades de fluorescencia medidos para las células intactas y dañadas. Barras de error son representativos del SEM (n = 12). (B) representativas imágenes para γH2AX y la tinción de 53BP-1. Las flechas indican la ubicación de la micro-irradiación y la barra de escala es 10 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

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Con las condiciones descritas aquí, cualquier microscopio confocal con un UV-A o 405 nm láser, integrado por el fabricante o Añadida por el usuario final, puede inducir daño en el ADN dentro del núcleo de una célula y permite el reclutamiento de proteínas de reparación del DNA en el sitio de inducida por daño en el ADN a ser monitoreados. Sin embargo, como se señala en el protocolo y resultados representativos, selección de longitud de onda, aplica potencia, y caracterización de daño son importantes cuestiones que deben abordarse en primer lugar por el usuario para estudiar un ADN específico de reparación vía. Además, hay otras consideraciones en el diseño experimental que también debe ser considerado por los usuarios.

Para monitorear el comportamiento de la proteína en células vivas post micro-irradiación, una proteína fluorescente etiquetada se debe crear. La disponibilidad de una amplia gama de proteínas fluorescentes que pueden ser separados espectralmente ofrece herramientas para crear fusiones de proteína que pueden utilizarse para la caracterización de respuestas celulares a la inducción de daño en el ADN. Transitorios de la transfección de proteínas fluorescentes de interés permite la detección rápida de condiciones dañinas, mutaciones, o incluso inhibidores, mientras que las células transfected estable ofrecen más controlan sobre los niveles de expresión y permitan otros bioquímicos caracterizaciones a realizar, validar resultados de micro-irradiación. Espectralmente distintas proteínas fluorescentes también pueden ser utilizadas en la misma célula para controlar las interacciones entre las proteínas dentro de la misma vía o en vías diferentes. Proteínas fluorescentes también eliminan la necesidad de los anticuerpos específicos para cada proteína de interés y permitir que células vivas monitoreo del comportamiento de la proteína durante largos períodos de tiempo después de la inducción de daño.

Sin embargo, el uso de proteínas fluorescentes también tiene inconvenientes. Sin contextos genéticos portadores deficientes en la proteína de interés, proteínas endógenas competirá con las proteínas fluorescencia de etiquetado. Conjugación de la etiqueta fluorescente a la N o C terminal de la proteína puede alterar el plegamiento de la proteína, obstaculizan las interacciones proteína-proteína clave o bloquear señales de translocación; alterando la función y dinámica de reclutamiento potencialmente impactantes. Estos efectos se han demostrado en un número de informes donde coloración inmunofluorescente demostró dramáticamente distintos de reclutamiento y tiempos de retención de proteínas endógenas en el sitio de daño28. El uso de clones estables o transitorios de la transfección también puede alterar la respuesta observada, típicamente a través de las variaciones en los niveles de expresión de la proteína. Además, el uso de proteínas fluorescentes múltiples en un solo experimento también puede cambiar la dinámica de reclutamiento, si los niveles de proteínas no están equilibrados bien o reclutamiento de la proteína mayor fluorescencia etiquetada bloquea el reclutamiento de otras proteínas . Por último, las proteínas fluorescentes pueden actuar como agentes de sensibilización débil, incrementando la formación de especies reactivas de oxígeno y potencialmente alterando el ADN daños mezclas inducido46,47. A pesar de estos inconvenientes, proteínas fluorescentes ofrecen una serie de ventajas en el estudio de ADN reparación micro-irradiación y si los usuarios incorporan los controles adecuados, tales como la caracterización de daños descrito aquí, puede proporcionar la nueva penetración en daño respuesta y proteínas interacciones3.

Si no es necesaria la proyección de imagen de células vivas, puede utilizarse la inmunofluorescencia para monitorear la respuesta al daño inducido. Mediante la fijación de las células en momentos específicos post inducción de daño y coloración con los anticuerpos específicos para las proteínas y las lesiones de interés, fotos estáticas de la inducción de daño y el reclutamiento y la retención de reparación pueden construir proteínas. Anticuerpos pueden utilizarse para supervisar el reclutamiento de múltiples proteínas de interés y/o modificaciones poste-de translación inducidas por la respuesta del daño de ADN. Uso de inmunofluorescencia elimina la necesidad de proteínas fluorescentes y permite el comportamiento de la proteína endógena que se examinará. Sin embargo, este método también tiene sus desventajas. Anticuerpos altamente específicos son necesarios, y permeabilización y procedimientos de bloqueo optimizado para permitir la detección de reclutamiento con suficiente intensidad de señal. Procedimientos de fijación no son instantaneos, y esta restricción física limita la resolución temporal de este enfoque. Mapeo del sitio de la inducción de daño para que las células pueden ser reubicadas después de la tinción también puede presentar retos significativos. El microscopio confocal utilizado en este trabajo permite el registro basado en imágenes como se describió anteriormente, por lo que las células dañadas pueden ser reubicadas con la alta precisión. Si registro de etapa o cubreobjetos grabada no está disponible, el tiempo de inversión involucrada en células reubicación sin registro de la etapa, junto con el retraso inherente entre la inducción del daño y el reclutamiento, la imagen pueden hacer inmunofluorescencia poco atractivo para algunos usuarios. Sin embargo, los diseños experimentales de la radiación de micro más precisos y completos va a incorporar este tipo de enfoques en paralelo con el uso de proteínas fluorescentes, como se describe en el protocolo presentado.

Aquí, imágenes de células vivas y de la inmunofluorescencia se utiliza para demostrar la utilidad del láser micro-irradiación. Tinción inmunofluorescente nos permite examinar con precisión la mezcla de ADN daños creados y el reclutamiento de proteínas inducida por cada energía del laser, que nos permite mejor interpretar las alteraciones observadas en el reclutamiento y retención de XRCC1-GFP. Basado en estos resultados, el uso del 405 nm láser debe limitarse para el examen de proteínas BER y SSBR. Además, el diseño experimental óptimo incluiría medidas de potencia tras el objetivo, una caracterización de mezcla de daño total para cada línea celular utilizada y validación de la contratación y retención observado en fluorescencia etiquetada proteínas con inmunofluorescencia. Obviamente, equipo, tiempo y consideraciones de costo pueden hacer estos diseños experimentales óptimos imposible para algunos usuarios. Sin embargo, la importancia de cada uno de estos elementos se demuestra aquí, y los usuarios deberían tener estas consideraciones en mente al iniciar experimentos de micro-irradiación.

Disclosures

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Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgements

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Los autores desean agradecer al Dr. Samuel H. Wilson en el nacional Instituto de Ciencias de salud ambiental para las líneas celulares usadas en este trabajo.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Microscopio confocal de barrido láser Nikon A1rsiNikon
NIS Elements LáserNikon
355 nmPicoQuant VisUVFuente de radiación
Galvanómetro miniescáner de fotoactivaciónBruker
Microscopio de diapositiva sensor de potencia de fotodiodoTHORLabsS170C
Sensor de potencia de fotodiodo de fibraTHORLabsS150C
Medidor digital de energía y potencia ópticaportátil THORLabsPM100D
CHO-K1Del Dr. Samuel H. Wilson, NIEHS
Medios esenciales mínimosHycloneSH3026501
Suero fetal bovinoAtlanta BiologicalsS11550
XRCC1-GFPOrigeneRG204952
JetprimePolyplus transfección11407
GeneticinThermoFisher10131035
4 cubreobjetosThermoFisher155382
8 cubreobjetosThermoFisher155409
Anti 53BP-1NovusNB100304
Antifosfohistona H2AX Millipore05-636-I
Dímero anticiclobutano pirimidinaCosmo Bio clonCAC-NM-DND-001
Anti 8-oxo-2&agudo;-desoxiguanosina Trevigen4354-MC-050
Alexa 488 cabra anti-ratónThermoFisherA11029
Alexa 546 cabra anti-conejoThermoFisherA11010
4',6-Diamidino-2-Fenilindol (DAPI)ThermoFisherR37606¡Precaución tóxico!
Solución salina tamponada con fosfatoThermoFisher0780
Suero de cabra normalThermoFisher31873
Albúmina sérica bovina (BSA)Jackson Immuno Research001-000-162
37% FormaldehídoThermoFisher9311¡Precaución tóxico!
EtanolDecon Labs2716
MetanolVWRBDH1135¡Precaución tóxico!
HClFisherSA49
Azida sódicaSigma-AldrichS2002¡Precaución tóxico!
Clorhidrato de TrisAmrescoO234
Triton X-100Sigma-AldrichT8787
Software

References

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