Microinyección de la proteína CRISPR/Cas9 en bagre de canal, Ictalurus punctatus, embriones de Gene Editing

Resumen

Se presenta un protocolo de microinyección simple y eficiente para la edición de genes en embriones de bagre de canal usando el sistema CRISPR/Cas9. En este protocolo, guía RNAs y proteínas Cas9 fueron microinyectados en la yema de una célula de embriones. Este protocolo ha sido validada por la anulación de dos genes relacionados con la inmune de bagre de canal.

Resumen

Se ha secuenciado el genoma completo del bagre de canal, Ictalurus punctatus, conduciendo a mayores oportunidades para estudiar la función genética de bagre de canal. Golpe de gracia del gene se ha utilizado para el estudio de estos genes funciones en vivo. El cluster regularmente otro proteínas cortas repeticiones palindrómico/CRISPR asociado 9 (CRISPR/Cas9) el sistema es una potente herramienta para editar secuencias genómicas de ADN para alterar la función génica. Mientras que el enfoque tradicional ha sido introducir CRISPR/Cas9 mRNA en los embriones de la célula a través de microinyección, esto puede ser un proceso lento e ineficiente en el bagre. Aquí, se describe un protocolo detallado para microinyección de embriones de bagre de canal con CRISPR/Cas9 proteína. Brevemente, óvulos y espermatozoides fueron recogida y luego artificial fertilización realizada. Los huevos fertilizados se transfirieron a una placa de Petri que contenga solución de Holtfreter. Volumen de inyección fue calibrado y luego guía RNAs/Cas9 dirigido a los toll/interleukin-1 dominio-que contienen adaptador (TICAM 1) de la molécula del gene del receptor y ramnosa Unión lectina (RBL) gene fueron microinyectados en la yema de los embriones de una célula. El golpe de gracia del gene era acertado como indels fueron confirmados por secuenciación del ADN. Las alteraciones de la secuencia de la proteína prevista debido a estas mutaciones incluyen mutágeno ' frameshift ' y truncarán de la proteína debido a codones de parada prematura.

Introducción

Microinyección es una técnica de laboratorio común utilizada para entregar una pequeña cantidad de una sustancia tales como DNA, RNA, proteínas y otras macromoléculas en células o embriones a través de un capilar de vidrio¹. Microinyección se realiza mediante la instalación de equipos especiales incluyendo un microinyector, instrumental quirúrgico y un microscopio². La técnica se ha utilizado por los investigadores para modificar genéticamente muchos organismos a través de la generación de transgénicos, knockouts de genes y terapia genética, con el objetivo de comprender la dinámica de componentes intracelulares

Protocolo

Este experimento se llevó a cabo en la unidad de investigación de genética de peces, centro de investigación de pesquerías de E. W. Shell, Universidad de Auburn, Alabama. Todos los protocolos experimentales utilizados en este experimento fueron aprobados por la Universidad de Auburn institucional Animal Care y Comité uso (IACUC-AU) antes de inicia el experimento. Una lista de la maquinaria y equipo utilizado en este experimento puede encontrarse en la tabla de materiales. Los siguientes son los pasos y procedimientos para la preparación y microinyección de embriones de una célula de bagre de canal como se ilustra en la figura 1.

Resultados

Para demostrar la eficacia del Protocolo de microinyección, fueron microinyectados gRNAs diseñados para atacar el bagre de canal toll/interleukin-1 dominio-que contienen adaptador (TICAM1) de la molécula del gene del receptor y ramnosa Unión lectina (RBL) gene.

TICAM 1
Secuencia de la DNA de vectores de las colonias individuales de productos PCR combinados, clonados revelaron las mutaciones indel inducidas en.......

Discusión

Se presentó un protocolo detallado para microinyección de embriones de bagre de canal para lograr el golpe de gracia del gene. Inyección de proteína CRISPR/Cas9 en la yema de huevo es mucho más sencilla, ahorra tiempo y no requiere formación amplia en comparación con microinjecting el blastodisc del embrión de una célula, que es la técnica común para la mayoría de la transferencia de genes y gene edición con pescado ^{30 , 42}. el protocolo actual demostró para ser .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Implante Reproboost	Centro de Biotecnología		Marina Análogo de la hormona liberadora de hormona luteinizante (LHRHa) para la inducción de la ovulación en hembras de bagre de canal
TRICAINE-S	Western Chemical. Inc.		Para la sedación de peces reproductores durante la inyección de hormonas y la extracción de huevos.
Rojo de fenol	Sigma-Aldrich	P0290	0,5%, filtrado estéril
Microscopio estereoscópico	Olympus 213709		Para la visualización de los óvulos durante la microinyección
Microinyector	ASI-Instrumentación científica aplicada	Modelo MPPI-3	Para la administración del material de inyección en los embriones
Micromanipulador	ASI-Instrumentación Científica Aplicada	Modelo MM33	Para sujetar y controlar el movimiento de la aguja de inyección.
Microcargador Eppendorf	Eppendorf	5242956.003	Para cargar solución inyectable en agujas de microinyección.
Extractor de agujas vertical	David Kopf Instruments	Modelo 720	Para tirar de agujas de microinyección Cas9
proteína PNA	Bio Inc.	CP01	Proteína Cas9 recombinante de Streptococcus pyrogenes.
Expandir el sistema de PCR PLUS de alta fidelidad	Roche Diagnostics, EE. UU.		Para PCR y amplificación de plantillas de ADN para su uso en la preparación de ARNg
Capilares de vidrio de borosilicato	Fisher Scientific		1 mm de diámetro exterior (OD), para la fabricación de agujas de microinyección.
Placa de Petri	VWR	25384-302	Para sujetar los embriones durante la microinyección.
Crisco	The J.M. Smucker Company		Manteca vegetal para recubrir sartenes de desove y placas de Petri.
La solución de Holtfreter	hizo		59 mM de NaCl, 0,67 mM de KCl, 2,4 mM de NaHCO3, 0,76 mM de CaCl2, 1,67 mM de MgSO4 para incubar los embriones microinyectados hasta la eclosión.
Hiclato de doxiciclina USP (monohidrato)	Letco Medical	690904	Antibiótico añadido a la solución de Holtfreter a 10 ppm para prevenir infecciones bacterianas.

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