G2-seq: Una alto rendimiento basado en la secuencia técnica para identificar replicación tardía de regiones del genoma

Summary

Describimos una técnica para combinar la citometría de flujo y la secuenciación de alto rendimiento para identificar regiones finales replicación del genoma.

Abstract

Numerosas técnicas se han desarrollado para seguir el progreso de la replicación del ADN a través de la fase S del ciclo celular. La mayoría de estas técnicas se han dirigido hacia la aclaración de la ubicación y el momento de inicio de la duplicación del genoma en lugar de su realización. Sin embargo, es fundamental que entendemos regiones del genoma que son última completar la replicación, porque estas regiones sufren niveles elevados de rotura cromosómica y mutación, y han sido asociados con la enfermedad y el envejecimiento. Aquí describimos cómo hemos ampliado una técnica que se ha utilizado para vigilar la iniciación de la replicación en cambio identificar las regiones del genoma última replicación completa. Este enfoque se basa en una combinación de citometría de flujo y la secuenciación de alto rendimiento. Aunque este informe se centra en la aplicación de esta técnica a la levadura, el enfoque puede utilizarse con cualquier célula que se puede ordenar en un citómetro de flujo según el contenido de ADN.

Introduction

Replicación del genoma eucariota se inicia en múltiples sitios discretos, llamados origen de replicación, de que la replicación horquillas proceden en ambas direcciones (revisados en Fragkos et al., 2015¹). Orígenes varían en su tiempo y eficiencia de la cocción, y se han desarrollado varias técnicas para supervisar la actividad de origen de replicación y aclarar las causas de esta variación. De niveles de single-stranded DNA², que se forma alrededor de origen activo, puede inferirse la actividad de orígenes individuales o mediante el uso de electroforesis en 2D para supervisar la replicación específica intermed....

Protocol

1. preparación de células de flujo Cytometry clasificación

1. Inocular tubos de ensayo de 15 mL que contiene 8 mL de caldo YEPD tal que los cultivos alcanzan una densidad de 5 x 10⁶ a 1.5 x 10⁷ células por mL después de crecimiento durante la noche (véase la discusión Nota 1).
2. Desactivación de las células de levadura (1.400 x g, a temperatura ambiente o 4 ° C) en un tubo de centrífuga de 15 mL tapón durante 5 min, resuspender las células en etanol al de 70% 1.5 mL y transfiéralo a un tubo de microcentrífuga 1.6 mL, dejando este sit 1 h a temperatura ambiente o por lo menos 3 h de hielo ( se puede almacenar indefinidamente a 4 ° C....

Results

Hemos utilizado el procedimiento descrito anteriormente para identificar sitios de replicación tardíos en levadura de florecimiento. Prueba este planteamiento con una región de replicación finales conocida en un cromosoma artificial demostró la técnica exacta y fiable. Nuestros resultados también han demostrado la importancia biológica de la oportuna terminación de la replicación, mostrando que una región replicación tardía en el cromosoma 7, que identificamos como replicación de fines so.......

Discussion

Mientras que esta técnica es robusta y relativamente directo, una atención especial debería destinarse a los siguientes:

(1) recomendamos que las culturas crecen durante al menos 12 h antes de llegar a la fase de registro, ya que las diferencias se manifiestan en ciclo celular distribuciones si las culturas son cosechadas después de haber alcanzado la densidad deseada a 4 h después de la inoculación. Nuestra hipótesis es que una distribución de ciclo celular que ha alcanzado un equilibrio rela.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kit de ADN genómico YeaStar	Genesee Scientific	11-323
1 µ M SYTOX Green	ThermoFisher	57020	resuspender en 50 mM de citrato de sodio, pH 7,2
50 mM citrato de sodio, pH 7,2
Solución de ARNasa (0,25 mg / mL)	Sigma	R6513	0,25 mg / mL RNasa resuspendida en 50 mM de citrato de sodio, pH 7,2, hervir la solución de ARNasa durante 10 minutos solo antes del primer uso, y a partir de entonces almacenar a -20°
solución de proteinasa K (20 mg / mL)	ThermoFisher / Invitrogen	25530-015	resuspender en 10 mM Tris, pH 7.5, 2 mM CaCl2, 50% glicerol, almacenar a -20 grados; C
Modelo 50 Desmembrador	sónico Fisher Scientific	FB50A220
BD Biosciences FACSAria II	BD Biosciences	644832
Columnas Zymo-spin III	Zymo Research	C1005
Qubit dsDNA HS Kit de ensayo	ThermoFisher	Q32851
Qubit 3.0 Fluorímetro	ThermoFisher	Q33216
Covaris Modelo LE220 Ultrasonido Focalizado	Covaris	500219
Illumina TruSeq DNA LT Kit de preparación de muestras	Illumina	15026486
Illumina HiSeq 2500 instrumento	Illumina	SY– 401 y ndash; 2501
software de alineación gsnap	software de código abierto / Genentech		http://research-pub.gene.com/gmap