Un inalámbrico, interfaz bidireccional para la grabación en Vivo y estimulación de la actividad Neural en comportarse libremente las ratas

Resumen

Se introduce un inalámbrico, sistema bidireccional de nervios grabaciones de canales múltiples y la estimulación en comportarse libremente las ratas. El sistema es ligero y compacto, teniendo así un impacto mínimo en el repertorio conductual de la animal´s. Por otra parte, este sistema bidireccional proporciona una sofisticada herramienta para evaluar las relaciones causales entre patrones de activación cerebral y el comportamiento.

Resumen

In vivo de electrofisiología es una técnica poderosa para investigar la relación entre actividad cerebral y el comportamiento en una escala de milisegundos y micrómetro. Sin embargo, los métodos actuales dependen sobre todo de grabaciones de atado del cable o utilizan solamente sistemas unidireccionales, permitiendo grabar o estimulación de la actividad de los nervios, pero no en el mismo tiempo o el mismo objetivo. Aquí, un nuevo móvil, dispositivo bidireccional para grabación multicanal simultánea y estimulación de la actividad neural en comportarse libremente las ratas se describe. El sistema opera a través de una sola etapa cabeza portable que transmite la actividad grabada y puede orientarse en tiempo real para la estimulación del cerebro mediante un software multicanal basado en la telemetría. El escenario principal está equipado con un preamplificador y una batería recargable que permite grabaciones a largo plazo estables o estimulación de 1 h. lo importante, la etapa principal es compacta, pesa 12 g (batería incluyendo) y por lo tanto tiene un impacto mínimo en el animal´s repertorio conductual, lo que el método aplicable a un amplio conjunto de tareas conductuales. Por otra parte, el método tiene la gran ventaja que el efecto de la estimulación cerebral en actividad neuronal y el comportamiento puede medirse simultáneamente, proporcionando una herramienta para evaluar las relaciones de causalidad entre el comportamiento y patrones de activación cerebral específica. Esta característica hace que el método particularmente valioso para el campo de la estimulación cerebral profunda, que precisa evaluación, seguimiento y ajuste de parámetros de estimulación durante experimentos conductuales a largo plazo. La aplicabilidad del sistema ha sido validada utilizando el colliculus inferior como una estructura de modelo.

Introducción

Una pregunta fundamental en Neurociencias es actividad eléctrica como en los circuitos neuronales definidos genera ciertas formas de comportamiento. In vivo de electrofisiología es una técnica poderosa para abordar esta cuestión, proporcionando una herramienta para grabar o estimular la actividad eléctrica en el cerebro mientras que los animales realizan ciertas tareas conductuales. Sin embargo, los sistemas actuales con frecuencia dependen de cable atado grabaciones^1,2, es probable que restringen la movilidad y prevenir la expresión completa del repertorio conductual de animal´s. Por otra parte, se utilizan sobre todo unidireccionales sistemas, lo que permite ya sea grabando^3,4,5 o estimulación^6,7 de actividad neuronal, pero no en el mismo tiempo o el mismo objetivo, lo que difícil de desenredar las relaciones de causalidad entre el comportamiento y patrones de activación cerebral específica. Sólo unos inalámbricos, sistemas bidireccionales para preparaciones en vivo están disponibles actualmente. Sin embargo, son generalmente pesados (40-50 g) y consisten en dos distintas unidades portátiles, es decir, una fase principal y una mochila conectada energía de batería fuente^8,9,10, haciéndolas menos flexible y aumentando el riesgo de desconexiones de cable por ejemplo en comportamiento uno mismo-de la preparación. Ninguno de los mencionados sistemas inalámbricos ofrecen unidades de microelectrodo implantable para adquirir un completo concepto integrado de la actividad neuronal durante el comportamiento etológico válido completo con alta reproducibilidad de las condiciones experimentales.

Aquí, se introduce un nuevo móvil, dispositivo bidireccional para grabaciones en vivo y estimulación de la actividad neural en comportarse libremente las ratas. El sistema inalámbrico de Thomas (TWS) opera a través de una etapa de cabeza solo extraíble que puede transmitir actividad multicanal, con hasta cuatro canales de grabación independiente y puede orientarse para la estimulación eléctrica cerebral en tiempo real. Además, una unidad de microelectrodo crónico implantable compatible con el TWS fue desarrollada que permite la estimulación neural y grabación. También se presenta una interfaz gráfica de usuario TWS software, grabación y estimulación. Este estudio describe la implementación de validación y en vivo de todo el dispositivo.

Para validar el sistema TWS el colliculus inferior fue elegido como una estructura de nervios de destino porque una respuesta conductual abierta puede ser sacada por su estimulación eléctrica. Es ampliamente conocido que la estimulación eléctrica del colliculus inferior provoca incondicionadas 'miedo-como' las respuestas del comportamiento en ratas, tales como vigilancia, posturas hacia los lados, arqueamiento de la espalda, congelación y comportamiento del escape (vuelo). Este patrón de respuesta imita reacciones al miedo evocada por problemas ambientales, como hecho dañoso percibido, ataque o amenaza a la supervivencia^11,12,13. Se suponía que ser capaz de generar un comportamiento tan claro e inequívoco proporcionaría un verdadero desafío a la TWS.

Protocolo

todos los protocolos y los experimentos estaban de acuerdo con las actuales directrices europeas (2010/63/UE) y aprobado por las autoridades regionales (Regierungspräsidium Gießen, Sr. 20/35 Nr.25/2015).

1. animales

1. adulto ratas Wistar macho (200-250 g) en grupos de 3-4 bajo condiciones normales de laboratorio durante al menos una semana antes de la cirugía para permitir la aclimatación de la casa.
2. Dos días después de la cirugía, las ratas de la casa en parejas. Cubre jaulas individuales con tapas de acrílico alta. Evitar las tapas convencionales hechas de rejilla metálica ya que pueden atascarse los implantes, aumentando el riesgo de que estén dañada o inestable en tiempo.

2. La cirugía estereotáctica

1. antes de comenzar la cirugía, organizar y preparar los equipos y materiales siguientes:
   1. obtener equipo quirúrgico estéril formado por tijeras estériles, blunt end fórceps, espátulas quirúrgicos cortauñas, taladro dental y algodón brotes.
   2. obtener medicamentos y productos químicos incluyendo isoflurano, Xilocaína, clorhidrato de tramadol, ungüento de ojo de dexpantenol, peróxido de hidrógeno 3%, povidona yodo y el 70% de etanol.
   3. Obtener material de fijación como tornillos de acero inoxidable, resina de acrílico, pegamento ULTRAVIOLETA y casquillo protector.
   4. Obtener una unidad de microelectrodos, que consiste en (i) un electrodo único de registro (vidrio de cuarzo aislado microelectrodo tungsteno platino, con forma de punta cónica, diámetro externo: 80 μm, punta cónica, impedancia a 1 kHz: 500 kOhm) o un tetrodo (vidrio de cuarzo microelectrodo de platino/tungsteno 4 núcleos, diámetro exterior de aislamiento: 100 μm, punta cónica, impedancia a 1 kHz: 500-800 kOhm); (ii) un electrodo de estimulación (alambre de platino/iridio (90% platino, iridio del 10%), diámetro de 125μm, diámetro exterior 150 μm, impedancia de la base < 10 kOhm) conectado a una placa de contacto y (iii) un electrodo de referencia de alambre de platino (diámetro del eje, 100 μm; figura 1A).
   5. Obtener porta electrodos pegados con pegamento soluble en agua a la unidad del microelectrodo y probado para la funcionalidad de al menos 2 h de antelación ( figura 1B).
   6. Obtener un sistema atado convencional que consiste en un diferencial preamplificador, un amplificador principal y un bandpass filtro amplificador para grabaciones.
   7. Obtener material adicional, tales como guantes, calefacción almohadilla, jeringas y suero fisiológico.
   8. Obtener jaulas hogar (L x W x H: 42 cm x 26 cm x 38 cm).
2. Procedimiento
   Nota: implantación del electrodo se realiza durante una cirugía estereotáxica convencional bajo anestesia isoflurano.
   1. Asegurarse de que el experimentador es usar bata, guantes y mascarilla quirúrgica.
   2. Iniciar colocando el animal en una cámara de inducción de la anestesia (4-5% de isoflurano, flujo de oxígeno 1 L/min, duración ~ 5 min).
   3. Prueba para la pérdida de los reflejos (reflejos de cola y dedos) con pinzas para confirmar la anestesia profunda.
   4. Coloque la cabeza del animal en una máscara de anestesia fijada alrededor de la barra del incisivo superior del marco estereotáctico y ajuste anestesia (isoflurano 2-3%, flujo de oxígeno 0.7-0.8 L/min).
   5. Fijar y alinear horizontalmente el animal ' cabeza en el aparato estereotáctico usando barras de oído y bar incisivo superior
   6. Afeitar el campo quirúrgico con tijeras quirúrgicas o una tijera y esterilizar con yodo povidona.
   7. Colocar el animal sobre una almohada para prevenir la hipotermia y tratar los ojos con ungüento de ojo dexpantenol para evitar que seque.
   8. Inyectar xilocaína (0.3-0.4 mL por vía subcutánea, s.c.) en el centro del campo quirúrgico.
   9. Prueba para la pérdida de los reflejos otra vez.
   10. Hacer una incisión pequeña (1,5 cm) con un bisturí en el medio del campo quirúrgico para exponer el cráneo. Separar la piel suavemente y retirar con espátula, pinzas y tijera de tejido residual.
   11. Limpie cuidadosamente el cráneo con bastoncillos de algodón recubierto de peróxido de hidrógeno.
   12. Taladro 4-5 (4.7 mm) pequeños agujeros en el cráneo para la fijación de tornillos de acero inoxidable.
   13. Conectar el microelectrodo unidad/portaelectrodos al preamplificador y coloque en el micromanipulador estereotáctica ( figura 1B y 1 C).
   14. Haga un agujero (aproximadamente 7 mm) en el cráneo por encima del área de destino utilizando coordenadas de un atlas del cerebro según el animal utilizado. En el presente estudio, coloque las puntas de los electrodos hacia el colículo inferior con las siguientes coordenadas, con el vértice que sirve como referencia: anterior/posterior, − 8,8 mm; medial, lateral, 1,5 mm; y dorsal/ventral, 3.5 mm ¹⁴.
   15. Absorber la sangre con bastoncillos de algodón.
   16. Introducir verticalmente la unidad microelectrodo hasta las puntas de los electrodos la zona objetivo.
   17. Colocar el cable de tierra a lo largo de los tornillos de acero inoxidable y debajo de la piel.
   18. Monitor de actividad de spike y cuidadosamente ajustar la colocación de los electrodos con amalgamas dentales hasta llegar a una zona de neuronas activas en la estructura Diana y detectar la actividad de los nervios con una relación señal / ruido adecuada para clasificar el punto.
   19. Fijar la unidad de microelectrodo en el cráneo con el pegamento ULTRAVIOLETA y tornillos con resina acrílica y placa contacto.
   20. Inyectar suero fisiológico (1 mL i.p.) y tramadol (25 mg/kg, s.c.) para prevenir la deshidratación y asegurar analgesia postoperatoria, respectivamente.
   21. Desconecte la unidad del microelectrodo desde el sostenedor de electrodos con un cepillo humedecida en agua.
   22. Parada de anestesia, cuidadosamente Quite rata el marco estereotáctico. Desconecte el preamplificador el microelectrodo unidad.
   23. Conectar la protección tapa unidad de microelectrodos implantados y desconectar solamente durante los procedimientos experimentales.
   24. Mantener los animales en pares en la jaula de casa desde el segundo día después de la cirugía.
   Animales de monitor
   25. diario para posible de la herida infección, peso corporal, condición de salud y comportamiento general para un período de 7 días después de la cirugía. Después de este período de recuperación, realizar experimentos conductuales y electrofisiología en vivo.
       Nota: El procedimiento quirúrgico dura entre 60-90 min. Durante la cirugía, deben controlarse continuamente cola película reflejos y ajustado de la anestesia, si es necesario.

3. En Vivo Electrofisiología

1. equipos y procedimiento de
   Nota: las grabaciones electrofisiológicas y la estimulación se realizan con la TWS.
   1. Obtener un escenario principal con un preamplificador integrado y batería conectada (grabación de cuatro canales, rango de entrada de grabación analógica: 0-12 milivoltio pk-pk; salida de estimulación: ±625 μA; L x W x H: 24 x 22 x 12 mm; peso: 6 g sin la batería, 12 g con la batería; tiempo de batería hasta 1 hora). Esta etapa de cabeza es conveniente conectarse directamente a la unidad de microelectrodos implantados mediante un conector multipolar miniatura ( figura 2).
   2. Obtener una batería (acumulador de iones de litio, 3.7-4.2 V CC, 230 mAh, 27 mm x 20 mm x 6 mm, tiempo de operación de 1 h) en la parte superior de la etapa principal ( figura 2). Si es necesario utilice la batería recargable de recambio con capacidad de 450 mA aproximadamente tiempo de operación h 2,5. Asegúrese de que una luz verde se enciende en el escenario principal mientras que la batería está conectada a lo
   3. Obtener un transceptor (transmisor-receptor) conectado a un PC vía puerto USB estándar y permite el funcionamiento inalámbrico de hasta 5 m ( Figura 2E).
   4. Obtener un ordenador personal con software TWS para estimulación eléctrica y registro de la actividad neural ( figura 3 y figura 4 < / fuerte>).
   5. Obtener un preamplificador atado y un sistema de adquisición de datos utilizado durante la cirugía (ver punto 2.1.5) para las grabaciones y un generador de estímulo para la estimulación, con el fin de comparar la efficaciousness de la TWS en despierto ratas una semana después de la cirugía.
      Nota: El estímulo eléctrico se proporciona y se registra actividad extracelular de las neuronas individuales de la misma unidad de microelectrodos implantados utilizando ambos sistemas. Los parámetros de estimulación (intensidad de corriente, pulso y frecuencia) deben ajustarse a cada animal según la región del cerebro dirigida. En el presente estudio, un 150-250 μA, 2500 Hz corriente fue utilizado para estimular el colliculus inferior.
2. Análisis de la conducta
   Nota: una vez ninguna barrera metálica se introduce entre el transceptor y la etapa animal de cabeza, la TWS es aplicable a un amplio conjunto de tareas conductuales. Como pruebas de comportamiento ejemplares, fue utilizado en el campo abierto para la medición de actividad conductual en general y en el elevado más laberinto, una prueba estándar para evaluar ansiedad-como comportamiento en roedores ¹⁵. Una cámara de vídeo fue colocada centralmente sobre campo abierto y elevada además de laberinto para grabaciones de comportamiento.
   1. Antes de la prueba conductual, manejar cada animal en tres días consecutivos (5 min cada día). Antes de cada período de manejo conectar el escenario principal con la batería a la unidad de microelectrodo implantada previamente. No realizar cualquier grabación o estimulación durante la dirección.
   2. Campa
      1. colocar la rata en el centro del campo abierto (40 cm x 40 cm x 40 cm, rojo ~ 30 Lux de luz) y permita que explore el aparato durante al menos 5 min bajo la grabación neural.
      2. Determinar el umbral de escape - intensidad de corriente mínima producción de correr o saltar. En el presente estudio, proporcionar una estimulación de alta frecuencia 2500Hz (anchura de pulso: 100 μs; intervalo de pulso: 100 μs) al colículo inferior en intervalos de 1 minuto, aumentando la intensidad de corriente por 20-50 μA pasos hasta ratas mostraron escapan comportamiento.
      3. Volver la rata a su jaula casa, limpiar el campo abierto (solución de ácido acético 0.1%) y seco lo
         Nota: Para comparar la eficacia de la estimulación de la TWS con el sistema atado tradicional el procedimiento descrito se realizó con ambos sistemas.
   3. Elevados además de laberinto
      Nota: el laberinto más utilizado en estos experimentos fue de acrílico gris y consistió en dos brazos abiertos (50 cm largo x 10 cm de ancho) y dos brazos (50 cm largo x 10 cm de ancho, con altos muros de 40 cm) que se extendía desde una central pla TForm había elevada 50 cm sobre el piso ¹⁶.
      1. Colocar la rata en el centro de la frente de la plus-maze hacia un brazo abierto y permita que explore libremente el aparato bajo grabación continua durante 5 min.
      2. Anote el número de entradas, y el tiempo dedicado en los brazos abiertos y cerrados durante un período de 5 min.
      3. Volver a la rata a su jaula casera, limpio (solución de ácido acético 0.1%) y seco el laberinto antes de cada test.
   4. La perfusión y la histología
      1. anestesiar la rata con ketamina/xilacina (150 mg/kg y 100 mg/kg, i.p. respectivamente.).
      2. Conectar la unidad de electrodo implantado en el cable de estimulación y aplicar estimulación eléctrica (actual intensidad 50 μA, anchura de pulso: 100 μs; intervalo de pulso: 100 μs) durante 90 s para producir una pequeña lesión alrededor de la punta del electrodo.
      3. Desconecte el cable de estimulación y perfusión del animal a través del ventrículo izquierdo con suero fisiológico seguido de 200 mL de paraformaldehído al 4% en tampón de fosfato de sodio de 0,1 M, pH 7.3 (para una descripción detallada ver referencia ¹⁷ ).
      4. Quitar el cerebro y sumergirlo durante 4 horas en fijador fresco a 4 º C.
      5. Asegúrese de que la temperatura de la cámara principal del criostato es de-20 ° C.
      6. Congelar el cerebro en hielo seco y cortarlos a 50 μm de secciones coronales serial usando un criostato.
      7. Las secciones con cresylviolet de la mancha con el fin de localizar las posiciones de las puntas de los electrodos, según el atlas de Paxinos y Watson ¹⁴.

Resultados

Datos técnicos de TWS

El sistema inalámbrico ofrece 4 canales de grabación independiente y canal de 1 estimulación. Actividad extracelular fue recogido por el electrodo de un solo núcleo de grabación y pasó a la entrada de señal de alta impedancia del sistema inalámbrico. La señal grabada fue (x200) pre amplificado por un preamplificador de entrada diferencial, acoplado en CA y paso de banda filtrado (señal fija ancho de banda, 500 Hz... 5 kHz) para grabar sólo actividad de varias unidades, ya que en el presente estudio el principal interés de actividad la unidad de registro y los potenciales de campo local no. El principal amplificador de ganancia programable integrado ofrece software ajustable de ganancia para los cuatro canales de grabación (x1, x2, x4, x8, x16, x32, x64). La cadena de señal completa del sistema inalámbrico ofrece valores de ganancia general de x200, x400, x800, x1600, x 3200, x6400 y x12800. Después de la amplificación y filtrado, la señal analógica fue digitalizada por un convertidor analógico a digital, modulada en una portadora de alta frecuencia y transmitida por un transceptor de radio utilizando la banda ISM de 2.4-2.5 GHz. Se utilizó el mismo tipo de transceptor en el otro lado de la trayectoria de transmisión. Este segundo equipo estaba conectado a un ordenador mediante un puerto USB. La trayectoria de transmisión fue utilizada para la transmisión de datos bidireccional para enviar las señales grabadas extracelulares desde el animal al ordenador y viceversa los parámetros de control para la amplificación de la señal y el estímulo de la computadora al animal.

Usando la TWS, fue posible registrar la actividad cerebral de varias unidades y modificar el comportamiento del animal estimulando el colliculus inferior mientras que la rata se movía libremente en el campo Abrir con éxito. El transceptor se colocó a 5 metros del animal y fue conectado a la computadora por un USB puerto (véase figura 2). Una comparación de las cualidades de la señal grabada se rindió con el tethered y el sistema inalámbrico se demuestra en la figura 5. La TWS registra la actividad de varias unidades con una calidad de señal similar como un sistema de grabación por cable. El micro-estimulador es un verdadero estimulador inalámbrico que actualiza los parámetros de estimulación en tiempo real, es decir, la señal de estimulación, cuyos parámetros se definen con el software TWS se pasa al electrodo de estimulación conectados a la etapa principal en algunas milisegundos después de presionar el botón de estimulación. Por lo tanto, era posible cambiar los parámetros de estimulación sin sacar el animal de la jaula. Esta función tiene la ventaja que uno puede reducir al mínimo el tiempo para los experimentos de estimulación.

Un software TWS fue especialmente diseñado para permitir el control de todas las características del sistema inalámbrico (por ejemplo registro y estimulación) a través de la interfaz de usuario gráfica (figura 3 y figura 4). Para la estimulación de la micro, se utilizó una señal de estímulo que se ha desarrollado utilizando la interfaz gráfica de usuario del software TWS. El estimulador de la TWS fue utilizado en un modo de estimulación equilibrada de corriente constante de carga. El patrón de estimulación fue enviado inalámbricamente al estimulador de corriente constante integrado en la unidad inalámbrica de escenario principal. Se aplicó estimulación actual entre un microelectrodo de trabajo en blanco de interés (como por ejemplo el colículo inferior en el presente estudio) y un electrodo contador distante más grande que sirve como electrodo de tierra o referencia de la TWS. Dependiendo de la impedancia del electrodo de estimulación y tensión cumplimiento del estimulador de corriente constante, es posible utilizar una gama corriente de estimulación máxima de ±625 MA, aunque fue necesario un umbral actual mucho más bajo en los presentes experimentos. Aquí, carga bifásica equilibrada estimulación de corriente constante se utilizó con corrientes de pico hasta 300 mA. En caso de estimulación bifásica, el primer pulso se utiliza para provocar el efecto fisiológico y el segundo pulso generalmente invierte en procesos electroquímicos que ocurren durante el pulso de estimulación¹⁸. La etapa principal de TWS proporciona tiempo real patrones de estimulación establecido a través de la interfaz gráfica de usuario del software TWS (ver figura 4).

El software TWS se divide en tres secciones principales: (i) la ventana principal con controles para grabación y estimulación, una ventana de generador (ii) el estímulo con todas las opciones de configuración para los parámetros de la señal de estimulación y una ventana (iii) repetidor para reproducir la archivos de datos grabados. La ventana principal permite al usuario visualizar las señales registradas de hasta 4 canales de grabación, la ganancia para los canales y arranque/parada de grabación de las señales mostradas. Los datos de la señal se almacenan en un archivo en el disco duro del ordenador. La ruta del archivo se encuentra en el menú de configuración. Además de los parámetros de grabación, la ventana principal permite iniciar y detener el proceso de estimulación. La estimulación constante actual que atraviesa el electrodo de estimulación en el cerebro animal se muestra en tiempo real en la pantalla de la ventana principal. Los parámetros de la señal de estimulación están ajustados en la ventana de configuración de parámetros de estímulo. Es posible definir trenes de pulso de estimulación mono o bifásico y para todo estímulo utilizado parámetros de pulso como por ejemplo pulso, amplitud de pulso, el tiempo entre pulsos, etc. (para detalles vea figura 4). La función de pulso de estimulación que resulte de los valores de los parámetros previamente seleccionados se muestra en una pantalla gráfica en la ventana de generador de estimulación.

TWS se diseñó según aspectos de usabilidad. La usabilidad del software es un factor esencial para garantizar el avance suave de la experiencia de estimulación sin hilos/de la grabación y un entorno de trabajo seguro y cómodo. También ayuda a mejorar la reproducibilidad del experimento.

Datos de la grabación de una sola unidad y estimulación eléctrica

Actividad extracelular de varias unidades se registró sucesivamente en el colículo inferior desde el mismo electrodo implantado usando la TWS y un sistema de grabación atado convencional. La figura 5 muestra datos crudos representativos grabados con ambos sistemas mientras que el animal se estaba moviendo libremente en un campo abierto. Comparación directa de las señales sugiere similar espiga onda y ruido (figura 5A y 5B). Una demostración de la forma de espiga se representa en el A 'y B'.

Ya que las ratas no intente quitar la etapa principal de TWS después de la cirugía y durante los días posteriores, se suponía que no interfirió significativamente con sus movimientos y no causó malestar. Así, mediante el uso de la TWS, un problema común en las grabaciones atados de ratas fue evitado como retiro y masticación de los conectores y cables. De hecho, las ratas con la etapa principal de TWS fueron capaces de explorar el campo abierto y más laberinto (sEE 1 película) cruces normales expositoras, cría y preparación de comportamientos.

Además, los parámetros de estimulación utilizados con el convencional sistema tethered o TWS evocaban el mismo resultado conductual, aquí escapar de comportamiento. A partir de 100 mA, la amplitud actual de la estimulación aumentó gradualmente hasta que se alcanza el umbral de escape - mínima intensidad de la corriente produciendo correr o saltar - y el comportamiento del escape fue sacado. Los umbrales individuales de escape de 4 ratas fueron similares al usar ambos sistemas (figura 5).

Figura 1: Microelectrodo TWS unidad. (1) grabación solo electrodo/tetrodo, electrodo de estimulación (2), tablero de conexión de fibra (3) electrodo, cables de conexión (4) flexible, cable de tierra (5), tablero (6) conector, conector (7) hombre o mujer para sistema TWS (A); Unidad TWS microelectrodo conectado al preamplificador (8) y el soporte (9); (B) listo para acoplarse a un marco estereotáctica (C). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2 : Vista superior de la etapa principal de TWS monta módulo (A) sin fuente de alimentación del acumulador. Total dimensiones: altura 12.5 m, profundidad 24 mm (19,3 mm + 4,7 mm), anchura 22,1 mm, peso: vista inferior g. 5.96 (B) muestra el conector de la unidad de electrodo; fuente de alimentación del acumulador, de altura 9 mm, profundidad 26 mm, ancho 20 mm, peso 6 g (C); un resumen de los componentes TWS utilizados para esta prueba: (1) cabeza de la etapa unidad con acumulador montado sobre el cráneo de animal´s, unidad de (2) transceptor conectado a la computadora puerto USB, software (3) TWS (D); Foto de una rata libremente moviendo y mostrando el escenario principal de TWS conectado a la unidad de microelectrodo implantado previamente (E) y software TWS mostrando señales grabadas ejemplares (F). La etapa principal de TWS proporciona tiempo real patrones de estimulación configura en la interfaz gráfica de usuario del software TWS. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: TWS software interfaz gráfico, grabar pantalla. El rendimiento de la grabación de la TWS con un electrodo bipolar única de la grabación, implantado en el colículo inferior, se representa en la pantalla. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: interfaz gráfica de usuario TWS software. pantalla de estímulo (A) y especificaciones de parámetro del estímulo (B). Parámetros de la señal de la estimulación (C) como el ancho de pulso (PxW), amplitud de pulso (PxA), entre el retardo del pulso (IPD), tiempo entre pulsos (PDD), pulso por tren (PPT) y el tiempo entre trenes (OTC) son ajustables a través de la interfaz gráfica de usuario TWS software. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5 : Comparación cualitativa entre una señal multi-unit registrados extracelularmente con TWS (A) y una configuración de grabación por cable (B). Ambas grabaciones fueron obtenidas de la misma unidad de microelectrodo TWS (impedancia 0.5MOhm) implantada en el colículo inferior. La distancia axial entre los dos contactos de electrodos de grabación era aproximadamente de 400 μm. El ancho de banda de grabación del sistema por cable y el TWS eran idéntico (500 Hz... 5 kHz), las señales se muestrearon 40 kHz (sistema de cableado) y 32 kHz (TWS). Ambos sistemas registran actividad de varias unidades con una calidad de señal similar. No hay clara diferencia en las tarifas entre el TWS y grabaciones por cable de leña. Forma de onda del potencial de acción de la neurona de ambas grabaciones se muestran en el A 'y B'. Parámetros de estimulación similares eran necesarios para 4 ratas alcanzar el umbral de escape utilizando un sistema de anclado (TS) o TWS (C). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Pelicula 1: Una rata ejemplar exhibir comportamiento exploratorio normal durante el plus test de laberinto. La TWS permite al animal a entrar en los brazos abiertos y cerrados sin cables consiguiendo enredado para arriba en el aparato de prueba, sin embargo, es pequeño y suficientemente liviana para que sólo mínimamente interfiere en la tarea misma. Por favor haga clic aquí para ver este video. (Clic derecho para descargar)

Discusión

Aquí, se presentó un sistema inalámbrico de registro y estimulación ampliamente accesible para estudios electrofisiológicos y conductuales en animales en libre movimiento. La TWS ha sido validado en ensayos conductuales con el colliculus inferior como una estructura de modelo. El enfoque TWS tiene varias ventajas sobre los ya existentes. En primer lugar, el sistema utiliza una único portátil TWS-etapa equipada con un preamplificador y un acumulador, permitiendo grabaciones estables a largo plazo por hasta 1 h con la misma batería y distancia de operaciones inalámbricas de hasta 5 m. en segundo lugar, es la etapa principal de TWS ligero y compacto, pesa 12 g incluyendo la batería y fue desarrollado para evitar que la rata de eliminación de la etapa principal y masticar los cables. Fue bien tolerado por los animales desde ningún impacto en el repertorio conductual de animal´s con y sin la TWS se observó fase principal, haciendo que el sistema sea aplicable a un amplio conjunto de tareas conductuales. En tercer lugar, el sistema transmite en tiempo real. En cuarto lugar, a través de grabación bidireccional simultánea y estimulación de la actividad de los nervios, el sistema proporciona una herramienta sofisticada para evaluar las relaciones causales entre patrones de activación cerebral específico y el comportamiento, superando así las deficiencias de sistemas unidireccionales. Esta característica hace que el método particularmente valioso para el campo de la estimulación cerebral profunda, que requiere generalmente precisa evaluación, seguimiento y ajuste de parámetros de estimulación durante experimentos conductuales a largo plazo. Finalmente, se desarrolló una unidad microelectrodo crónico implantable con grabación integrada, estimulación y el electrodo de referencia que se puede implantar fácilmente en una cirugía estereotáctica convencional. Desde este punto de vista, la TWS es un sistema inalámbrico integrado que aumenta la reproducibilidad de los experimentos de estimulación y registro. La calidad de la grabación de la TWS fue demostrada para ser similares a la calidad de grabación con un sistema de grabación por cable disponibles en el mercado (ver figura 5).

Es ampliamente conocido que la estimulación eléctrica del colliculus inferior en la rata provoca claro comportamiento del escape caracterizado por correr o saltar, que imita las reacciones al miedo sacados por desafíos medioambientales^{11,12, 13}. Este comportamiento fue inducido en el presente estudio estimulando el colliculus inferior utilizando la TWS o el sistema atado tradicional. Para probar la eficacia de la estimulación de la TWS, se compararon los umbrales de escape – mínima intensidad de la corriente produciendo correr o saltar, usando ambos sistemas. Ratas con la etapa principal de TWS son capaces de correr rápido, saltar y salir a campo abierto, es decir, mostrar comportamiento del escape típico, con mayor libertad de movimiento. Lo importante, los umbrales de escape fueron similares en comparación con el sistema atado tradicional. Juntos, se utilizó un paradigma algo desafiante para poner a prueba la resistencia de la TWS, que domina de una manera sin complicaciones.

La TWS es también ideal para experimentos de estimulación eléctrica crónica desde la unidad de microelectrodo implantada permite el uso crónico. La TWS permite ajustar los parámetros actuales de estimulación muy precisamente en una manera de detectar con precisión la frecuencia y la cantidad de estimulación actual que es eficaz para provocar una respuesta conductual. Además, el mismo animal fue estimulado con el mismo umbral de corriente 3 días más tarde y fue sacada la misma respuesta conductual deseada. Esto sugiere que el tejido alrededor de la punta del electrodo de estimulación no fue dañado por la estimulación actual que generalmente requiere mayor estimulación actual amplitudes con estímulos repetidos con el fin de obtener la misma respuesta conductual.

Además, es posible reducir significativamente el tiempo experimental porque el TWS micro-estimulador actualiza los parámetros de estimulación en tiempo real cuando el experimentador los cambios en la interfaz gráfica de usuario. Otros estimuladores eléctricos¹⁹ utilizado para investigación preclínica necesidad ser reprogramado para la actualización de parámetros de estímulo. En esos casos, el dispositivo es programado por atar el animal mediante cable a una unidad de programación. Esto no es necesario cuando se utiliza la TWS.

Por último, la batería está fijada a la parte superior de la etapa principal de TWS y eléctricamente conectado al escenario principal a través de un conector de dos pines imán para fácil cambio de la batería. La ventaja es que durante el experimento es posible cambiar la batería sin desconectar la etapa principal de TWS de la unidad de electrodo implantado, que es mucho más cómoda para el animal. Durante el presente estudio se utilizó una batería cuyo tiempo de operación es sólo de 1 h. En caso de que la experimento dura más de 1 h, se recomienda tener una batería adicional cargada disponible. La TWS puede conectarse a pilas recargable con capacidad de (i) 230 mA para el tiempo de operación de 1 h o (ii) 450 mA aproximadamente tiempo de operación h 2,5. Ambos tipos de baterías pueden recargarse completamente en 15 minutos.

En Resumen, el presente estudio describe la operación de los TWS diseñado para la estimulación nerviosa y la grabación de comportarse libremente animales pequeños. Así se presenta un conjunto totalmente integrado de unidad implantable microelectrodo, escenario central, receptor y software. La calidad de la grabación sin hilos y la estimulación es similar a que del tethered grabando el sistema con la ventaja de ser más cómodo, ligero y seguro para el animal. Por lo tanto, TWS puede utilizarse para reemplazar el sistema tethered ya que no restringe la movilidad del animal y proporciona un método flexible para controlar la estimulación y registro neural bajo circunstancias donde otros enfoques sería difícil o imposible. Por lo tanto, TWS puede ser una herramienta importante para investigar la actividad como eléctrica en circuitos neurales definidos genera ciertas formas de comportamiento, una pregunta fundamental en Neurociencias.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Thomas Wireless System (TWS) versión 2.0	Thomas RECORDING GmbH	AN001165	El Thomas Wireless System (TWS) versión 2.0 es un sistema de telemetría multicanal portátil con ordenador portátil, un sistema operativo Microsoft Windows preinstalado y software de control TWS. El TWS incluye: pre&ndash de 4 canales de bajo ruido; y amplificador principal programable con ancho de banda fijo, constante de un solo canal; Estimulador de corriente para la aplicación de pulsos de corriente bifásicos, microestimulador programable por software, sistema de conectores implantable y una unidad básica de etapa de cabeza para el montaje en un animal. El sistema se entrega con un transceptor con conexión de puerto USB para computadoras portátiles o personales de escritorio, el software de control se ejecuta bajo el sistema operativo Windows de Microsoft. El sistema TWS se puede utilizar para la estimulación neuronal extracelular y el registro en animales pequeños que se comportan libremente (por ejemplo, ratas, conejillos de indias). Este sistema también se puede adaptar para ser utilizado en animales más grandes (por ejemplo, primates).
Software para Thomas Wireless System (TWS)	Thomas RECORDING GmbH	incluido en AN001165	El software para el sistema inalámbrico Thomas se ejecuta bajo el sistema operativo Microsoft Windows y proporciona la interfaz gráfica de usuario (GUI) para Thomas Wireless System (TWS). La GUI de TWS ofrece un control completo de las funciones de TWS: grabación de 4 canales y estimulación de 1 canal.
Tetrodo implantable para grabación (4 canales) y estimulación (monocanal)	Thomas RECORDING GmbH	AN001132	Tetrodo implantable para grabación (4 canales) y estimulación (monocanal) para uso con Thomas Wireless Systems (TWS). Especificaciones del tetrodo de grabación: material de fibra de tetrodo: fibra de tungsteno de platino aislada con vidrio de cuarzo, fibra de tetrodo diámetro exterior: 100 y micro; m, forma de la punta D, impedancia 0.5-0.8MOHm; Electrodo de referencia: forma de la punta: D; Impedancia: 300-500kOhm; Material: platino/tungsteno aislado con vidrio de cuarzo; Especificación del electrodo de estimulación: material de fibra: platino / iridio, diámetro: 125 y micro; m, laca aislada, forma de la punta : D, impedancia: < 10kOhm, las dimensiones del electrodo pueden ser especificadas por el usuario final
Microelectrodo implantable para registro (monocanal) y estimulación (monocanal)	Thomas RECORDING GmbH	AN001118	Microelectrodo implantable para registro (monocanal) y estimulación (monocanal) para uso con Thomas Wireless Systems (TWS). Especificaciones del electrodo de registro: material de la fibra del electrodo: fibra de tungsteno de platino aislada en vidrio de cuarzo, diámetro exterior de la fibra del electrodo: 80 y micro; m/250 y micro; m (especifique), forma de punta D, impedancia 0.5-0.8MOHm; Electrodo de referencia: forma de la punta: D; Impedancia. 300-500kOhm; Material: platino/tungsteno aislado con vidrio de cuarzo; Especificación del electrodo de estimulación: material de fibra: platino / iridio, diámetro: 125 y micro; m, laca aislada, forma de la punta : D, impedancia: < 10kOhm
Soporte para implantación de electrodos	Thomas RECORDING GmbH	AN000838	Varilla metálica curvada especial para la implantación de microelectrodos para portaelectrodos estándar. La varilla se utiliza para sujetar un electrodo implantable. El electrodo implantable se fija a la varilla con pegamento soluble en agua especial (AN001080) de Thomas RECORDING. (El soporte de electrodos no está incluido)
Fuente de alimentación del acumulador de repuesto para el sistema inalámbrico Thomas (3,7 V/230 mAh)	Thomas RECORDING GmbH	AN001208	Batería recargable de repuesto (acumulador) para el sistema inalámbrico Thomas con una capacidad de 230 mA para un tiempo de funcionamiento aproximado de 1 hora. (tamaño: 27 mm x 20 mm x 6 mm, peso aprox. 6 g)
Fuente de alimentación del acumulador de repuesto para el sistema inalámbrico Thomas (3,7 V/450 mAh)	Thomas RECORDING GmbH	AN001209	Batería recargable de repuesto (acumulador) para el sistema inalámbrico Thomas con una capacidad de 450 mA para más de 1 hora de funcionamiento. (tamaño: 48 mm x 30 mm x 4 mm, peso aprox. 11 g)
Cargador de acumulador para el Thomas Wireless System (TWS) acumulador recargable	Thomas RECORDING GmbH	AN001207	Cargador de red para el Thomas Wirless System (TWS) acumuladores recargables (AN001209 y AN001209)
Pegamento soluble en agua	Thomas RECORDING GmbH	AN001080	El pegamento para electrodos soluble en agua Thomas RECORDING es un producto especialmente seleccionado para su uso con microelectrodos implantables en la investigación neurocientífica. Sus propiedades únicas aseguran una conexión rígida entre el electrodo y el dispositivo de montaje, aunque es fácilmente extraíble con agua tibia. El pegamento para electrodos soluble en agua de Thomas RECORDING se puede utilizar de inmediato, sin necesidad de una preparación que requiera mucho tiempo. El pegamento de electrodos soluble en agua de Thomas RECORDING no es dañino para los seres humanos, los animales o el medio ambiente. Cantidad: 1 caja de 10 gramos
Preamplificador diferencial en miniatura	Thomas RECORDING GmbH	AN000329	El preamplificador diferencial en miniatura, modelo MDPA-2 es un preamplificador de entrada diferencial de 2 canales que está diseñado para grabaciones de bajo ruido a partir de tejido excitable. Está diseñado para el registro extracelular junto con la implantación de microelectrodos implantables para aplicaciones animales en movimiento libre con el Thomas Wireless System (TWS). El preamplificador diferencial en miniatura de 2 canales (MDPA-2) está conectado a los microelectrodos implantables para proporcionar la etapa inicial de amplificación de diez veces. Idealmente, los electrodos de platino/tungsteno con aislamiento de vidrio de cuarzo de Thomas RECORDING se utilizan para obtener resultados de grabación óptimos con altas amplitudes de señal y bajos niveles de ruido. El MDPA-2 tiene entradas adicionales de electrodo de referencia y tierra común.
Cable de conexión	Thomas RECORDING GmbH	AN000330	Cable de conexión para conectar el preamplificador diferencial Thomas Miniature (MDPA-2) a un amplificador principal y a una fuente de alimentación de acumulador.
Fuente de alimentación recargable para el preamplificador en miniatura	Thomas RECORDING GmbH	AN000328	Fuente de alimentación del acumulador recargable para el preamplificador diferencial en miniatura (MDPA-2).
Cargador de acumuladores (US)	Thomas RECORDING GmbH	AN000167	Cargador de acumuladores para el AN000328 de alimentación (US network power stream conenctor)
Cargador de acumuladores (EU)	Thomas RECORDING GmbH	AN000168	Cargador de acumuladores para el AN000328 de alimentación de alimentación (conector de toma de corriente de la UE)
Preamplificador diferencial/amplificador principal/filtro de paso de banda	Thomas RECORDING GmbH	AN000677	El amplificador principal de CA TREC (LabAmp-03) es un amplificador principal diferencial de un solo canal para aplicaciones neurofisiológicas (por ejemplo, registro extracelular con microelectrodos). Este instrumento está diseñado para trabajar con el preamplificador diferencial en miniatura, modelo MDPA-2. El canal único del LabAmp-03 contiene una etapa de amplificador diferencial de alta ganancia y bajo ruido seguida de filtros de baja y alta frecuencia. El amplificador tiene dos amplificadores de filtro diferentes, un filtro de actividad de una sola unidad (SUA) – y un amplificador de filtro de potencial de campo local (LFP), ambos están conectados en paralelo en la ruta de la señal. El modo de grabación ofrece dos niveles de ganancia de señal (x10, x100) en una primera etapa y 4 niveles adicionales (x5, x10, x25 y x50) en una etapa final del amplificador. Cada amplificador tiene diferentes características de paso de banda para actividad de una sola unidad (SUA) 500Hz… 20 kHz y potenciales de campo local (LFP) 0,1 Hz… 140Hz. Un monitor de audio y un discriminador de ventana están integrados en el dispositivo. El LabAmp-03 tiene un monitor de audio integrado con altavoz. Esta unidad proporciona reproducción de audio de señales electrofisiológicas. La unidad combina un amplificador de audio en un paquete compacto y resistente. Esto es especialmente adecuado para monitorear la activación neuronal y las contracciones musculares. La entrada del monitor de audio está conectada internamente a la salida del amplificador SUA-Filter. El LabAmp-03 se suministra con una fuente de alimentación externa para un rango de voltaje de operación de red de 100-240 V CA / 50-60 Hz.
Osciloscopio USB	Thomas RECORDING GmbH	AN001096	USB PC Oszilloskop, 2 Kanal. Este osciloscopio para PC de 2 canales es perfecto para el uso móvil en un ordenador portátil y la instalación permanente en armarios de control, equipos industriales y muchas otras aplicaciones en las que se requiere un osciloscopio pequeño, ligero y potente. Este osciloscopio está conectado a la salida de señal del amplificador principal para la visualización de la actividad extracelular registrada durante el encendido de los microelectrodos implantables para el Thomas Wireless System (TWS). El usuario puede adquirir los datos de medición a través de las diversas interfaces de datos directamente en el PC con el software de PC incluido.
Generador de estímulo	Los sistemas multicanal	STG3008-FA Generador de	estímulo para corriente (STG) y estimulación impulsada por voltaje cumplen tres funciones: estimulación impulsada por corriente, estimulación impulsada por voltaje, control y temporización. El STG está disponible con 2, 4 u 8 canales de salida independientes. Con unidades de aislamiento integradas para cada canal de salida, el STG es capaz de proporcionar cualquier forma de onda arbitraria.
Protector de tapón para el electrodo	Thomas RECORDING GmbH	AN001193	Tapón protector para unidad de electrodos implantable para el sistema inalámbrico Thomas Equipos
		quirúrgicos Tijeras, pinzas romas, espátulas, cortaúñas quirúrgicas, taladro dental y bastoncillos de algodón
Medicamentos y productos químicos			Isoflurano, xilocaína, clorhidrato de tramadol (Tramadol-CT, AbZ-Pharma GmbH, Ulm, Alemania), ungüento oftálmico dexpantenol (Bepanthen, Bayer AG, Leverkusen, Alemania), peróxido de hidrógeno al 3%, povidona yodada (Betaisodona, Mundipharma GmbH, Limburgo, Alemania) y etanol al 70%;
Material de fijación que incluye			tornillos de acero inoxidable (BN650 M1.2x5; 4,7 mm), resina acrílica (Paladur, Heraeus Holding GmbH, Hanau, Alemania), pegamento ultravioleta (Cyberbond U3300, Cyberbond Europe GmbH, Alemania) y protector de tapa (Thomas Recording GmbH, Giessen, Alemania);
Material			Guantes, almohadilla térmica, jeringas y solución salina fisiológica.
Instrumento estereotáxico para pequeños animales (SASI)	Thomas RECORDING GmbH	AN000287	El modelo debe elegirse de acuerdo con el animal (rata, conejillo de indias, monos, etc.) utilizado en el estudio
Cámara de video	EverFocus		EverFocus, modelo: EQ150
abierto			Hecho de acrílico transparente o gris, con forma redonda que mide 40x40x40cm
Laberinto			elevado plusRealizado en acrílico gris y constaba de dos brazos abiertos (50 cm de largo x 10 cm de ancho) y dos brazos cerrados (50 cm de largo x 10 cm de ancho, con paredes de 40 cm de altura) que se extendían desde una plataforma central elevada 50 cm sobre el suelo.