Artículo de método

Detección del potencial de membrana de las mitocondrias CLIC4 HN4 inducida por la caída de la célula Apoptosis In Vitro

DOI:

10.3791/56317

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17 de julio de 2018

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1School of Basic Medical Sciences, Anhui Medical University, 2Department of Orthopedics, Anhui Provincial Hospital, Anhui Medical University

En este artículo

Resumen

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Aquí presentamos un protocolo detallado para la aplicación de la rodamina 123 para identificar el potencial de la membrana mitocondrial (MMP) y estudiar CLIC4 caída inducida HN4 celular apoptosis in vitro. Bajo microscopio de fluorescencia común y el microscopio de la fluorescencia láser confocal, se registró el cambio en tiempo real de la MMP.

Resumen

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Agotamiento del potencial de membrana mitocondrial (MMP, ΔΨm) se considera el evento más temprano en la cascada apoptótica. Incluso se produce por delante de apoptotic nuclear características, incluyendo la condensación de la cromatina y la rotura de ADN. Una vez que los colapsos MMP, apoptosis celular iniciará irreversible. Una serie de colorantes catiónicos lipofílicos puede pasar a través de la membrana celular y agregado dentro de la matriz de la mitocondria y servir como marcador de fluorescencia para evaluar cambio MMP. Como uno de los seis miembros de Cl– familia canal intracelular (CLIC), CLIC4 participa en el proceso de apoptosis de la célula principalmente a través de la vía mitocondrial. Aquí describimos un protocolo detallado para medir MMP mediante monitoreo de la fluctuación de la fluorescencia de rodamina 123 (Rh123), a través del cual estudiamos apoptosis inducida por CLIC4 caída. Discutimos las ventajas y limitaciones de la aplicación de láser confocal de barrido y microscopio de fluorescencia normal en detalle y también Comparar con otros métodos.

Introducción

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Rh123 es un colorante catiónico de la fluorescencia, que sirve como un indicador de potencial transmembrana. Rh123 es capaz de penetrar la membrana celular y entrar en la matriz mitocondrial dependiendo de la diferencia de potencial dentro y fuera de la membrana1. Apoptosis lleva a daño de la integridad de la membrana mitocondrial. El poro de transición de permeabilidad de mitocondria (MPTP) abrirá y conducir al colapso de la MMP, que a su vez resulta en la liberación de Rh123 hacia el exterior de la mitocondria. Por último, se detectarán más fuerte señal de fluorescencia verde bajo microscopio de fluorescencia. Está bien documentado que el agotamiento de la RPP y la permeabilidad de la membrana elevada son signos tempranos de la célula apoptosis2. Por lo tanto, Rh123 puede aplicarse para la detección del cambio MMP y la aparición de apoptosis de las células.

Como el 6 º carcinoma más común en el mundo, cáncer de cabeza y cuello deteriora gravemente de salud3 de una persona. Aunque muchos enfoques fueron desarrollados en los últimos años, resultado clínico del tratamiento para pacientes con carcinoma de célula de squamous de la cabeza y cuello (HNSCC) es todavía no es lo ideal4. Explorar nuevos métodos terapéuticos puede mejorar el tratamiento de HNSCC5. Canales iónicos que implica numerosos procesos biológicos muestran un papel importante en el desarrollo de cánceres diferentes6. Participación total o parcial de los canales de Cl– están altamente implicados en varias propiedades de transformación neoplásica incluyendo migración activa, alta tasa de proliferación e invasividad. A la luz de esto, el CLIC, una familia de proteínas novela, ha sido incluido como una prometedora clase de dianas terapéuticas para el cáncer tratamiento6,7. Estudios recientes han revelado que los miembros de la familia CLIC incluyendo CLIC1, CLIC4 y CLIC5, localización a mitocondrial cardíaco y el nivel de (ROS) las especies reactivas del oxígeno es upregulated por CLIC5, indicando el papel funcional de mitocondrial ubicado Cl - canales en la respuesta apoptótica del8. CLIC4, uno de los miembros de la familia CLIC (también conocido como mtCLIC, P64H1 y RS43), ha sido más ampliamente estudiada por sus propiedades de regulación apoptótica en las células cancerosas y localización subcelular como Golgi, retículo endoplasmático y mitocondria en humanos queratinocitos7,9,10. El perfil de expresión de CLIC4 fue regulado por el factor de necrosis tumoral-α (TNF-α), el P53 y el estímulo externo. Sobreexpresión y downregulation de CLIC4 desencadenan una respuesta apoptótica principalmente a través de la vía mitocondrial junto con el desequilibrio de los miembros de la familia Bcl-2 activación de la cascada de caspasas y la liberación de citocromo C11, 12 , 13. por lo tanto, medida de MMP es crucial para explorar CLIC4 relacionados con apoptosis y Rh123 sirve como un indicador de fluorescencia ideal.

El presente estudio describe un protocolo detallado para la detección de MMP para estudiar CLIC4 precipitación inducida por la apoptosis en células de HN4. Rh123 se utiliza como sonda de fluorescencia para observar el cambio de la MMP. Bajo microscopio de fluorescencia común y el microscopio de la fluorescencia láser confocal, la fluctuación en tiempo real de la MMP puede resolverse. Discutimos las ventajas y limitaciones de la aplicación de láser confocal de barrido microscopio de fluorescencia en detalle y también Comparar con otros métodos. Este protocolo también se puede aplicar a otros estudios relacionados con la apoptosis.

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Protocolo

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1. cultura y transfección de la célula

  1. Cultivo de células
    Nota: HN4, una línea celular HNSCC, fue derivado de pacientes con HNSCC14.
    1. Células en cultivo HN4 en de Dulbecco modifican Eagle suplementado (DMEM, glucosa de 4.5 g/L) con 10% suero fetal bovino y antibióticos (100 U/mL de penicilina y 100 μg/mL estreptomicina). Incube las células a 37 ° C con 5% CO2.
  2. Transfección de la célula
    1. Un día antes de la transfección, la placa de 5 x 105 células en 2 mL/pozo del medio de cultivo sin antibióticos en placas de 6 pocillos.
    2. Diluir 100 pmol CLIC4 siRNA o SiRNA codificado en 250 μl de medios suero reducido, suavemente. Diluir 5 μl de reactivo de liposomas en 250 μl de medios suero reducido incubar por 5 min combinan el siRNA diluido con el reactivo de liposomas diluido, mezclar suavemente e incubar por 20 min a temperatura ambiente.
    3. Añadir la mezcla a cada uno que también contiene las células y el medio. Mezclar suavemente, meciendo la placa y hacia atrás. Incube las células a 37 ° C en un incubador de CO2 durante 24 h antes de proceder con el siguiente procedimiento de etiquetado Rh123. Reemplazar el medio de medio de cultivo normal 4 h después de transfección.

2. Rh123 etiquetado

Nota: Rh123 fue utilizado para medir la MMP en HN4 células1.

  1. Después del tratamiento de siRNA CLIC4 (sección 1), utilice HN4 células en placas de 6 pocillos para el siguiente tratamiento. La cantidad de células HN4 en cada bien es suficiente para repetir el experimento 10 veces en cubreobjetos.
  2. Utilice unas pinzas para poner cubreobjetos circulares en la parte inferior del nuevo pozo de 12 placas. El número de placas se establece según el diseño experimental (figura 1A).
  3. Colocar 150 μL de 100 μg/mL polylysine en el centro de cada cubreobjetos dentro de las placas de 12 pozos y espere 2 minutos presta atención a no poner polylysine fuera el cubreobjetos. Luego extraiga polylysine por pipeta cuidadosamente (figura 1B).
  4. Retire el medio de cultivo de las células HN4 dentro del plato y agregue tripsina de 0.25% de 1 mL para separar las células. Después de 6 minutos, añadir 2 mL medio de cultivo para la neutralización de la tripsina. Mezclar suavemente las células HN4 por pipeta 5 veces y semillas 2-6 х 104 células sobre cubreobjetos circular. Coloque en una incubadora a 37 ° C con 5% CO2 (figura 1C).
  5. Después de 8 h de incubación, incubar las células HN4 con 2 μmol/L Rh123 durante 40 min a 37 ° C. Mezclar suavemente la media hacia arriba y abajo varias veces para asegurar la distribución uniforme de Rh123 en el medio (figura 1D).
  6. Prepare suficiente solución salina normal (NPS); para hacer NPS (en mmol/L): NaCl 140, 5 KCl, 1 MgCl2, 1 CaCl2, glucosa 10 y 5 HEPES, pH 7,4). Precaliente a 37 ° C en un baño de agua.
  7. Utilice unas pinzas para quitar el cubreobjetos y lavar el resto líquido vía brevemente, colocar el cubreobjetos en el búfer de NPBS precalentado (figura 1E).
  8. Coloque el cubreobjetos en el fondo de la cámara de acero inoxidable de 500 μl (véase Tabla de materiales) con un fondo de cubreobjetos de vidrio reemplazable 25 mm sellado en lugar por un anillo. Fijar enroscando la tapa de la cámara (figura 1E).
  9. Añadir 450 μl precalentar el buffer de NPS a la cámara montada y poner el baño en el campo visual del microscopio de fluorescencia o de láser confocal de barrido microscopio de fluorescencia (figura 1E).

3. detección de la MMP

  1. Microscopio de fluorescencia común
    1. Encienda el microscopio de fluorescencia siguiendo las instrucciones del fabricante.
      Nota: Microscopio de fluorescencia común fue logrado con una mercurio lámpara fibra óptica fuente de luz, un filtro FITC para Rh123 (480/40 filtro de la excitación, 505 espejo dicroico LP y filtro de emisión 535/40) a temperatura ambiente. Objetivo 20 X se utiliza para realizar proyección de imagen de células vivas.
    2. Abra el software de sistema de proyección de imagen y seleccione el botón "Nuevo" de la barra de comandos para iniciar un nuevo experimento (figura 2A).
    3. Ajustar el campo de visión y el enfoque para encontrar la ubicación de las células en luz blanca.
    4. Apagar la luz y el botón para cerrar la luz blanca. Haga clic en el botón de "Enfoque" de la barra de comandos y seleccione "Empezar centrando" para activar la fluorescencia. Encontrar la ubicación de las células a través de microscopio con una excitación 507 de nm y de emisión de pase largo de 529 nm longitud de onda (Set antes del experimento). Ajuste el campo de visión y enfoque otra vez si es necesario (figura 2B).
    5. Seleccione un campo de visión sólo 20 a 30 células de HN4 separados. El cambio de la señal de fluorescencia intracelular para cada celda se registrarán con precisión.
    6. Una vez que se consigue un campo visual claro, haz clic en "Muy centrado" en la barra de enfoque. Haga clic en la "Acq uno" de la barra de comandos para la adquisición de un conjunto de imágenes. Haga clic en "Regiones" de la barra de comandos y haga clic en el botón "Aceptar" para editar regiones de medición.
      Nota: En la barra de editar región, formas diferentes de la región se pueden utilizar dependiendo el estudio.
    7. Para aplicar para las diferentes formas de células individuales, seleccione la herramienta "Trace región" círculo de la región de una sola célula y haga doble clic cuando haya terminado. Repita el procedimiento hasta que todas las células están en un círculo (figura 2C). Haga clic en "Done" y seleccione "Guardar imágenes" para encontrar la ubicación guardada.
    8. Haga clic en "Zeroclock"y rápidamente Presione F4 para iniciar el monitoreo del cambio de intensidad de fluorescencia. El tiempo real de registro cambio de intensidad de fluorescencia una vez cada 5 s durante 5 minutos (figura 2D).
    9. Cuando la línea de base estable, añadir 50 μl NPS mezclan con 0,5 μl de 100 mmol/L ATP a la cámara a través de la pipeta. Recuerde no tocar la cámara para evitar eliminar el campo visual (figura 2E).
      Nota: La imagen de fluorescencia se registrarán por 20 min y luego el experimento puede terminar mediante operación manual. La duración es habitualmente colocada por 20 min para observar todo el cambio de fluorescencia. Sin embargo, se aplica operación manual para detener la captura cuando factores inesperados influyen en la estabilidad de la curva o cuando todo el proceso toma menos de 20 minutos.
  2. Microscopio de la fluorescencia láser confocal
    1. Abra en el láser confocal de barrido microscopio de fluorescencia siguiendo las instrucciones del fabricante y el software incluido.
      Nota: Aquí, Rh123 fue excitado por un láser de argón de 488 nm y la señal emitida se registró sobre la gama de 545-700 nm a través de la aplicación del filtro TD488/543/633.
    2. Haga clic en "Objetivo" en el menú de "Adquirir" para seleccionar 63 X / 1.4 N.A. aceite objetivo. Observar a la muestra y encontrar un claro campo de visión en el campo de la luz.
    3. Pulse el botón de "TL/IL" para cambiar al modo de fluorescencia y seleccione los filtros de fluorescencia correcta para encontrar la ubicación de la celda en la oscuridad a través de microscopio. Empuje el "Disparador" para proteger a la pieza terminada la observación.
    4. Bajo el menú "Adquisición", ajuste el canal de pago adecuado y haga clic en "Obtener" para activar el camino óptico colocado (figura 3A). Haga clic en el menú de "Configuración" y elija "Laser" para determinar el tipo de láser necesarios. "Argón" se recomienda para este protocolo (figura 3B).
    5. Haga clic en "Live" para obtener la imagen en tiempo real y asegúrese de que el campo visual contiene sólo 20 a 30 células de HN4 separadas. El cambio de la señal de fluorescencia intracelular para cada celda se registrarán con precisión.
    6. Seleccione "xyt" en el modo de adquisición en el submenú de "Adquisición" del menú "Adquisición" (figura 3C). Set 5 s y 20 min de intervalo de tiempo y duración, respectivamente. Haga clic en"aplicar" cuando se colocan todos los parámetros.
    7. En el menú de "Cuantificar", utilice la herramienta "Dibujar polilínea" al círculo el área de grabación de cada célula. Seleccione "Perfil de línea" y seleccione "Start" para llevar a cabo la observación. Registrar el cambio en tiempo real de la intensidad de la fluorescencia durante 5 minutos (figura 3D - E).
    8. Cuando la línea de base estable, añadir 50 μl NPS mezclan con 0,5 μl de 100 mmol/L ATP a la cámara a través de la pipeta. Recuerde no tocar la cámara para evitar eliminar el campo visual.
      Nota: La imagen de fluorescencia se registrarán por 20 min y luego se completa el experimento.

4. estadístico análisis

  1. Microscopio de fluorescencia común
    1. Encienda el microscopio de fluorescencia habitualmente siguiendo el manual del operador. Abra el software de sistema de proyección de imagen y seleccione el botón "Abrir" en la barra de comandos para abrir un experimento guardado. Haga clic en "Regiones" de la 'barra' y haz clic en el botón "OK" para editar regiones de medición.
    2. Seleccione la herramienta de "Región del rastro" y la región de una sola célula del círculo y haga doble clic en finalizado. Repita el procedimiento hasta que todas las células han sido en un círculo. Haga clic en "Done" y seleccione el "F4: adelante" botón para obtener una traza que muestra la intensidad de la fluorescencia.
    3. Una vez terminado, haga clic en el botón de flecha hacia abajo situado en la esquina inferior derecha del gráfico y haga clic en "Mostrar gráfico de datos" (figura 2F). Haga clic en "Aceptar" dos veces y elija el botón "Datos de registro" para abrir la interfaz de software de procesamiento de datos. Encuentre que los registros de la fluctuación del tiempo real de la intensidad de la fluorescencia aparecen en la hoja de cálculo y haga clic en "Datos de registro" otra vez.
      Nota: Para cada célula, cambios en MMP fueron exhibidos como el cociente de la fluorescencia en relación con la intensidad antes de la aplicación de ATP o TG (F0/F1). Cada dato de la intensidad de la fluorescencia fueron la media de 20-30 células. Datos para Rh123 se presentan como media ± SE. resultados de los 2 grupos se analizaron por la prueba de dos colas independientes t y el valor de P < 0.05 se consideró como significación estadística. Software de análisis estadístico fue aplicado para realizar los análisis estadísticos en este experimento.
  2. Microscopio de la fluorescencia láser confocal
    1. Encienda el microscopio láser confocal y entra en el paquete de software siguiendo las instrucciones del fabricante.
    2. Seleccione el "Fuego" para abrir un experimento grabado.
    3. Seleccione la herramienta "Perfil de la pila" en el menú de "Cuantificar", elegir "todo en uno" de "Tablas de clasificación por canales y ROIs."
    4. Utilice la herramienta "Draw polygon" para las regiones de la célula de círculo para la observación.
    5. Seleccione el menú "Gráfico" y haga clic en el botón derecho del ratón y elija "Exportar a excel" para agregar los valores de intensidad fluorescente a una hoja de cálculo. El siguiente análisis es consistente con los microscopios de fluorescencia normal (figura 3F).

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Resultados

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En el presente estudio, se aplicó Rh123 para detectar la MMP. Inicialmente, las células HN4 fueron cultivadas para la fluorescencia siguiente experimentos de tinción. Pinzas se usaron para colocar cubreobjetos circulares en la parte inferior de las placas de 6 pocillos (figura 1A). El cubreobjetos se cubrieron con polylysine durante 5 minutos y luego se retira el polylysine mediante pipeta (figura 1B

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Discusión

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Está bien documentado que Cl− canales son esenciales para mantener la hemostasia del ambiente interno y desempeñan un papel importante en la proliferación celular y apoptosis15,16. Por lo tanto, entender la relación entre la intervención orientada a canales de iones y de la apoptosis es de gran necesidad e importancia para encontrar un mejor enfoque terapéutico para diversos tipos de cáncer17. Las mitocondrias mantienen el estad...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le rogamos gracias a Sr. Chao Fang para el cultivo celular. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación de Ciencias naturales de China (Grant no. 81570403, 81371284); Anhui Provincial Natural Science Foundation (Grant No. 1408085MH158); Destacado investigador joven de la Universidad médica de Anhui; Apoyo a programa de excelentes talentos jóvenes en las universidades de la provincia de Anhui.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
HNSCCATCCCRL-3241
PolylysineThermo Fisher ScientificP4981
Specific siRNA for human CLIC4BiomicsNM_013943(números de accesiones, NM_013943; correspondientes a la secuencia de ADNc
5-GCTGAAGGAGGAGGAGGACAAAGA-3) y siRNA revuelto (5 ACGCGUAACGGGGGAAUUU-3) de Biomics Company
Reactivo de transfección Lipofectamine 2000 Thermo Fisher ScientificL3000-015
Opti-MEM I Medio Sérico Reducido, GlutaMAXThermo Fisher Scientific51985-042
Rhodamine 123, FluoroPure gredeThermo Fisher ScientificR22420
Dulbecco' medio Eagle modificado (DMEM, 4,5 g/L de glucosa)Gibco11965-084
Suero fetal bovino, calificado, Australia OrigenGibco10099141
Solución de tripsina-EDTABeyotimeC0201
Antibiótico-Antimicótico, 100XGibco15240062
Microscopía confocal de barrido láserLeica Microsystems GmbHLEICA. Microscopio invertido SP5-DMI6000-DIC
Nikon Eclipse TE300NikonN/A
Metaflour, V7.5.0.0Universal Imaging CorporationN/A Conjunto
aplicaciones Leica, v2.6.0.7266Leica Microsystems GmbHN/A
Microsoft Office Excel 2007MicrosoftN/A
Sigma Plot 12.5Systat SoftwareN/A
Cámara de celda AttofluorThermo Fisher ScientificA7816
Se diseñaron y obtuvieron células de

Referencias

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